基于多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA的臨床研究

劉娜 李倩 魯潔

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西 延安 716000)

有研究認(rèn)為,高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染通常和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系,絕大多數(shù)宮頸癌患者是由高危HPV的持續(xù)感染引起,故此,高危HPV持續(xù)感染成為宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的必要條件。但部分女性感染的HPV存在一過性,其中長時間持續(xù)感染率僅10%左右[1]。既往臨床認(rèn)為HPV DNA檢查存在一定應(yīng)用價值,但實(shí)際使用中發(fā)現(xiàn)其特異度較低,在臨床診斷中局限性較大,甚至增加誤診漏診風(fēng)險[2]。此外,高危HPV一旦感染宿主后,其自身病毒基因組通常整合至宿主基因組內(nèi),若HPV本身的核酸整合進(jìn)入宿主基因組,其轉(zhuǎn)錄水平隨之提升,說明宮頸組織出現(xiàn)異常,并逐漸惡化[3]。而HPV E6/E7 mRNA在病毒的活動程度和疾病的進(jìn)程中具有一定監(jiān)測作用,可達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的,并為宮頸癌篩查提供參考[4]。因此,本文研究基于多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測高危型人乳頭瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA的價值?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2022年1月至2022年7月我院進(jìn)行宮頸癌篩查的患者60例,年齡25～61歲,平均年齡(43.09±2.54)歲;體質(zhì)指數(shù)17～23 kg/m2,平均體質(zhì)指數(shù)(20.06±1.11)kg/m2;小學(xué)至初中18例,高中26例,大專至以上16例。納入標(biāo)準(zhǔn)[5]:患者及家屬均知情同意;均通過病理檢驗(yàn)確診;已婚或存在性生活史;意識清楚,有基本的聽說讀寫能力。排除標(biāo)準(zhǔn):有宮頸手術(shù)史或者子宮切除史;妊娠或者哺乳期女性;精神疾病、認(rèn)知障礙或者溝通障礙者;中途退出試驗(yàn)者。

1.2方法 收集患者宮頸分泌物標(biāo)本,置于2～8℃下保存,72h之內(nèi)檢測。(1)薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查:選擇ThinPrep 2 000制片系統(tǒng)對患者標(biāo)本進(jìn)行液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)處理,妥善固定并染色后實(shí)施鏡檢。將獲得的結(jié)果通過TBS系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞分類,鱗狀細(xì)胞包含:正常、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)、未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、腺癌(AC)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)。(2)病理學(xué)檢查:選擇陰道鏡進(jìn)行多點(diǎn)活檢,宮頸組織分類包含:正常或炎癥、異型上皮細(xì)胞限制于宮頸上皮的下1/3(CINⅠ)、異型上皮細(xì)胞累及宮頸上皮的下1/3～2/3(CINⅡ)、異型上皮細(xì)胞超出宮頸上皮全層的2/3或累及全層宮頸腺但未突破基底膜(CINⅢ)、浸潤癌。(3)制備HPV E6/E7 mRNA:參考國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)品制備及驗(yàn)證方式,并通過測序驗(yàn)證,其中PCR模板為14種高危HPV全基因組參考品。(4)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù):選擇轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)測定各個高危HPV E6/E7 mRNA,并遵照說明書要求進(jìn)行檢測。(5)多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù):選擇TIANamp Virus DNA/ RNA Kit將RNA進(jìn)行提取,并按說明書要求操作,通過DEPC水(50 μL)洗脫。將提取到的RNA和2×DNase Ⅰ buffer、DNase Ⅰ混合,37℃條件下30 min。此次反應(yīng)總體積40 μL,引物和探針信號分別是:16F,AAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAA;16P,CAAAGACATCTGGACAAAA;16R,GACCCCTTATATTATGGAATCTTTGC;18R,TGGCTTCACACTTACAACACATACA;18F,CCGACGAGCCGAACCA;18P,AACG TCACACAATGTT;31R,GGATGTGTCCGGTTCTGCTT;31F,CGACAGCTCAGATGAGGAGGAT;31P,TCATAGACAGTCCAGCTGG等。反應(yīng)條件:40℃條件下30 min,80℃條件下2 min,95℃條件下2 min,重復(fù)40次,最后在72℃時收集熒光信號,并將反應(yīng)于LightCycler 480 PCR 儀上進(jìn)行,按循環(huán)閾值(Ct)<38判定成標(biāo)本和內(nèi)參陽性的閾值,如若Ct>38即標(biāo)本不合格。(6)靈敏度及特異度:從HPV E6/E7 mRNA標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)提取RNA,并通過數(shù)字PCR進(jìn)行定量,按照檢測的拷貝數(shù)使用含有人基因組的TE溶液遵照十倍梯度進(jìn)行稀釋,各個梯度中選擇RNA(2μL)作為模板開展多重實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng),測定其靈敏度,同時各個梯度反復(fù)測定20次,若19次為陽性的濃度梯度即可成為檢出限。另外選擇 TIANamp Virus DNA/ RNA Kit提取大腸埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋體、金黃色葡萄球菌等,選擇2μL作為模板,開展多重實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng),測定其特異度。

1.3觀察指標(biāo) 比較薄層液基細(xì)胞學(xué)和病理學(xué)檢查結(jié)果,并觀察所有患者多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的檢測結(jié)果,計算其符合率、靈敏度及特異度。

2 結(jié) 果

2.1多重實(shí)時熒光定量PCR的靈敏度及特異度 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),HPV 16、18、31、33等九類型的最低檢測為10 copies/μL,但HPV 51、52、56、58等五類型最低檢測是100 copies/μL。另外通過多重實(shí)時熒光定量PCR檢測高危HPV E6/E7 mRNA和生殖道內(nèi)常見病原菌例如大腸埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋體、金黃色葡萄球菌等,其結(jié)果均顯示陰性,且檢測結(jié)果的特異性良好。

2.2所有患者的檢查結(jié)果分析 薄層液基細(xì)胞學(xué)的檢查結(jié)果與病理學(xué)檢查并無差別(P>0.05)。見表1。

表1 所有患者的檢查結(jié)果分析[n=60,n(%)]

2.3不同技術(shù)的檢測結(jié)果分析 多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的符合率91.67%(55/60),靈敏度83.33%(15/18),特異度95.24%(40/42)。見表2。

表2 不同技術(shù)的檢測結(jié)果分析

3 討 論

目前,臨床對于HPV E6/E7 mRNA的檢測方式較多,例如Hologic Gen-Probe的Aptima HPV Assay作為美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)測定高危HPV的方式,但其檢查設(shè)備通常呈現(xiàn)封閉式,在國內(nèi)的普及率較低[6-7]。而PRETECT HPV-Proofer可檢測的型別較少,僅可對五種高危HPV E6/E7 mRNA進(jìn)行檢測[8]。近些年,隨著醫(yī)療技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步,發(fā)現(xiàn)Kodia的高危HPV E6/E7mRNA定量檢測成為國內(nèi)批準(zhǔn)的產(chǎn)品,主要利用b-DNA 信號放大法,但操作方法較復(fù)雜,且檢測時間較長,直接限制其在臨床的應(yīng)用[9-10]。

本文則是基于多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA檢測,發(fā)現(xiàn)其不僅能夠檢測多達(dá)十幾種的高危HPV E6/E7 mRNA,同時操作較為簡便,明顯縮短檢查時間[11-12]。故此,本文比較基于多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV 16、18、31、33等九類型的最低檢測為10 copies/μL,但HPV 51、52、56、58等五類型最低檢測是100 copies/μL;另外通過多重實(shí)時熒光定量PCR檢測高危HPV E6/E7 mRNA和生殖道內(nèi)常見病原菌例如大腸埃希菌、取淋病奈瑟菌、梅毒螺旋體、金黃色葡萄球菌等,其結(jié)果均顯示陰性,且檢測結(jié)果的特異性良好;薄層液基細(xì)胞學(xué)的檢查結(jié)果與病理學(xué)檢查并無差別(P>0.05);多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的符合率91.67%(55/60),靈敏度83.33%(15/18),特異度95.24%(40/42),提示隨著細(xì)胞學(xué)病變程度的日益加重,高危HPV E6/E7 mRNA的檢出率也明顯增加,從而證實(shí)HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和宮頸病變的嚴(yán)重程度息息相關(guān)。

綜上所述,基于多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在HPV E6/E7 mRNA檢測中意義重大,存在較高的靈敏度及特異度,可成為宮頸病變篩查的主要方式。