柚皮苷通過減輕氧化應(yīng)激降低急性肺損傷小鼠內(nèi)皮通透性的研究

楊學(xué)敏，張歡歡，宋立強

中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710032

急性肺損傷是肺內(nèi)外因素致肺泡上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞損傷造成的急性低氧性呼吸衰竭以及彌漫性肺水腫，嚴重時發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征。病毒、細菌引發(fā)的肺炎，哮喘、急性期慢阻肺，或者休克、嚴重創(chuàng)傷等全身性疾病都有可能引發(fā)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征[1]，如爆發(fā)的流感病毒[2]以及影響全球的新型冠狀病毒肺炎[3]，均有大量患者進展為急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征。急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征是一種發(fā)病率高、病死率高，但無特效藥物的嚴重肺部疾病。

中醫(yī)藥在治療急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征有豐富的臨床經(jīng)驗以及理論基礎(chǔ)。中草藥和天然產(chǎn)物因具有抑制肺泡炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激以及保護血管內(nèi)皮等多重療效在亞洲尤其是中國備受關(guān)注[4]。柚皮苷是存在于葡萄柚等多種橘類植物的天然黃酮類化合物。大量臨床前研究表明，柚皮苷對肺部疾病具有鎮(zhèn)咳[5]、祛痰[6]、抗炎[7]、抗肺纖維化[8]等藥理作用，對其他疾病還能夠抗氧化應(yīng)激，保護血管內(nèi)皮屏障[9]。

本研究通過建立脂多糖（LPS）滴鼻誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠模型，并給予柚皮苷ig 治療，明確柚皮苷對急性肺損傷小鼠血管內(nèi)皮通透性及氣道炎癥的改善效果，拓展了柚皮苷防治急性肺損傷的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量22～25 g，由浙江省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。小鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心清潔級屏障系統(tǒng)，恒溫恒濕，所有飼養(yǎng)、實驗操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求，使用許可證號：SYXK（陜）2019-001，實驗倫理批準單位為空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心福利與倫理委員會，倫理批號：IACUC-20230096。

1.2 藥物及試劑

柚皮苷（貨號10236-47-2，質(zhì)量分數(shù)＞98%，上海阿拉丁生化科技有限公司）；醋酸地塞米松片（國藥準字H12020686，規(guī)格0.75 mg/片，天津天藥藥業(yè)股份有限公司）；LPS[貨號L2880-100MG，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]；白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（貨號70-EK201B、70-EK206、70-EK282，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；BCA 蛋白含量檢測試劑盒（貨號KGP902，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；微量丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA法）、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（WST-1 法）（貨號A003-2-2、A001-3-2，南京建成生物工程研究所）；總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 定量試劑（貨號19211ES60、11121ES60、11198ES08，上海翌圣生物科技有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

RC2 氣體麻醉系統(tǒng)（美國VETEQUIP 公司）；OPT Clairvivo 小動物近紅外深層熒光成像系統(tǒng)（日本島津制作所）；TEK8500 全自動五分類血液分析儀（江西特康科技有限公司）；MD-M4 酶標儀（MOLECULAR DEVICES）；5804R 臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf）；CFX96 熒光定量PCR 儀（Bio-Rad）。

1.4 動物分組及模型建立

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為對照組、模型組、地塞米松5 mg/kg 組及柚皮苷40、80、120 mg/kg 組，每組11 只小鼠。對照組小鼠正常飼養(yǎng)；模型組和給藥組小鼠麻醉后給予LPS 滴鼻，每只小鼠滴鼻50 μL（含600 μg LPS）。柚皮苷40、80、120 mg/kg 組和地塞米松5 mg/kg 組在LPS 滴鼻前分別ig 相應(yīng)劑量的柚皮苷和地塞米松，連續(xù)給藥5 d[10]，滴鼻后繼續(xù)ig 相應(yīng)劑量的柚皮苷和地塞米松，連續(xù)給藥2 d。對照組和模型組同時間ig 0.2 mL 生理鹽水。小鼠滴鼻2 d 后，每組各取8 只小鼠眼眶取血，結(jié)扎左肺，灌洗右肺獲得肺泡灌洗液（BALF），未沖洗的肺組織一部分固定于福爾馬林，一部分-80 ℃凍存。

1.5 肺組織病理分析

肺組織固定48 h 后，進行常規(guī)脫水、石蠟包埋并切成5 μm 厚度的切片。將切片溫水中展開并轉(zhuǎn)移到載玻片上進行脫蠟處理，依次進行蘇木精-伊紅（HE）染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片。將制好的HE 染色片，在顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理變化。

1.6 伊文思藍成像及滲出率計算

每組取3 只小鼠尾iv 5 mg/mL 伊文思藍溶液0.2 mL，30 min 后打開小鼠胸腹腔，暴露肺臟和心臟，利用微型泵沖洗小鼠全身血液。取出全部肺臟組織，生理鹽水清洗，并吸去表面所有液體，然后用小動物近紅外深層熒光成像系統(tǒng)檢測肺部伊文思藍熒光強度，設(shè)定參數(shù)為激發(fā)波長658 nm，發(fā)射波長719 nm，曝光時間100 ms。熒光強度由成像系統(tǒng)自帶軟件進行分析。成像后，將全部肺組織完全浸泡在甲酰胺中，37 ℃放置24 h 后在620 nm 測定吸光度（A）值。

1.7 炎癥指標檢測

將BALF 和室溫靜置0.5 h 以上的血液在1 500 r/min，4 ℃條件下離心10 min，BALF 上清和血清分別轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL 離心管。BALF 沉淀細胞用灌洗緩沖液重懸。BALF 上清用ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6、TNF-α 含量。BALF 重懸液和全血用血液分析儀檢測指標淋巴細胞（Lymph）、中性粒細胞（NEUT）、白細胞（WBC）、血小板數(shù)量。

1.8 氧化應(yīng)激指標檢測

將-80℃凍存的血清室溫解凍，ELISA 試劑盒檢測一氧化氮（NO）、MDA、SOD、內(nèi)皮素-1（ET-1）水平，操作均按照試劑盒說明書進行。

1.9 緊密連接蛋白和水通道蛋白表達檢測

取部分凍存肺組織樣品，按照RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時熒光定量PCR 檢測緊密連接蛋白-1（ZO-1）、密封蛋白（OCLN）、血管內(nèi)皮鈣黏素（VE-cadherin）和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）以及水通道蛋白AQP1和AQP5mRNA 表達水平，所用引物見表1。

表1 定量引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR assays

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism8.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以表示，各組之間兩兩比較用t檢驗和非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對急性肺損傷小鼠肺組織病理的影響

HE 染色結(jié)果顯示，對照組小鼠肺實質(zhì)部分肺泡完整，排布均勻，肺泡壁未見增厚，腔內(nèi)無分泌物，極少炎性細胞；與對照組相比，模型組小鼠多處肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，泡內(nèi)充滿液體和炎癥細胞，肺泡壁增厚，具有顯著的病理變化；柚皮苷各劑量組顯著改善了肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)病變及炎癥浸潤情況，尤其以柚皮苷120 mg/kg 組效果最佳，表明柚皮苷能夠減輕LPS 誘導(dǎo)的肺泡病理損傷，并且具有劑量相關(guān)性，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE 染色結(jié)果（×100）Fig.1 HE results of lung tissues in each group（×100）

2.2 柚皮苷對急性肺損傷小鼠肺泡-血管通透性的影響

肺組織伊文思藍成像結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組熒光值顯著升高；柚皮苷各劑量組能夠顯著降低伊文思藍熒光值，并具有濃度梯度相關(guān)性，見圖2。結(jié)果顯示，模型組伊文思藍滲出量顯著高于對照組（P＜0.05）；柚皮苷各劑量組能夠降低滲出量，且以柚皮苷120 mg/kg 組最顯著（P＜0.05），見圖3。

圖2 各組小鼠肺組織伊文思藍成像結(jié)果Fig.2 Evans Blue imaging results of lung tissue of mice in each group

圖3 各組小鼠肺組織伊文思藍滲出量（，n=3）Fig.3 Evans Blue exudation in lung tissue of mice in each group (,n=3)

如圖4 所示，與對照組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液總蛋白含量和PLT 數(shù)量顯著增加（P＜0.05），柚皮苷120 mg/kg 組總蛋白含量和PLT 數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，柚皮苷能夠顯著降低LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障高通透性。

圖4 各組小鼠BALF 中總蛋白含量和PLT 數(shù)量（，n=3）Fig.4 Total protein content and PLT quantity in BALF of mice in each group (,n=3)

2.3 柚皮苷對急性肺損傷小鼠氣道炎癥的影響

與對照組相比，模型組BALF中Lymph、NEUT、WBC 數(shù)量均顯著性增加（P＜0.05）；柚皮苷各劑量組能夠不同程度地顯著減少肺泡中炎癥細胞的數(shù)量，尤其是柚皮苷120 mg/kg 組小鼠各種炎癥細胞數(shù)量最少（P＜0.05）。ELISA 結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組BALF 的IL-1β、IL-6、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05）；而柚皮苷各劑量組均能夠顯著減少BALF 炎癥因子含量（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，柚皮苷能夠顯著降低LPS 誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)，見圖5。

圖5 各組小鼠BALF 炎癥細胞及炎癥因子變化（，n=8）Fig.5 Changes of BALF inflammatory cells and inflammatory factors in each group (,n=8)

2.4 柚皮苷對急性肺損傷小鼠血液細胞的影響

與對照組相比，模型組血液中的Lymph、NEUT、WBC、PLT 數(shù)量均顯著降低（P＜0.05）；柚皮苷120 mg/kg 組Lymph、NEUT、PLT 數(shù)量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，柚皮苷120 mg/kg 組能夠顯著改善LPS 誘導(dǎo)的血液細胞流失，見圖6。

圖6 各組小鼠血液炎癥細胞數(shù)變化（，n=8）Fig.6 Changes in the number of blood inflammatory cells of mice in each group (,n=8)

2.5 柚皮苷對急性肺損傷小鼠氧化應(yīng)激的影響

與對照組相比，模型組小鼠血清ET-1 和MDA顯著升高，NO 和SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；柚皮苷各劑量組血清ET-1 和MDA 有所下降，NO和SOD 有所升高，柚皮苷120 mg/kg 組的生化指標變化具有顯著性差異（P＜0.05），見圖7。

圖7 各組小鼠血清氧化應(yīng)激指標變化（，n=8）Fig.7 Changes of blood oxidative stress indexes in each group (,n=8)

2.6 柚皮苷對急性肺損傷小鼠內(nèi)皮細胞緊密連接及水通道的影響

與對照組相比，模型組小鼠VE-cadherin、βcatenin、ZO-1、OCLN、AQP1、AQP5mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05），而柚皮苷各劑量組能不同程度升高緊密連接蛋白和水通道蛋白mRNA表達水平（P＜0.05），尤其以柚皮苷120 mg/kg 組效果最明顯，見圖8。

圖8 各組小鼠肺組織緊密連接蛋白和水通道蛋白mRNA 表達變化（，n=8）Fig.8 Changes of mRNA expression of tight-junction protein and aquaporin in lung tissue of mice in each group (,n=8)

3 討論

急性呼吸窘迫綜合征是臨床上發(fā)病率和致死率較高的呼吸疾病，目前多采用氧療改善低氧狀態(tài)結(jié)合控制原發(fā)疾病的方法治療，但因其發(fā)病機理的復(fù)雜性，盡管針對低氧和炎癥開發(fā)的藥物種類眾多，仍沒有取得理想的治療效果。中草藥及其天然產(chǎn)物在治療急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中也發(fā)揮了重要作用[11]。柚皮苷是近年來研究較多的黃酮類化合物，已被證實對呼吸系統(tǒng)[12]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)[13]、骨再生[14]、代謝性疾病[15]具有顯著治療效果。值得注意的是，在肺部疾病的研究中，柚皮苷具有化痰止咳、減輕炎癥反應(yīng)以及抗氧化應(yīng)激的藥理作用[12]。Liu 等[16]發(fā)現(xiàn)柚皮苷通過核因子-κB（NF-κB）通路降低LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中總細胞、中性粒細胞數(shù)以及TNF-α 炎癥因子實現(xiàn)抗炎效果。本研究也證實了柚皮苷能夠顯著改善急性肺損傷小鼠模型彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，減少了肺泡及氣道內(nèi)炎癥細胞數(shù)量和炎癥因子含量，具有顯著的抗炎效果。

微血管內(nèi)皮細胞通透性增加，使得血管內(nèi)的各種炎癥細胞和炎癥因子擴散到肺泡，并參與其中的炎癥反應(yīng)，促進彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)積存大量富含蛋白的液體、沉積的膠原和各種炎癥細胞，包括血液來源的多核中性粒細胞、血細胞、血小板等[17]。本研究發(fā)現(xiàn)急性肺損傷模型小鼠肺組織滲入大量的伊文思藍染料，并且肺泡灌洗液中含有大量蛋白和血小板，表明LPS 能夠誘導(dǎo)小鼠肺組織肺泡-血管通透性增加。值得注意的是，急性肺損傷小鼠模型的肺泡內(nèi)炎癥細胞數(shù)量顯著升高，而血液內(nèi)炎癥細胞大量減少，驗證了急性肺損傷的肺泡-血管通透性增加將促使血液內(nèi)的炎癥細胞進入氣道和肺泡。柚皮苷不僅能夠減輕伊文思藍染料滲入肺組織，同時減少肺泡內(nèi)炎癥細胞、總蛋白含量，減緩血液內(nèi)炎癥細胞的極速流失，證實柚皮苷治療能夠顯著降低血管通透性。

血管內(nèi)皮通透性由內(nèi)皮細胞間緊密連接構(gòu)成的屏障系統(tǒng)以及內(nèi)皮細胞的滲透性所決定。內(nèi)皮屏障系統(tǒng)是由ZO-1、OCLN 構(gòu)成的緊密連接以及由VE-cadherin 和β-catenin 等蛋白構(gòu)成的黏合連接，最終這些蛋白聚合物再與細胞骨架蛋白結(jié)合[18]。水通道蛋白對肺泡-內(nèi)皮細胞的滲透性具有重要的維持作用，其中AQP1 表達于內(nèi)皮細胞，AQP5 表達與肺泡I 型上皮細胞，是調(diào)控肺泡-內(nèi)皮滲透性的重要參與者[19]。在急性肺損傷狀態(tài)下，活化的中性粒細胞（PMN）、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等釋放過量的活性氧（ROS）[20]，啟動鈣離子信號通路調(diào)控與肌動蛋白相連的VE-cadherin/catenin 緊密連接復(fù)合物，破壞內(nèi)皮細胞間連接[21]，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞間通透性增加。此外，急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征疾病狀態(tài)下水通道蛋白和離子通道蛋白表達顯著降低，致使肺泡-內(nèi)皮滲透性降低，肺泡內(nèi)大量的水分、離子、蛋白等無法無法排出，加劇急性肺損傷肺水腫等病理損傷[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導(dǎo)緊密連接蛋白和水通道蛋白表達水平降低，尤其是血管內(nèi)皮細胞特有的VE-cadherin[23]以及在肺血管內(nèi)皮細胞高表達的AQP1 蛋白表達顯著降低。于此同時，LPS 引發(fā)了血管內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，表現(xiàn)為細胞氧化損傷加重和過氧化物清除水平降低，氧化/還原失衡。柚皮苷顯著提高了SOD 含量，增加過氧化物清除效率，減少了MDA 含量，減輕內(nèi)皮細胞氧化損傷，升高了緊密連接蛋白表達，穩(wěn)定內(nèi)皮屏障系統(tǒng)，并增強水通道蛋白表達，減輕肺泡水腫。

柚皮苷作為多種中藥材的黃酮類藥效成分，對肺部疾病的藥效藥理有多篇臨床前報道，具有非常明確的抗炎、抗氧化作用。但柚皮苷在血管相關(guān)的疾病，包括心血管疾病、高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化、骨再生、糖尿病等的血管保護作用并未延伸到肺部疾病。急性肺損傷不僅氣管、肺泡、肺間質(zhì)發(fā)生病變，血管通透性也是病理進展的關(guān)鍵一環(huán)，因此本研究對柚皮苷降低急性肺損傷血管內(nèi)皮通透性方面的藥理作用探索具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突