內生真菌菌核生枝頂孢霉的分離鑒定及生物學特性研究

趙曉彤,張凌霄,王桂清

內生真菌菌核生枝頂孢霉的分離鑒定及生物學特性研究

趙曉彤,張凌霄,王桂清*

聊城大學 農(nóng)學與農(nóng)業(yè)工程學院, 山東 聊城 252000

為了明確1株來源于國槐枝干內生真菌的分類地位和生物學特性，采用組織和單孢分離法進行了分離純化，利用顯微鏡進行了形態(tài)鑒定，采用活體接種法進行了致病性鑒定，提取了基因組DNA，通過ITS和18S rDNA序列分析進行了分子生物學鑒定，通過十字交叉法和血球計數(shù)法分析了不同生態(tài)條件和營養(yǎng)條件下的生長發(fā)育狀況。結果表明，該真菌為無性型真菌菌核生枝頂孢霉，這是國內首次從國槐中獲得的枝頂孢屬非致病性內生真菌；該菌在PDA培養(yǎng)基、溫度25～30 °C、全光照和酵母浸膏為氮源條件下菌絲生長和產(chǎn)孢能力最優(yōu)，菌絲生長更適宜以麥芽糖為碳源的中性條件，而產(chǎn)孢更適宜以阿拉伯糖為碳源的偏酸性環(huán)境。該研究為進一步將該開發(fā)成新型綠色的微生物制劑、增產(chǎn)菌或生防載體菌奠定了理論基礎。

菌核生枝頂孢霉; 形態(tài)學鑒定; 分子生物學鑒定; 生物學特性

目前，在植物病蟲害防控過程中主要采用化學防治的措施?；瘜W防治雖然具有見效快，用量少，急救強等優(yōu)點，但化學農(nóng)藥不僅會污染環(huán)境（尤其土壤環(huán)境和地下水等）、破壞生態(tài)平衡，還會對植物產(chǎn)生危害、引起人畜中毒和病蟲害的抗藥性，殘留的毒性還會給動物和人類健康帶來極大風險，同時，化學農(nóng)藥生產(chǎn)過程中還存在碳排放問題。為了實現(xiàn)生態(tài)環(huán)境的好轉、綠色生產(chǎn)生活方式廣泛形成，在植物病蟲害防控過程中應優(yōu)先選擇綠色低碳環(huán)保、防治效果好、增強植物抗逆性的生物防治方法。植物內生菌因其與病原菌、害蟲相互競爭植物體內空間和營養(yǎng)，分泌抗生素、毒素等代謝物質，從而增強宿主抵御病害的能力、誘導植物產(chǎn)生抗性，現(xiàn)已成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥和生防增產(chǎn)菌劑[1]。研究結果表明，已發(fā)現(xiàn)的內生真菌超過100萬種[2]，其中枝頂孢屬包含數(shù)百種。spD212定殖在藥用植物三七中可以提高對根腐病的抵抗力，并促進植物生長和內源萘乙酸、茉莉酸的合成[3]，從葡萄中分離的枝頂孢霉可以抑制霜霉病菌[4]。在大田中枝頂孢霉CEF-193固體菌劑處理棉花植株，對棉花黃萎病菌的溫室防效可達52.7%[5]。

國槐Linn，豆科槐屬，即是一種重要的中藥，也是重要的觀賞植物[6]。本課題組在研究國槐根莖腐爛病的過程中，從國槐枝干中分離得到1株無致病性的內生真菌，通過初步檢測，了解到該內生菌對致病真菌具有抑菌活性。為了明確其種類和生長發(fā)育特性，本研究對其進行了形態(tài)學、致病性和分子生物學等方面的鑒定，并研究了營養(yǎng)和生態(tài)條件對其菌絲生長和孢子形成的影響，為進一步將該內生真菌開發(fā)成新型綠色的微生物制劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源國槐樣品于2021年春采自聊城市田莊市直苗圃，樹齡為二年生。

1.1.2 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PDB）、水-瓊脂培養(yǎng)基（WA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、改良沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂基（mSDA）、察氏培養(yǎng)基（CDA）和基礎固體培養(yǎng)基（BCM）[7]。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離與純化采用組織分離方法對國槐發(fā)病部位處進行切割分離[8]。用無菌水清洗樣品后，切成0.5×0.5 cm2塊，2.5 %的NaClO消毒10 min，無菌水洗滌，于PDA、25±1 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察。當可以在培養(yǎng)基上觀察到菌絲時，重新提取盡量邊緣的菌絲置于新鮮的PDA上繼續(xù)培養(yǎng)，3次重復，直到可以分離出單個菌落。采用單孢分離法對該菌進行純化。用無菌水制備孢子懸浮液，采用劃線法接種到WA培養(yǎng)基平板上，于25±1 ℃、L:D=12 h:12 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，3次重復，直到分離出單個純化的菌株，培養(yǎng)條件下同。純化后，將其接種到含PDA斜面試管中，并命名為CST，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)學鑒定將CST在PDA平板、25±1 ℃、L:D=12 h:12 h培養(yǎng)5～7 d后，進行肉眼觀察，使用BX51-Olympus生物顯微鏡進行顯微觀察，均拍照記錄。

1.2.3 致病性鑒定選取健康的國槐二年生幼苗，用針束在樹皮表面刺傷并放置CST菌餅（0.7 cm），將棉花打濕敷于表面進行保濕，設置正常植株作為對照，進行比較分析。

1.2.4 rDNA-ITS和18S鑒定采用CTAB法提取CST的DNA[9,10]，使用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGGGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-3'）進行ITS的PCR擴增。使用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'）和NS8（5'-TCCGCAGGTTCACCTACTACGGA-3'）進行18S rDNA序列擴增[11]，經(jīng)生工生物工程（上海）有限公司進行測序，利用NCBI網(wǎng)站與BLAST與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對。

1.2.5 生物學特性研究設置6種不同的培養(yǎng)條件（如表1），接種CST菌餅，7 d后測量菌落直徑和產(chǎn)孢量，3次重復。

表1 生物學特性試驗設置

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用MEGA 7.0構建真菌系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Microsoft Excel 2017和DPS 19.05對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[7,11]。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學分析

經(jīng)肉眼觀察，CST菌落為圓形，正面呈現(xiàn)白色，背面淡黃棕色，剛毛狀。經(jīng)Olympus BX51生物顯微鏡（Bar=20 μm）觀察，菌絲和分生孢子均無色、光滑且透明；菌絲具隔膜、樹枝狀、多直角分支，分生孢子梗直接從菌絲上長出；分生孢子多單生，兩端尖，擬卵形或短柱形，可聚成繩索狀的菌索或孢梗束（圖1）。

圖1 菌落特征和內生真菌菌絲體和分生孢子的顯微鏡觀察

注：菌落（1a），菌絲（1b）和分生孢子（1c和1d）。

Note: The colony (a), the hypha (b) and the spores (c and d) of the fungi.

2.2 致病性分析

接種CST的國槐幼苗部位無發(fā)病現(xiàn)象，生長狀況與CK組大致相同（圖2），表明該菌無致病性。

圖2 國槐致病現(xiàn)象

2.3 分子生物學分析

用真菌ITS擴增通用引物對菌株進行rDNA-ITS序列測定，并獲得有效序列（圖3a）。用特異性引物擴增18S rDNA，并對產(chǎn)物進行測序（圖3b）。在NCBI網(wǎng)站GenBank上進行Blast比對，結果顯示：ITS序列與ID為MT123047.1的序列表現(xiàn)出100 %的同源性，18S rDNA序列與ID為NG_062818.1的序列表現(xiàn)出100 %的同源性。根據(jù)結果，可以將CST真菌鑒定為菌核生枝頂孢霉（圖4）。

注：ITS（3a）和18S rDNA（3b）的電泳條帶。

Note: The electrophoretic band of ITS (3a) and 18S rDNA (3b).

2.4 生物學特性分析

2.4.1 溫度對枝頂孢霉的影響枝頂孢霉菌絲體生長的適宜溫度范圍為10～35 ℃。20 ℃、25 ℃和30 ℃時，菌落直徑均超過5 cm，其中以25 ℃時菌落性狀最優(yōu)良（5.76 cm），10 ℃、15 ℃和35 ℃時菌落直徑均不超過3.4 cm，5 ℃和40 ℃時菌絲幾乎無法生長，表明25 ℃是菌絲生長的最佳溫度，溫度過高或過低均不適宜菌絲生長。在5～40 ℃溫度范圍內該菌均可產(chǎn)孢，25～30 ℃時產(chǎn)孢量最高（4.86～5.04×107/皿），低于15 ℃高于35 ℃時孢子量均不超過1×107/皿，且5 ℃和40 ℃時的孢子量僅為30 ℃的0.9 %和0.5%，表明25～30 ℃是孢子產(chǎn)生的最佳溫度，溫度過高或過低均不適宜孢子的產(chǎn)生（圖5）。

圖 5 溫度對枝頂孢霉的影響

2.4.2 光照對枝頂孢霉的影響枝頂孢霉在供試3個不同的光照條件下生長狀況大致相同。在全光照條件下，菌絲生長最快（7.67 cm），產(chǎn)孢量也最高（7.2×107/皿）；全黑暗條件下，菌落優(yōu)良（7.63 cm），產(chǎn)孢量最?。?.44×107/皿），是前者的75.5%；光暗交替條件下，菌絲生長最慢（7.54 cm），產(chǎn)孢量與全黑暗時相當（5.64×107/皿）。表明，全光照條件最適宜菌絲的生長和產(chǎn)孢（圖6）。

圖 6 光照對枝頂孢霉的影響

2.4.3 pH對枝頂孢霉的影響枝頂孢霉生長對環(huán)境的酸堿性具有較寬的適應性，pH 4～12范圍內，菌落直徑均超過5.72 cm，其中pH=7和8時，菌落直徑最大，均大于6.6 cm，說明中性條件更適宜菌絲生長。環(huán)境的酸堿性對發(fā)育（產(chǎn)孢量）影響較大，當pH 4～12時，產(chǎn)孢量隨pH的增高呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，其中pH=6為拐點，此時，產(chǎn)孢量達到最大值（3×107/皿）；pH為4～5時，產(chǎn)孢量均超過2.5×107/皿；pH為7～12時，產(chǎn)孢量均低于2.75×107/皿，表明，偏酸性條件更適宜孢子形成。當pH=3時，由于酸性太強，培養(yǎng)基不凝固，菌絲和孢子也受影響（圖7）。

圖 7 pH對枝頂孢霉的影響

2.4.4 培養(yǎng)基對枝頂孢霉的影響枝頂孢霉在四種供試培養(yǎng)基上均可正常生長，其中在PDA和BCM上的菌絲生長較好，菌落直徑大于另外兩種培養(yǎng)基，以PDA為最佳，菌落直徑最大（6.49 cm）；在CDA上菌絲生長最慢，菌落僅為PDA、BCM的52.2%、54.8%。同時，PDA也最適宜該菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量高（3.24×107/皿），在BCM、CDA、mSDA上的產(chǎn)孢量分別為PDA的68.8%、43.5%、37%，以mSDA的產(chǎn)孢量最少（1.2×107/皿）。結果表明，PDA是菌絲生長和產(chǎn)孢的最適培養(yǎng)基（圖8）。

圖 8 培養(yǎng)基對枝頂孢霉的影響

2.4.5 碳源對枝頂孢霉的影響枝頂孢霉在添加碳源的培養(yǎng)基中生長發(fā)育狀況優(yōu)良，且對碳源的需求不嚴格，菌落直徑在3.05～5.16 cm之間。當以單糖（果糖、阿拉伯糖）和二糖（海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖）為碳源時，菌絲生長較好，菌落大于4.36 cm，無顯著差異，其中麥芽糖為最佳碳源，此時菌落最大（5.16 cm）；而以多糖（微晶纖維素、可溶性淀粉）為碳源時，菌落直徑僅為3 cm左右。碳源對該菌的產(chǎn)孢量影響較大，當以單糖和二糖為碳源時，產(chǎn)孢量超過3.72×107/皿，其中阿拉伯糖為最佳碳源，產(chǎn)孢量高（15.52×107/皿）；以麥芽糖為碳源時，產(chǎn)孢量也較多，為阿拉伯糖的54.6 %。當以可溶性淀粉、微晶纖維素等多糖為碳源時，該菌的產(chǎn)孢能力驟降，產(chǎn)孢量僅為阿拉伯糖時的6.3 %、0.4 %。此外，無碳條件下，該菌雖能生長，但菌絲稀薄，幾乎不產(chǎn)孢（圖9）。

圖 9 碳源對枝頂孢霉的影響

2.4.6 氮源對枝頂孢霉的影響相比于碳源，枝頂孢霉對氮源的要求較為嚴格。以有機氮（酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨）為氮源時，菌落直徑大于3.15 cm，產(chǎn)孢量大于4.2×107/皿，其中在以酵母浸膏為最佳氮源，此時菌絲生長最快（4.46 cm）、產(chǎn)孢量最大（13.6×107/皿）。以氨基酸態(tài)氮（甘氨酸）為氮源時，菌落較小（2.05 cm），產(chǎn)孢能力較為優(yōu)良（7.68×107/皿）。無機氮不太適應該菌的培養(yǎng)，其中在硝態(tài)氮（硝酸鈉）為氮源時，菌絲生長尚可（2.38 cm），但產(chǎn)孢能力極差；以銨態(tài)氮為氮源時，菌絲生長和孢子形成能力均極差，菌落小于0.77 cm，肉眼難以觀察到孢子。以酰胺態(tài)氮（尿素）為氮源時，由于其需要轉化為銨態(tài)氮才能被利用，因此該菌生長發(fā)育不理想，菌落直徑和產(chǎn)孢量極小，僅有0.97 cm和0.97×107/皿。同無碳源一樣，枝頂孢霉在以CDA為基礎的無氮源添加的培養(yǎng)基上，菌絲生長快，但非常稀薄，產(chǎn)孢量也極少（圖10）。

圖 10 氮源對枝頂孢霉的影響

3 討論與結論

本試驗從具有潰瘍病的國槐植株上分離到枝頂孢屬內生真菌——菌核生枝頂孢霉[11]。本試驗從6個不同的方面研究了枝頂孢霉的生物學特性，該菌對溫度、pH、光照強度和營養(yǎng)條件具有廣泛的適應性。該菌在PDA培養(yǎng)基、溫度25～30 °C、全光照和酵母浸膏為氮源條件下菌絲生長和產(chǎn)孢能力最優(yōu)，菌絲生長更適宜以麥芽糖為碳源的中性條件，而產(chǎn)孢更適宜以阿拉伯糖為碳源的偏酸性環(huán)境。

枝頂孢霉作為內生真菌，對植物生長和抗逆性具有多種有益功能，Llorens從沙融山羊草中分離出該菌，發(fā)現(xiàn)其可以誘導植物對干旱脅迫的抵抗力[12]，用枝頂孢霉處理的番茄植株在丁香假單胞菌感染時也表現(xiàn)出較輕的癥狀[13]，這表明枝頂孢霉在寄主植物中誘導調節(jié)植物防御相關元素以提高其對脅迫的抵抗力。經(jīng)枝頂孢霉CEF-193菌劑處理的棉花鈴重顯著增加6.7～8.4 %[5]。不同濃度的交枝頂孢發(fā)酵液均能降低番茄根結指數(shù)，對番茄根結線蟲的防效為70.3 %[14]，這表明枝頂孢對抑制植物病蟲害和改良作物方面也表現(xiàn)出良好的防治效果。

據(jù)研究結果表明，枝頂孢霉不僅存在于植物上，也能以其他生物為寄主。孟祥龍等[15]從河北省蘋果果實黑點病的病原菌中，分離鑒定出5個不同屬的真菌，其中之一為產(chǎn)菌核枝頂孢。研究發(fā)現(xiàn)，從一只未孵化的鴕鳥蛋[16]、西班牙的土壤[17]和海水[18]中均分離出了新的枝頂孢屬真菌。以上研究局限于枝頂孢屬真菌的發(fā)現(xiàn)，缺乏對其環(huán)境條件和營養(yǎng)條件的研究，因此，本研究從以上2個方面進行了討論和研究。

適宜的環(huán)境條件是真菌菌絲生長和孢子形成所必需的。溫度是影響酶反應速率的重要因素，溫度范圍應滿足真菌生長的要求。枝頂孢霉的可生長溫度范圍為10～35 ℃，25～30 ℃時菌落直徑和產(chǎn)孢量達到最大，此時為最適溫度范圍。極高或極低的溫度都不利于真菌的生長，這與多數(shù)真菌對溫度的要求一致[19]。真菌可以通過光敏感蛋白作為光感受器來感知光條件[20]，光是控制真菌生理和形態(tài)反應的關鍵，光照時間過長過短都不利于菌絲體生長發(fā)育[21]。枝頂孢霉在3種不同光照條件下，菌落直徑和產(chǎn)孢量大致相同，表明枝頂孢霉的生長不受光周期的影響，但全光照條件更適宜其生長發(fā)育。枝頂孢霉的生長發(fā)育對酸堿條件的適用性較廣，當pH為4～12的條件下均能正常生長，但產(chǎn)孢量對pH的要求較菌絲生長敏感。當pH值為3時，由于酸性太強，培養(yǎng)基不凝固，菌絲雖能生長，但不能形成菌落；當pH值高于7時，孢子產(chǎn)量驟降，表明高酸和高堿條件不利于真菌的生長，還影響了生物膜的通透性、結構穩(wěn)定性和各種酶活性。

營養(yǎng)供應是真菌增殖的最重要需求。適宜的培養(yǎng)基為真菌培養(yǎng)提供了營養(yǎng)條件，PDA是富含葡萄糖和優(yōu)質淀粉的培養(yǎng)基，提供了碳源、氮源、生長因子（維生素）和無機鹽等供真菌發(fā)育的優(yōu)質生長條件。枝頂孢霉以PDA為培養(yǎng)基時菌絲生長和產(chǎn)孢量最優(yōu)良，是其生長發(fā)育的最佳培養(yǎng)基，多數(shù)真菌人工培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基均為PDA[22]。真菌獲得碳源以產(chǎn)生其生長和繁殖的能量，碳源對于細胞構建和ATP的產(chǎn)生也是必不可少的，且不同的真菌具有不同的碳源選擇性。一些真菌可以使用單糖作為碳源，而一些真菌可以從寄主植物中獲得脂質作為碳源[23]。本試驗中，單糖和二糖為適宜碳源，麥芽糖和阿拉伯糖是菌絲生長和產(chǎn)孢的最佳碳源。除碳源外，氮源也是真菌生長所必需的營養(yǎng)，且真菌生長對氮源的需求往往比碳源更嚴格。氮是構成細胞的第二豐富的元素，是真菌生長發(fā)育的關鍵限制因素。氮源可以顯著影響真菌蛋白酶的產(chǎn)生[24]，里氏木霉的蛋白酶主要是由有機氮源誘導形成的[25]。枝頂孢霉偏好有機氮源，且酵母浸膏為最優(yōu)良氮源，表明有機氮源更有利于其生長發(fā)育。

本課題組進一步研究了枝頂孢霉代謝產(chǎn)物的抑菌活性、成分分析及作用機理等（另文發(fā)表），均表明枝頂孢霉是一種重要的生防真菌，在抑制植物病蟲害、誘導植物抗性和促進植物生長等方面發(fā)揮了重要的作用。本研究從營養(yǎng)和環(huán)境的方面對枝頂孢霉的生物學特性進行了研究，明確了其最佳生長條件，對了解其適應性和發(fā)酵生產(chǎn)要求具有重要意義，為探索枝頂孢霉在微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或生防載體菌等方面的具體應用提供了理論指導。

[1] Yan L, Zhu J, Zhao XX,. Beneficial effects of endophytic fungi colonization on plants [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019,103(8):3327-3340

[2] Jia M, Chen L, Xin HL,. A friendly relationship between endophytic fungi and medicinal plants: A systematic review [J]. Frontiers Microbiology, 2016,7:906

[3] Han L, Zhou X, Zhao YT,. Colonization of endophytesp. D212 inand rice mediated by auxin and Jasmonic Acid [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2020,62(9):1433-1451

[4] Piccolo SL, Alfonzo A, Giambra S,. Identification ofisolates from grapevines and evaluation of their antagonism towards[J]. Annals of Microbiology, 2015,65(4):2393-2403

[5] 張向月,趙麗紅,馮鴻杰,等.枝頂孢霉屬內生真菌CEF-193對棉花黃萎病的控制作用[J].中國棉花,2020,47(9):20-22

[6] Kite GC, Veitch NC, Boalch ME,. Flavonol tetraglycosides from fruits of(Leguminosae) and the authentication of Fructus Sophorae and Flos Sophorae [J]. Phytochemistry, 2009,70(6):785-794

[7] 馬迪.園林植物國槐潰瘍病致病真菌的生物學特性和致病酶活性的研究[D].聊城:聊城大學,2018

[8] 李健,高興祥,李美,等.紫花苜蓿內生解淀粉芽孢桿菌Ba09的分離及防效研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學,2020,52(8):124-127

[9] 王桂清,曾路,馬迪,等.國槐根莖腐爛病病原菌的形態(tài)與分子鑒定[J].東北林業(yè)大學學報,2017,45(5):106-110

[10] 劉姣姣,嚴哲偉,張義菊,等.一株沙福芽胞桿菌ZG6的篩選、鑒定及其對茶樹輪斑病的生防潛力研究[J].中國生物 防治學報,2023,39(1):212-220

[11] 劉南南.菌核生枝頂孢菌對園林植物病害致病真菌的抑制作用及活性成分分析[D].聊城:聊城大學,2020

[12] Llprens E, Sharon O, Camanes G,. Endophytes from wild cereals protect wheat plants from drought by alteration of physiological responses of the plants to water stress [J]. Environmental Microbiology, 2019,21(9):3299-3312

[13] Llorens E, Scalschi L, Sharon O,. Jasmonic Acid pathway is required in the resistance induced byin Tomato against[J]. Plant Science, 2022,318:111210

[14] 姚玉榮,李林,霍建飛,等.交枝頂孢發(fā)酵液對根結線蟲脅迫下番茄防御酶活性的影響[J].中國瓜菜,2020,33(10):59-63

[15] 孟祥龍,張祺,石朝陽,等.河北省蘋果果實黑點病的癥狀與病原研究初報[J].植物病理學報,2021,51(4):496-506

[16] Isaia MC, Gams WS, Cerruti S. Isolation offrom an Ostrich’s egg [J]. Avian Pathology, 2000,29:233-235

[17] Alejandra G, Josepa G, Josep C,. Two new species offrom Spanish soils [J]. Mycologia, 2012,104(6):1456-1465

[18] Dawoon C, Kyunghwa B, Seob BS,. Identification and characterization of a marine-derived chitinolytic fungus,sp.YS2-2 [J]. Journal of Microbiology, 2019,57(5):372-380

[19] Cruz DR, Leandro LFS, Munkvold GP. Effects of temperature and pH onand soybean seedling disease [J]. Plant Disease, 2019,103(12):3234-3243

[20] Idnurm A, Verma S, Corrochano LM. A glimpse into the basis of vision in the kingdom mycota [J]. Fungal Genetics and Biology, 2010,47(11):881-892

[21] Yu ZZ, Reinhard F. Light sensing and responses in fungi [J]. Nature Reviews Microbiology, 2019,17(1):25-36

[22] 佟昀錚,于匯琳,潘洪玉,等.玉米莖腐病生防菌哈茨木霉CCTH-2鑒定及其生物學特性[J].華北農(nóng)學報,2022,37(S1):309-317

[23] Luginbuehl LH, Menard GN, Kurup S,. Fatty Acids in arbuscular mycorrhizal fungi are synthesized by the host plant [J]. Science, 2017,356(6343):1175-1178

[24] Sun Y, Qian YC, Zhao JX,. Extracellular protease production regulated by nitrogen and carbon sources in[J]. Journal of Basic Microbiology, 2021,61(2):122-132

[25] Doris H, Karl H, Kathy S,. Formation of the extracellular proteases fromQM 9414 involved in cellulase degradation [J]. Journal of Biotechnology, 1990,16(3-4):187-198

Isolation Identification and Biological Characteristics of Endophytic Fungus

ZHAO Xiao-tong, ZHANG Ling-xiao, WANG Gui-qing*

252000,

In order to clarify the taxonomic status and biological characteristics of one endophytic fungus derived from the stem ofLinn, We used tissue and monospore isolation method for isolation and purification, morphological identification by microscope, pathogenicity dentified by living inoculation, genomic DNA extraction, TS and 18S rDNA sequence analysis for molecular biological identification, and clarified the taxonomic status and biological characteristics of an endophytic fungus derived from the stem ofLinn, and analyzed growth and development under different ecological and nutritional conditions by crossing method and blood cell counting method. The results showed that the fungus was, which was the first non-pathogenic endophytic fungus of the genusobtained fromLinn in China. This bacterium hyphae growth and spore production capacity were optimal under the conditions of PDA medium, temperature 25～30 °C, full light and yeast extract as nitrogen source; hyphae growth was more suitable for neutral conditions with maltose as carbon source while spore production was more suitable for acidic environment with arabinose as carbon source. This study laid the theoretical foundation for the further development of A.into a new type of green microbial preparation, proliferative bacteria or biocontrol vector bacteria.

; morphological identification; molecular biological identification; biological characteristics

S476.1

A

1000-2324(2023)05-0641-09

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.05.001

2023-01-04

2023-02-07

國家自然科學基金(32001929);山東省自然科學基金(ZR2020MC125);國家級大學生創(chuàng)新項目(202110447012)

趙曉彤(2000-),女,碩士研究生,主要從事園林植物種質資源創(chuàng)新與應用的研究. E-mail:2581146949@qq.com

Author for correspondence. E-mail:wangguiqing@lcu.edu.cn