高產(chǎn)9α-OH-AD偶發(fā)分枝桿菌的誘變選育及其轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

高華義,楊佳浩,何蔓,蘇振華,周海杰,申雁冰,王敏

高產(chǎn)9α-OH-AD偶發(fā)分枝桿菌的誘變選育及其轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

高華義,楊佳浩,何蔓,蘇振華,周海杰,申雁冰*,王敏*

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院, 天津 300457

偶發(fā)分枝桿菌（）作為重要的9-羥基雄甾-4-烯-3，17-二酮（9-OH-AD）生產(chǎn)菌株，在甾體藥物的生產(chǎn)中起著重要的作用。為了進(jìn)一步提高偶發(fā)分枝桿菌的9-OH-AD生產(chǎn)水平，對(duì)原始菌株進(jìn)行常壓室溫等離子體（ARTP）誘變處理。在最佳誘變處理時(shí)間（35 s）下，篩選得到一株高產(chǎn)9-OH-AD的誘變株AR-2。當(dāng)投加10 g/L植物甾醇時(shí)，轉(zhuǎn)化96 h，該菌株9-OH-AD摩爾生成率達(dá)87.6%，較原始菌株提高14.9%。進(jìn)一步，對(duì)AR-2進(jìn)行ARTP-LiCl復(fù)合誘變，確定最佳LiCl誘變濃度為3.5%，得到一株高產(chǎn)9-OH-AD的誘變菌株#91。當(dāng)RM-β-CD添加量與底物摩爾比為1:1，投加10 g/L植物甾醇時(shí)，該菌株9-OH-AD摩爾生成率達(dá)95.7%，較原始菌株提高34.9%，具有良好的應(yīng)用前景。

偶發(fā)分枝桿菌; 誘變選育; 誘變菌

9-羥基-4-雄甾烯-3,17-二酮（9-OH-AD )是生產(chǎn)9位上有鹵素的皮質(zhì)激素的重要前體，利用9-OH-AD可以合成氫化可的松、依普利酮、地塞米松、倍他米松、可的松、醋酸氟輕松、氟羥潑尼松龍等多種重要的甾體藥物，它們被廣泛用作抗腫瘤、抗炎、抗病毒和抗真菌藥物，具有重要的商業(yè)價(jià)值[1-3]。目前9-OH-AD的生產(chǎn)方法主要以微生物轉(zhuǎn)化法為主，以解決化學(xué)合成較難完成的C-9α位羥基的引入[4,5]。分枝桿菌，紅球菌和諾卡氏菌等可以使用甾醇作為唯一的碳源和能源的微生物，常用于生產(chǎn)9-OH-AD[3,6-8]。

但是，目前微生物選擇性側(cè)鏈降解植物甾醇（）制備9-OH-AD存在底物溶解度低、菌種退化，導(dǎo)致菌種轉(zhuǎn)化率低、轉(zhuǎn)化周期較長等問題[3]，因此提高菌株降解生產(chǎn)9-OH-AD的能力具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。誘變育種是利用合理有效的誘變方法及誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高突變頻率，再通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得優(yōu)質(zhì)菌株的育種方法[9]。常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種，可以通過產(chǎn)生的等離子流改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和通透性，并引起DNA損傷，使細(xì)菌，真菌，酵母和其他微生物發(fā)生突變。與其他傳統(tǒng)方法相比，ARTP具有突變速度快、操作方便等優(yōu)勢[9]。當(dāng)與其他突變方法結(jié)合使用時(shí)，其突變效率將顯著提高[10,11]。本研究以偶發(fā)分枝桿菌（）為研究對(duì)象，采用常壓室溫等離子體（ARTP）和ARTP-LiCl復(fù)合誘變技術(shù)，基于2,4-二硝基苯肼（DNPH）能與9-OH-AD發(fā)生顯色反應(yīng)的特性進(jìn)行誘變菌株的篩選[10]，以搖瓶轉(zhuǎn)化進(jìn)行復(fù)篩，篩選得到一株遺傳穩(wěn)定的高效9-OH-AD生產(chǎn)菌株，對(duì)提高9-OH-AD產(chǎn)量，促進(jìn)相關(guān)行業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株偶發(fā)分枝桿菌（）TCCC 111744，天津科技大學(xué)系統(tǒng)微生物與生物制造工程研究室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5.0，牛肉浸膏3.0，氯化鈉5.0，葡萄糖1.0，瓊脂20.0，pH6.8。滅菌條件121℃，20 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：磷酸氫二銨1.5，酵母粉9.0，甘油20.0，磷酸二氫鈉0.5，磷酸氫二鈉0.5，吐溫80 0.5，碳酸鈣10.0，pH調(diào)至7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：硫酸銨1.8，尿素0.3，磷酸二氫鈉0.8，磷酸氫二鈉0.7，吐溫80 0.2，葡萄糖9.0，PS適量，pH7.0。滅菌條件121 ℃，20 min。

1.1.3 主要試劑購自中糧天科生物工程（天津）有限公司，9-OH-AD購自Sigma Aldrich公司，甲基--環(huán)糊精購自廣州泰隆國際貿(mào)易有限公司；色譜純甲醇購自天津市康科德科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

ARTP誘變系統(tǒng)，北京思清源生物科技有限公司；Agilent 1260型HPLC儀，美國Agilent；Epoch2 微孔板分光光度計(jì)，美國BioTek。

1.3 方法

0為培養(yǎng)前發(fā)酵液體積（mL），V為每12 h取樣時(shí)發(fā)酵液體積（mL）。

1.3.2 菌懸液的制備0.5%吐溫80水溶液洗下新鮮偶發(fā)分枝桿菌斜面，調(diào)整OD600=1.2±0.2，以3%的接種量接種于容量為250 mL裝有50 mL種子培養(yǎng)液的搖瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（約22～24 h）。取適量菌液于無菌的2 mL EP管內(nèi)，9000 r/min離心2 min，將收集的菌體重新懸浮于吐溫80-生理鹽水的水溶液中，調(diào)整其菌液OD600=0.6～0.8，作為誘變時(shí)的菌懸液。

為未經(jīng)誘變處理活菌數(shù)，0為誘變處理活菌數(shù)。

1.3.4 ARTP與LiCl復(fù)合誘變[10]ARTP誘變完成后，向各裝有誘變后載片的EP管中加入1 mL 3～4%的LiCl溶液，37 ℃水浴處理30 min，間歇震蕩1 min，加1 mL 0.9%吐溫80-生理鹽水終止反應(yīng)。對(duì)復(fù)合誘變菌懸液進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋，分別取100 μL涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h。

1.3.5 誘變菌株的初篩及復(fù)篩挑取誘變后的單菌落，另取出發(fā)菌株作為對(duì)照，在24深孔板培養(yǎng)至OD600約為0.8，向孔板中加入2 g/L AD，轉(zhuǎn)化12 h后取0.5 mL樣品。每個(gè)樣品用2倍乙酸乙酯萃取，取25 μL萃取液加入至96孔板中，然后加入100 μL DNPH溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)[10]，選擇顏色淺的菌株進(jìn)行PS搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。

1.3.6 甾醇轉(zhuǎn)化與檢測[7]將步驟誘變培養(yǎng)得到的菌落接種于斜面培養(yǎng)基，用0.5%的吐溫80無菌水溶液洗下，調(diào)整OD600在1.0 ± 0.2左右。以3%的接種量接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL搖瓶中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（22～24 h），以8%接種量接種于50 mL發(fā)酵液的擋板瓶中，30 ℃，140 r/min，培養(yǎng)4 d，定時(shí)取樣萃取，使用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行定量分析。

9α-OH-AD為9-OH-AD濃度（g/L），C為濃度（g/L），M9α-OH-AD為9-OH-AD相對(duì)分子質(zhì)量，M為相對(duì)分子質(zhì)量。

C1為9-OH-AD在時(shí)間1時(shí)的濃度（g/L），C2為9-OH-AD在時(shí)間2時(shí)的濃度（g/L），Δ為1與2的時(shí)間差（h）。

1.3.7 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將復(fù)篩得到的高產(chǎn)菌株轉(zhuǎn)接斜面擴(kuò)大培養(yǎng)5次，每次采用1.3.6的方法對(duì)誘變獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，以獲得遺傳穩(wěn)定性較好的突變菌株。

1.3.8 偶發(fā)分枝桿菌誘變菌株轉(zhuǎn)化工藝的建立在獲得高產(chǎn)9-OH-AD誘變菌株的基礎(chǔ)上，使用最佳的促溶介質(zhì)RM--CD，建立高濃度底物的生物轉(zhuǎn)化工藝，以提高9-OH-AD的產(chǎn)量。將培養(yǎng)約22 h的種子培養(yǎng)液，按8%的接種量接種于含有不同量RM--CD的50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中(RM--CD與PS的摩爾比為0.25:1，0.5:1，1:1，1.5:1，2:1，3:1)，考察RM--CD添加量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。以同樣的方法，將種子液接種于含有不同PS投加量的50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(8 g/L，10 g/L，12 g/L，15 g/L，20 g/L)，考察PS添加量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用Excel和Origin 2021軟件處理，采用ANOVA分析組間差異顯著性，差異顯著性的水平設(shè)置為<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 24微孔板培養(yǎng)體系的確定

24微孔板培養(yǎng)是本研究篩選方法建立的基礎(chǔ)，菌種在24微孔板中的生長狀態(tài)會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)篩選的準(zhǔn)確性。如表1所示，24微孔板的裝液量越少，液體揮發(fā)越嚴(yán)重，當(dāng)微孔板裝液量在1.4 mL以下時(shí)，液體揮發(fā)率明顯高于24微孔板中的其它裝液量，且菌體幾乎不生長。當(dāng)裝液量為1.6 mL以上時(shí)，其液體揮發(fā)率明顯低于搖瓶，裝液量為2.0 mL的揮發(fā)率較小且菌體生長狀態(tài)良好，為高效且有利于篩選工作的進(jìn)行，所以選擇24微孔板的最佳裝液量為2.0 mL。

2.2 高產(chǎn)9α-OH-AD偶發(fā)分枝桿菌誘變選育

2.2.1 ARTP誘變時(shí)間的確定為確定ARTP對(duì)偶發(fā)分枝桿菌出發(fā)菌株的誘變作用條件，測定了ARTP作用不同時(shí)間對(duì)出發(fā)菌株的致死率，其致死率曲線如圖1 (a)所示。隨著誘變時(shí)間的延長，菌落數(shù)逐漸減少，出發(fā)菌株的誘變致死率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。在誘變時(shí)間為25 s、35 s和60 s時(shí)致死率分別為77.8%、89.3%和97.4%。近年來采用ARTP誘變多選擇致死率在85%～95%范圍內(nèi)的對(duì)應(yīng)時(shí)間，此時(shí)正突變率更高，所以本實(shí)驗(yàn)選擇的ARTP誘變時(shí)間為35 s～50 s。

表 1 24深孔板不同裝液量下的液體揮發(fā)率及菌種生長情況

注：N表示搖瓶裝液量的體積。不同小寫字母表示在0.05的顯著水平。

Note: N denotes the volume of the shake bottle filled with liquid.The different small letters showed the significant levels at 0.05.

圖 1 ARTP誘變菌株的獲得

(a) ARTP誘變致死率曲線ARTP mutagenesis lethality curve；(b) ARTP誘變菌株轉(zhuǎn)化率Transformation rate of ARTP mutagenized strains

注：不同小寫字母表示在0.05的顯著水平。

Note: The different small letters showed the significant levels at 0.05.

2.2.2 ARTP誘變菌株的獲得TCCC 111744作為出發(fā)菌株，經(jīng)ARTP分別誘變處理35 s、40 s、50 s，得到278株、200株、176株菌株。將誘變處理獲得的菌株進(jìn)行DNPH顯色反應(yīng)篩選。共有64株菌株的產(chǎn)物與顯色液生成明顯的磚紅色沉淀，從初篩菌株中選擇顏色最深的6株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵性能驗(yàn)證，如圖1 (b)所示，分別編號(hào)為AR-1、AR-2、AR-3、AR-4、AR-5、AR-6，其9-OH-AD的摩爾轉(zhuǎn)化率分別為82.8%、87.6%、80.1%、84.6%、86.5%、79.6%。其中，AR-2產(chǎn)物摩爾轉(zhuǎn)化率較出發(fā)菌株（76.1%）提高了15.1%。

2.2.3 LiCl添加濃度的確定以ARTP誘變獲得產(chǎn)量積累量較高的AR-2作為LiCl誘變的出發(fā)菌株，測定了不同LiCl濃度對(duì)菌株致死率的影響，如圖2 (a)所示。結(jié)果表明，隨著LiCl濃度的逐漸增加，致死率增高。當(dāng)LiCl濃度低于3%時(shí)，誘變致死率較小，LiCl濃度為3.5%時(shí)，致死率達(dá)90.8%。一般LiCl誘變選取致死率90%效果較佳，所以確定LiCl的最佳使用濃度為3.5%進(jìn)行復(fù)合誘變。

2.2.4 ARTP-LiCl誘變菌株的獲得以ARTP誘變時(shí)間35 s，LiCl誘變濃度3.5%對(duì)AR-2進(jìn)行復(fù)合誘變處理，經(jīng)初篩和復(fù)篩得到13株轉(zhuǎn)化效率較高的誘變菌株，對(duì)13株誘變菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化搖瓶復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。搖瓶復(fù)篩投加PS濃度10 g/L，促溶介質(zhì)為RM--CD，轉(zhuǎn)化時(shí)間96 h。如圖2 (b)所示，13株誘變菌株較出發(fā)菌株AR-2相比，其中有4株誘變菌株9α-OH-AD的積累量有不同程度的增加，分別為#91、#107、#111、#140，9α-OH-AD摩爾轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到95.7%、89.8%、89.5%、94.5%。結(jié)果表明ARTP-LiCl誘變選育是提高PS生物轉(zhuǎn)化生成重要藥物中間體轉(zhuǎn)化效率的有效方法。

為詳細(xì)的了解誘變菌株的發(fā)酵性能，對(duì)搖瓶復(fù)篩獲得的9-OH-AD積累量較多的#91誘變菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化過程的測定，結(jié)果如圖2 (c)所示，誘變菌株與出發(fā)菌株在48 h前，產(chǎn)物的積累量和積累速率相當(dāng)，但在轉(zhuǎn)化48-72 h，誘變菌株迅速生成產(chǎn)物9-OH-AD，產(chǎn)物生成速率達(dá)0.09 g/(L·h)，較出發(fā)菌株AR-2生成速率0.06 g/(L·h)提高61.7%，較出最初的初發(fā)菌株提高212%，表明誘變菌株比出發(fā)菌株具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化性能。

圖 2 ARTP-LiCl復(fù)合誘變菌株的獲得

(a) LiCl誘變致死率曲線LiCl mutagenicity lethality curve；(b) ARTP-LiCl誘變菌株轉(zhuǎn)化率Transformation rate of ARTP-LiCl mutagenic strain；(c) 優(yōu)勢誘變菌株轉(zhuǎn)化過程曲線Transformation process curve of dominant mutagenic strain.

注：不同小寫字母表示在0.05的顯著水平。

Note: The different small letters showed the significant levels at 0.05.

為了驗(yàn)證誘變獲得的菌株遺傳穩(wěn)定性和高產(chǎn)性，對(duì)ARTP-LiCl復(fù)合誘變獲得的#91在瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，每一代按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并利用HPLC測定其9-OH-AD的濃度并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如表2所示，該菌株在5次傳代培養(yǎng)中積累9-OH-AD 能力基本保持穩(wěn)定，說明ARTP-LiCl復(fù)合誘變篩選獲得的菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表 2 不同傳代次數(shù)ARTP-LiCl復(fù)合誘變菌株9α-OH-AD積累穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

注：不同小寫字母表示在0.05的顯著水平。

Note: The different small letters showed the significant levels at 0.05.

2.3 誘變菌株轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

2.3.1 甲基-β-環(huán)糊精添加量對(duì)誘變菌株底物轉(zhuǎn)化的影響屬于疏水性化合物，由于其在水中的溶解度較低的原因，嚴(yán)重影響了菌種的轉(zhuǎn)化效率。RM--CD可以有效地提高疏水性甾體化合物在水相中的溶解度，促進(jìn)底物進(jìn)入微生物細(xì)胞以利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行，進(jìn)而提高底物的轉(zhuǎn)化率。探究了RM--CD的添加量對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，其中，RM--CD的添加量與投加量的摩爾比分別為0.25:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1，的濃度為10 g/L。

圖 3 誘變菌株轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

(a) RM--CD添加量對(duì)9-OH-AD轉(zhuǎn)化率的影響 Effect of RM--CD addition on the conversion rate of 9-OH-AD；(b) 底物濃度對(duì)9-OH-AD轉(zhuǎn)化率的影響 Effect of substrate concentration on the conversion rate of 9-OH-AD.

注：不同小寫字母表示在0.05的顯著水平。

Note: The different small letters showed the significant levels at 0.05.

由圖3(a)可知，隨著RM--CD的添加量與PS摩爾比的增加，9α-OH-AD摩爾轉(zhuǎn)化率也隨之增加。當(dāng)(RM--CD)()達(dá)到1:1時(shí)，9-OH-AD摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)95.7%，繼續(xù)增加RM--CD的添加量，9-OH-AD摩爾轉(zhuǎn)化率并未提高，表明(RM--CD):()為1:1時(shí)為RM--CD的最適添加量。

2.3.2 底物投料量對(duì)誘變菌株底物轉(zhuǎn)化的影響 為了確定誘變菌株的轉(zhuǎn)化能力，研究了底物投加量對(duì)誘變菌株#91轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖3 (b)所示。

由圖3 (b)可知，高底物濃度顯著抑制了菌株的轉(zhuǎn)化能力，8 g/L，10 g/L和12 g/L的添加量，在72 h轉(zhuǎn)化基本完成，9-OH-AD的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大。當(dāng)?shù)孜餄舛冗M(jìn)一步增加到15 g/L和20 g/L，在轉(zhuǎn)化48 h時(shí)9-OH-AD的摩爾轉(zhuǎn)化率明顯下降，僅為48.2%和35.3%，轉(zhuǎn)化速率也明顯下降，分別為0.10 g/(L·h)和0.06 g/(L·h)。在轉(zhuǎn)化96 h時(shí)，9-OH-AD的摩爾轉(zhuǎn)化率分別達(dá)88.3%和83.2%，說明誘變菌株對(duì)高濃度的PS具有良好的轉(zhuǎn)化能力。

3 結(jié)果與討論

9α-OH-AD是一種重要的甾體藥物中間體，目前已有多種方法如誘變選育，基因工程改造，轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化等用于9α-OH-AD生產(chǎn)菌株，以提高其生產(chǎn)效率[2-5]。誘變育種是一種高效篩選優(yōu)良菌株的方法，但是由于底物PS和產(chǎn)物9α-OH-AD結(jié)構(gòu)的特殊性，其檢測方法主要依賴于色譜法，為了提高誘變育種的效率，高效的檢測方法是必不可少的，因此本研究結(jié)合產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特性，選用了基于微孔板的DNPH篩選方法[10]，進(jìn)一步提高了菌株的篩選效率。

利用24微孔板結(jié)合DNPH快速篩選方法，經(jīng)過ARTP和ARTP-LiCl復(fù)合誘變得到一株轉(zhuǎn)化率較高的誘變菌株#91，10 g/L的投料濃度下轉(zhuǎn)化72 h，9-OH-AD的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)95.7%，較出發(fā)菌株相比提高34.9%，轉(zhuǎn)化時(shí)間縮短24 h，經(jīng)連續(xù)傳代5次，誘變菌株遺傳穩(wěn)定性良好。優(yōu)化RM--CD的添加量與摩爾比為1:1，投加15 g/L的，轉(zhuǎn)化96 h時(shí)，9-OH-AD的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)88.2%，投加20 g/L的，9-OH-AD的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)83.2%，結(jié)果表明經(jīng)誘變獲得的菌株明顯提高了底物的投料量。與之前的研究相比該菌株在更高的底物濃度下，仍能達(dá)到83.3%的摩爾轉(zhuǎn)化率，遠(yuǎn)高于馬洋等[5]僅通過ARTP誘變篩選得到的誘變菌株的轉(zhuǎn)化效率。本研究獲得的#91，其9-OH-AD摩爾轉(zhuǎn)化率優(yōu)于已報(bào)道水平，該菌株具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。后續(xù)可以通過比較基因組學(xué)探究原始菌株與突變菌株的基因組差異，明確轉(zhuǎn)化能力提高的理論機(jī)制，為該菌株后續(xù)的改造工作提供理論依據(jù)。同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行放大，進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝，以推進(jìn)誘變菌株在甾體轉(zhuǎn)化工業(yè)中的應(yīng)用。

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Mutagenesis Breeding of High-yield9-OH-AD-coupled andOptimisation of Transformation Process

GAO Hua-yi, YANG Jia-hao, HE Man, SU Zhen-hua, ZHOU Hai-jie, SHEN Yan-bing*, WANG Min*

300457,

is an important strain for the production of 9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione (9α-OH-AD) in the manufacture of steroid drugs. To improve the 9α-OH-AD production of, the original strain was subjected to atmospheric pressure room temperature plasma (ARTP) mutagenesis treatment. A mutant strain,AR-2, with high 9α-OH-AD production was screened at the optimal mutagenic treatment time (35 s). When transformed for 96 h with 10 g/L phytosterol, the strain achieved a molar production rate of 9α-OH-AD of 87.6%, which was 14.9% higher than that of the original strain. Furthermore, AR-2 was subjected to ARTP-LiCl compound mutagenesis, the optimal LiCl mutagenesis concentration was determined to be 3.5%, and a mutagenic strain#91 with high 9α-OH-AD production was obtained.When the molar ratio of RM-β-CD addition to phytosterol was 1:1 and 10 g/L phytosterol was administered, the molar production rate of 9α-OH-AD of this strain reached 95.7%, which was 34.9% higher than that of the original strain, and it has a good application prospect.

; mutation breeding; mutagenesis

Q815

A

1000-2324(2023)05-0657-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.05.003

2022-11-11

2022-12-23

國家自然科學(xué)基金(21978221)

高華義(1989-),男,博士研究生,專業(yè)方向:發(fā)酵工程. E-mail:gaohuayi2013@163.com

Author for correspondence. E-mail:shenyb@tust.edu.cn; minw@tust.edu.cn