基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)參芪地黃湯治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要活性成分及潛在基因分析

林稱心，李光智

海南省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南?？?570203

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致患者視力下降，甚至失明，是糖尿病患者致殘的主要原因之一[1]。在中醫(yī)學(xué)理論里DR 屬于“消渴目病”范疇，是因素體陰虛，虛火旺盛，耗氣傷津致使目睛失養(yǎng)所引發(fā)的疾病[2]。所以治療上應(yīng)當(dāng)扶正固本、益氣養(yǎng)陰。參芪地黃湯就是基于這一治法開發(fā)而來。參芪地黃湯的前期臨床隨機(jī)對(duì)照研究表明，DR 患者規(guī)律服用該方12 周，能顯著降低眼底檢查評(píng)分[3]。然而，由于參芪地黃湯治療DR 的作用機(jī)制尚未明確，這也限制了該方的進(jìn)一步推廣。為初步探討參芪地黃湯治療DR 的機(jī)制，給進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室研究做好前期鋪墊。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析出了參芪地黃湯治療DR 的藥物-化合物-靶基因機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 參芪地黃湯主要活性成分和藥物作用靶基因的篩選

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索參芪地黃湯組成藥物：太子參、黃芪、熟地黃、山藥、枸杞子、山萸肉、澤瀉、丹皮、茯苓、決明子、甘草的所有活性成分?；钚猿煞趾Y選條件設(shè)置為口服利用度≥30% 和類藥性≥0.18[4]。此外，本研究還通過TCMSP 檢索出活性成分的靶基因。

1.2 DR 疾病基因的獲取以及交集基因的篩選

本研究通過基因卡數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中輸入關(guān)鍵詞：Diabetic Retinopathy，檢索DR 的疾病基因并建立數(shù)據(jù)集。然后將疾病基因與1.1 篩選出的藥物靶基因取交集，得到兩者的交集基因，并利用文氏圖展示。

1.3 交集基因中的核心基因篩選

STRING 數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)能夠通過人類已知的蛋白相互作用信息，預(yù)測(cè)出所檢索蛋白中的核心蛋白[5]?；谶@一點(diǎn)，本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫建立交集基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（proteinprotein interaction network, PPI）（參數(shù)設(shè)置為：a.物種限制為人類；b.隱藏游離點(diǎn)；c.設(shè)定置信度＞0.7；d.其他保持默認(rèn)設(shè)置），對(duì)交集基因進(jìn)行分析，獲取蛋白相互作用，并保存其TSV 格式文件，最后將TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.0 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，用于后續(xù)進(jìn)一步分析。

1.4 中藥名-活性成分-交集基因網(wǎng)絡(luò)的建立

為了篩選參芪地黃湯治療DR 的關(guān)鍵活性成分，本研究將1.1 和1.2 部分得到的中藥、中藥活性成分和交集基因?qū)隒ytoscape3.6.1 軟件建立藥物-活性成分-交集基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并利用該軟件中的CytoNCA 插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的相關(guān)拓?fù)鋮?shù)。

1.5 交集基因的細(xì)胞功能注釋分析與通路富集分析

為獲取交集基因的細(xì)胞功能注釋和信號(hào)通路富集分析結(jié)果，本研究最后再將1.2 獲取的交集基因?qū)隓AVID 在線工具（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 參芪地黃湯有效成分及藥物靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫本研究共檢索到179 種參芪地黃湯主要活性成分，并獲得這些活性成分作用的靶基因320 個(gè)。

2.2 疾病基因和交集基因的篩選結(jié)果

通過Gene cards 數(shù)據(jù)庫本研究收集到DR 的疾病基因3 834 個(gè)，與2.1 的藥物基因進(jìn)行交集分析后得到交集基因143 個(gè)。

2.3 核心基因的篩選結(jié)果

本研究將2.2 中獲得的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，建立PPI 互作網(wǎng)絡(luò)。隨后將獲得的數(shù)據(jù)錄入Cytoscape 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，得到143 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 873條邊。使用Cytoscape NCA 插件計(jì)算Betweenness unDir、Closeness unDir、Degree unDir 值，值越高說明該節(jié)點(diǎn)在PPI 網(wǎng)絡(luò)中越核心[4]。其中前5 個(gè)核心基因?yàn)榻z氨酸/蘇氨酸激酶1（protein kinase B, AKT1）、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNFα)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)。

2.4 中藥-活性成分-交集基因網(wǎng)絡(luò)

本研究利用Cytoscape 3.9.0 軟件，構(gòu)建了一個(gè)包含中藥名-活性成分-交集基因的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。通過對(duì)該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治觯l(fā)現(xiàn)度值最高的前五個(gè)活性成分分別是槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和異鼠李素。

2.5 細(xì)胞功能注釋及通路富集分析結(jié)果

在DAVID 平臺(tái)，本研究根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate, FDR）＜0.01 分別對(duì)143 個(gè)交集基因的細(xì)胞功能和通路富集情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：細(xì)胞功能共有976 種，其中涉及生物過程的有767種；涉及細(xì)胞組成的有81 條；涉及分子功能的有128 條。通路富集分析方面，本研究還找到了101條信號(hào)通路，根據(jù)FDR 由小到大排名前十的有癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物-受體信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、胰腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺癌、內(nèi)分泌耐藥、膀胱癌。根據(jù)FDR＜0.01 分別列出了前10 條GO 條目和KEGG 通路，見表1、表2。

表1 潛在基因的細(xì)胞功能注釋結(jié)果（FDR＜0.01）

表2 通路富集分析結(jié)果（FDR＜0.01）

3 討論

在本研究中，通過Cytoscape 3.9.0 軟件篩選出的參芪地黃湯治療DR 度值最高的前5 個(gè)活性成分為槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素。其中，槲皮素被發(fā)現(xiàn)可以對(duì)DR 模型小鼠的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，而且該研究還指出，這種作用是通過抑制TNF-α、IL-6 和IL-1β 產(chǎn)生的，這與本研究的研究結(jié)論基本一致，從側(cè)面證實(shí)了本次研究的可靠性[6]。山奈酚有研究證實(shí)靶向調(diào)控VEGF，抑制AKT1/外來信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 信號(hào)通路的激活從而對(duì)DR 產(chǎn)生治療作用[7]。異鼠李素也有研究發(fā)現(xiàn)可以通過抑制線粒體蛋白激酶/核因子-κB 信號(hào)通路，減輕DR 大鼠視網(wǎng)膜損傷及細(xì)胞凋亡[8]。而豆甾醇和β-谷甾醇對(duì)于DR 的干預(yù)作用，目前暫無相關(guān)研究報(bào)道，可以作為下一步的研究方向。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，本研究篩選出參芪地黃湯治療DR 的前5 個(gè)核心基因?yàn)锳KT1、TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF。

AKT1 屬于蛋白激酶B 家族，是磷脂酰肌醇3-激酶下游信號(hào)通路的主要效應(yīng)器之一，對(duì)調(diào)節(jié)糖脂代謝具有重要作用，根據(jù)其不同功能，AKT 還可細(xì)分為AKT1、AKT2 和AKT3 三個(gè)亞型。在這些亞型中，AKT1 在人體各類組織器官中表達(dá)廣泛[9]。

AKT1 通過與同源結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白和磷脂酰肌醇依賴激酶Ⅰ結(jié)合，并與磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸結(jié)合，從而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖原合成、糖異生和葡萄糖攝取[10]。這些功能使得AKT在細(xì)胞內(nèi)維持糖平衡方面扮演著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)者角色。所以AKT 對(duì)人體糖代謝有著重要影響，參芪地黃湯可能通過對(duì)該基因的調(diào)控，穩(wěn)定糖代謝，從而對(duì)DR 產(chǎn)生治療效果[11]。

最近的研究表明，炎癥反應(yīng)在DR 病程中扮演著重要角色，許多炎癥因子例如：TNF-α、IL-1β、IL-6 和VEGF 等都對(duì)DR 的發(fā)展起著促進(jìn)作用[12]。

TNF-α 是機(jī)體炎癥反應(yīng)的先導(dǎo)因子，一旦TNF-α 與其特異性受體結(jié)合，便能夠通過促進(jìn)其他炎癥因子的釋放，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程[13]。TNF-α 廣泛分布于視網(wǎng)膜組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活后會(huì)提高視網(wǎng)膜血管通透性，并加速血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管外基質(zhì)形成[14]。一份臨床隊(duì)列研究顯示，DR 患者的淚液中TNF-α 水平顯著超過健康人水平，并且TNF-α 水平與視網(wǎng)膜病變程度正相關(guān)[15]。

IL-1β 和IL-6 同屬于趨化因子家族。過度釋放的IL-1β 和IL-6 可能是視網(wǎng)膜疾病發(fā)展的一個(gè)重要潛在因素。據(jù)目前的報(bào)道，兩者可能通過以下幾種生物學(xué)機(jī)制對(duì)DR 產(chǎn)生影響：①促進(jìn)炎癥反應(yīng)，不少研究顯示IL-1β 和IL-6 會(huì)促進(jìn)其他炎癥因子的表達(dá)以及炎性細(xì)胞的募集，從而加重視網(wǎng)膜組織的炎性損傷[16]；②提高視網(wǎng)膜通透性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫。IL-1β 和IL-6 可以作用于多種細(xì)胞信號(hào)通路，從而降低緊密連接蛋白的表達(dá)以及減少血管緊張素水平，打破血管收縮平衡，從而造成視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜通透性增加[17]。

VEGF 是一種具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)DR 的影響主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：①能增加血管通透性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫[18]；②提高視網(wǎng)膜局部細(xì)胞間粘附分子和其它活性物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管生成[18]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，對(duì)參芪地黃湯治療DR 的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的研究，研究發(fā)現(xiàn)了槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素等活性成分以及AKT1、TNF-α、IL-1β、IL-6和VEGF 等藥物作用基因。這些活性成分和基因均有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道與DR 緊密相關(guān)，從側(cè)面證明了本次研究結(jié)果的可靠性。