玻璃化法超低溫高效保存‘Gala’蘋果組培苗

徐娜,陳桂玲,楊磊,朱子涵,陳麗,韓亞丁,劉飛

玻璃化法超低溫高效保存‘Gala’蘋果組培苗

徐娜,陳桂玲,楊磊,朱子涵,陳麗,韓亞丁,劉飛*

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院, 山東 日照 276800

本試驗(yàn)以蘋果‘Gala’蘋果為材料，從低溫鍛煉時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)基蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和玻璃化溶液及處理時(shí)間4個(gè)方面優(yōu)化玻璃化超低溫保存體系，獲得‘Gala’蘋果莖尖超低溫保存的最佳體系。結(jié)果表明，將生長(zhǎng)30 d的組培苗在4 ℃的條件下低溫鍛煉5周，剝?nèi)∏o尖，將其置于含0.4 mol/L蔗糖的預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，滲透裝載液滲透30 min，0 ℃的條件下用PVS3玻璃化溶液處理60 min，放入液氮中冷凍24 h，取出后置于40 ℃水浴中1 min快速化凍，卸載液清洗2次，每次10 min，然后在恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，莖尖的再生率最高達(dá)到96.6%且生長(zhǎng)穩(wěn)定性好。本試驗(yàn)成功建立了‘Gala’蘋果的玻璃化法超低溫保存體系，為蘋果種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存提供了一條有效途徑。

‘Gala’蘋果; 超低溫處理; 組培

蘋果富含糖類、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、維生素和微量元素等多種有益于身體健康的物質(zhì)，是深受大眾喜愛的一種水果。中國(guó)是野生蘋果主要起源地之一，也是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)[1,2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，一個(gè)優(yōu)良的品種是決定蘋果產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)鍵因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前世界上的蘋果品種約有1000個(gè)，其中已有幾十個(gè)品種在生產(chǎn)中廣泛栽培，但沒有一個(gè)品種能夠完全滿足生產(chǎn)者和消費(fèi)者的所有需求?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多具有優(yōu)良性狀的自然突變體，并將其引入到生產(chǎn)中，成功改善了蘋果的品質(zhì)。蘋果的野生種、半野生種和栽培種等種質(zhì)資源，是蘋果傳統(tǒng)育種和基因工程育種的基礎(chǔ)，也是培育優(yōu)良蘋果品種的保障[3]。因此，建立安全、有效的蘋果種質(zhì)資源保存方法是非常必要的。

蘋果既可利用種子繁殖也可無(wú)性繁殖，因無(wú)性繁殖具有能夠保存母本優(yōu)良性狀且耗時(shí)較短的優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)上蘋果以無(wú)性繁殖為主。田間保存和試管保存是用來(lái)保存無(wú)性繁殖植物種質(zhì)的傳統(tǒng)方法[4]。中國(guó)、美國(guó)、德國(guó)、意大利等多個(gè)國(guó)家通過建立蘋果種質(zhì)圃保存了多份蘋果材料[5-8]。田間保存的優(yōu)點(diǎn)是可原位保存且操作簡(jiǎn)易，但田間保存需占用大面積的土地、耗費(fèi)大量的勞力、受自然災(zāi)害和病蟲害的影響大，容易造成珍貴種質(zhì)材料的喪失。試管苗保存法可有效節(jié)省空間、避免了自然環(huán)境的威脅，但所需成本高，且需不斷繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)次數(shù)增多易引起材料污染和遺傳變異，致使保存材料丟失[9-11]。超低溫保存法是將植物的組織或器官保存在-196 ℃的液氮中，在此溫度下，被保存植物材料的生命活動(dòng)幾乎完全停止，延長(zhǎng)了保存時(shí)間，避免了反復(fù)繼代培養(yǎng)，有效地保持了植物組織的遺傳穩(wěn)定性，并且無(wú)需占用土地，節(jié)省了大量的空間和勞力[4,12,13]。超低溫保存法克服了傳統(tǒng)保存法存在的問題，被認(rèn)為是長(zhǎng)期保存無(wú)性繁殖植物材料的最有效、最理想的方法[3,14]。

1960年Sakai首次在Nature上報(bào)道了超低溫冷凍法保存桑樹材料[15]。隨后不斷對(duì)超低溫保存體系進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)展了兩步冷凍法和快速冷凍法[3,4,13,16]。迄今已報(bào)道了多種果樹如柑橘、杏、桃、柿子等的材料成功利用超低溫法獲得保存[17-20]。近年來(lái)，多個(gè)國(guó)家已建立并成功使用超低溫種質(zhì)資源基因庫(kù)，如秘魯?shù)鸟R鈴薯超低溫基因庫(kù)[21]、比利時(shí)的香蕉種質(zhì)資源超低溫庫(kù)[22]、韓國(guó)和德國(guó)的大蒜超低溫基因庫(kù)[23,24]、美國(guó)的甘薯種質(zhì)資源超低溫庫(kù)[25]等。

1985年Kuo and Lineberge首次使用超低溫保存法成功保存了蘋果試管苗莖尖材料[26]，之后相繼報(bào)道了多種優(yōu)化的蘋果超低溫保存技術(shù)，如:兩步冷凍法[27]、玻璃化法[28,29]、小滴-玻璃化法[30]等。超低溫保存法通常包含培養(yǎng)、預(yù)處理、預(yù)培養(yǎng)、低溫鍛煉、液氮冷凍、解凍、再生等幾個(gè)步驟[31,32]。不同的超低溫保存技術(shù)體系會(huì)影響蘋果組織的再生和遺傳穩(wěn)定性，因此我們以‘Gala’蘋果組培苗為材料，在保證蘋果材料遺傳穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，通過不斷改進(jìn)和優(yōu)化玻璃化法超低溫保存試驗(yàn)條件，進(jìn)一步提高蘋果種質(zhì)冷凍保存的效率及穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以‘Gala’蘋果的離體莖尖為材料，組培苗在繼代培養(yǎng)基上生長(zhǎng)30 d，每天16 h光照，光強(qiáng)為75 μmo1/(m2·s)，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2 試劑

繼代培養(yǎng)基（pH=5.8）：MS、6-BA（0.5 mg/L）、NAA（0.05 mg/L）、sucrose（0.5 mol/L）、agar（0.7%）；

預(yù)培養(yǎng)液（蔗糖濃度梯度）：MS、sucrose（0～1.2 mol/L）；

裝載液：MS、sucrose（0.4 mol/L）、甘油（2 mol/L）；

PVS2：MS、乙二醇（15%）、甘油（30%）、二甲基亞砜（15%）、sucrose（0.4 mol/L）；

PVS3：甘油（50%）、sucrose（50%）；

卸載液：MS、sucrose（1.2 mol/L）；

恢復(fù)培養(yǎng)基（pH=5.8）：MS、6-BA（0.5 mg/L）、sucrose（0.5 mol/L）、agar（0.7%）；

1.3 ‘Gala’蘋果莖尖玻璃化超低溫保存步驟

4 ℃條件下，低溫馴化繼代生長(zhǎng)30 d的組培苗0～8周。取含頂芽的莖段，在顯微鏡下剝?nèi)∏o尖（長(zhǎng)度約1.5 mm，含1～2個(gè)葉原基），放入含蔗糖（0～1.2 mol/L）的預(yù)培養(yǎng)液中0～7 d，每組莖尖至少30個(gè)；預(yù)培養(yǎng)后的莖尖放入裝載液中30 min；除去裝載液，添加玻璃化溶液PVS2或PVS3，0 ℃放置0～90 min；去除玻璃化溶液，再加入新的玻璃化溶液至恰好浸沒莖尖，投入液氮中冷凍24 h。取出液氮中保存的材料，放入40 ℃水浴中快速化凍1 min；添加卸載液，放置10 min，重復(fù)1次；將莖尖轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1周后光照培養(yǎng)，光強(qiáng)75 μmo1/(m2·s)光周期12 h/d，溫度25 ℃。

光照培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)存活率，綠色或黃綠色、長(zhǎng)出小葉或者脫分化形成愈傷組織的莖尖均視為存活，存活率(%) = 存活的莖尖個(gè)數(shù)/總莖尖數(shù)×100，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 低溫鍛煉時(shí)間對(duì)超低溫保存的影響

低溫處馴化組培苗能誘發(fā)植物的自然休眠，提高細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度，降低自由水含量，增強(qiáng)試管苗的抗寒能力，有助于提升試管苗冷凍后的再生能力[33,34]。為獲得‘Gala’蘋果試管苗的最佳低溫鍛煉時(shí)間，進(jìn)行了低溫?zé)捗绲臅r(shí)間進(jìn)程試驗(yàn)。結(jié)果顯示蘋果莖尖存活率隨低溫鍛煉時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。沒有經(jīng)過低溫處理的試管苗莖尖存活率只有46.2%，處理1周后的莖尖存活率顯著提高，達(dá)到62.7%；隨著低溫處理時(shí)間增長(zhǎng)至5周，蘋果莖尖存活率都逐漸升高，且升高趨勢(shì)顯著；處理5周后，蘋果莖尖的存活率升高趨勢(shì)變緩，變化不明顯（圖1）。隨著低溫處理時(shí)間增長(zhǎng)，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)養(yǎng)分、水分不斷減少，致使試管苗開始萎蔫、發(fā)黃甚至死亡，不利于后續(xù)莖尖的剝?nèi)?，因此‘Gala’蘋果的低溫鍛煉的最佳時(shí)間為5周。

圖 1 不同低溫鍛煉時(shí)間對(duì)蘋果莖尖超低溫保存后存活率的影響

2.2 預(yù)培養(yǎng)液蔗糖濃度和時(shí)間對(duì)超低溫保存的影響

植物材料細(xì)胞中的自由水含量是超低溫保存成功的關(guān)鍵因素。自由水含量過高，細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶，造成細(xì)胞機(jī)械損傷；含量過低，細(xì)胞會(huì)因過度脫水而死亡[35]。按冰凍保護(hù)劑能否滲透到細(xì)胞內(nèi)，可將其分為滲透性和非滲透性兩類，蔗糖屬于非滲透性冰凍保護(hù)劑，是目前預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中常添加的冰凍保護(hù)劑[36,37]。為研究‘Gala’蘋果莖尖預(yù)培養(yǎng)的最適蔗糖濃度，進(jìn)行了蔗糖濃度梯度實(shí)驗(yàn)。由圖2A可知，蘋果莖尖存活率隨蔗糖濃度的升高呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度為0.3 mol/L時(shí)，存活率達(dá)到最高，說明預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度顯著影響蘋果莖尖玻璃化法超低溫保存的成活率。

植物組織的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玻璃化超低溫保存的成功率有很大的影響。如圖2B所示，蘋果莖尖玻璃化法超低溫保存后的存活率隨預(yù)培養(yǎng)天數(shù)的延長(zhǎng)表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在預(yù)培養(yǎng)5天時(shí)蘋果莖尖存活率達(dá)到最高，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，再生率開始下降。

圖 2 預(yù)培養(yǎng)基蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蘋果莖尖超低溫保存后存活率的影響

A：不同蔗糖濃度預(yù)培養(yǎng)蘋果莖尖，超低溫保存后存活率的統(tǒng)計(jì)；B：蘋果莖尖預(yù)培養(yǎng)不同時(shí)間，超低溫保存后存活率的統(tǒng)計(jì)。

A: Effect of sucrose concentration of preculture on survival rate of cryopreserved ‘Gala’ shoot tips; B: Effect of preculture duration on survival rate of cryopreserved ‘Gala’ shoot tips.

2.3 玻璃化溶液及處理時(shí)間對(duì)超低溫保存的影響

玻璃化溶液對(duì)莖尖細(xì)胞有滲透保護(hù)的作用，降低細(xì)胞的自由水含量，減少冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞的完整性，因此玻璃化法可提高超低溫保存的存活率[38]。目前常用的玻璃化溶液主要有PVS2[39]和PVS3[40]兩種。由于玻璃化溶液的濃度及處理時(shí)間影響植物細(xì)胞的狀態(tài)及再生效果，需不斷優(yōu)化試驗(yàn)條件，尋找最佳的玻璃化溶液和處理時(shí)間。由圖3所知，與沒有經(jīng)過玻璃化溶液處理的材料相比，玻璃化處理的莖尖材料的再生率顯著提高，就‘Gala’蘋果莖尖材料而言，玻璃化溶液PVS3的效果要明顯優(yōu)于PVS2，且處理60 min時(shí)，冷凍保存后的再生率高達(dá)96.6%，效果最好。

圖 3 玻璃化溶液及處理時(shí)間對(duì)蘋果莖尖超低溫保存后存活率的影響

2.4 ‘Gala’蘋果莖尖玻璃化超低溫冷凍保存后的生長(zhǎng)狀態(tài)分析

為探究?jī)?yōu)化的玻璃化超低溫保存技術(shù)是否影響再生后組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)，將超低溫保存的蘋果莖尖與未經(jīng)超低溫保存的莖尖在恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)并觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)（圖4）。通過統(tǒng)計(jì)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，玻璃化超低溫冷凍保存的蘋果莖尖再生苗在葉片長(zhǎng)寬比、葉片顏色、擴(kuò)繁系數(shù)和生根能力等方面均與未經(jīng)超低溫保存的莖尖再生苗無(wú)顯著差異（表1）。說明優(yōu)化的‘Gala’蘋果莖尖玻璃化超低溫冷凍保存法不影響植物材料的生長(zhǎng)狀態(tài)，能保持其生長(zhǎng)的穩(wěn)定性。

圖 4 蘋果莖尖再生苗

A：超低溫冷凍保存復(fù)活后的組培苗；B：未冷凍保存處理的蘋果莖尖組培苗。

A: Regrowth of cryopreserved ‘Gala’ shoot tips; B: Regrowth of apple stem tip without cryopreservation treatment.

表 1 超低溫冷凍保存后蘋果莖尖組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

3 討 論

超低溫保存技術(shù)的成功率與被保存植物材料的生理特性有密切關(guān)系，因此必須對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理通常有反復(fù)繼代、低溫鍛煉和預(yù)培養(yǎng)3種方法，進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)的自由水含量，增強(qiáng)被保存材料的抗凍能力，提高超低溫保存材料的再生力[41]。我們的研究發(fā)現(xiàn)低溫鍛煉和預(yù)培養(yǎng)都對(duì)‘Gala’莖尖的超低溫保存效果有顯著的影響?！瓽ala’莖尖的存活率隨低溫鍛煉時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，而吳傳金等[42]發(fā)現(xiàn)超低溫冷凍的新疆野蘋果的成活率隨低溫鍛煉時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，說明低溫鍛煉的效果與蘋果的品種有關(guān)。由于不同蘋果樹種對(duì)超低溫保存的要求和條件差異較大，并且整個(gè)超低溫保存過程耗時(shí)較長(zhǎng)，致使現(xiàn)今仍缺乏高效、廣譜的蘋果莖尖超低溫保存技術(shù)[43]，限制了蘋果種質(zhì)資源超低溫保存庫(kù)的建立。今后，在保持蘋果莖尖存活率的基礎(chǔ)上，仍需簡(jiǎn)化超低溫保存技術(shù)的操作，建立簡(jiǎn)易、高效的保存體系。

多個(gè)莖尖超低溫保存的研究中發(fā)現(xiàn)，不同實(shí)驗(yàn)室利用相同的技術(shù)體系保存同一基因型材料，統(tǒng)計(jì)的再生率表現(xiàn)出極大差異[44,45]。這可能是由受試材料的帶毒狀況不同導(dǎo)致的，病毒對(duì)試管苗的分化、生長(zhǎng)及生理代謝等都有顯著的影響[46]。在研究莖尖超低溫保存技術(shù)時(shí)可以與脫毒技術(shù)相結(jié)合，建立新型的脫毒技術(shù)，保存蘋果無(wú)毒苗，為蘋果的無(wú)毒生產(chǎn)開辟新的途徑。

4 結(jié) 論

玻璃化超低溫保存法是目前果樹資源種質(zhì)保存的常用方法。本研究從低溫鍛煉時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)基蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和玻璃化溶液及處理時(shí)間四個(gè)方面對(duì)‘Gala’蘋果莖尖的玻璃化超低溫保存體系進(jìn)行了優(yōu)化，獲其保存的最佳體系為：將生長(zhǎng)30 d的組培苗在4 ℃的條件下低溫鍛煉5周，剝?nèi)∏o尖，放置于含0.4 mol/L蔗糖的預(yù)培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)5 d，在滲透裝載液中滲透30 min，0 ℃條件下，用PVS3玻璃化溶液處理60 min，放入液氮中冷凍24 h，取出后置于40 ℃水浴中1 min快速化凍，卸載液清洗兩次，每次10 min，然后在恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，莖尖的再生率最高且生長(zhǎng)穩(wěn)定性好。

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Cryopreservation of 'Gala' Apple in Vitro by Vitrification

XU Na, CHEN Gui-ling, YANG Lei, ZHU Zi-han, CHEN Li, HAN Ya-ding, LIU Fei*

276800,

We optimized the vitrified cryopreservation system from low-temperature trained time, sucrose concentration of pre-culture medium, pre-culture time, vitrification solution and treatment time for cryopreservation of 'Gala' apple stem tip. Tissue culture seedlings grown for 30 days were subjected to cold acclimation at 4℃ for 5 weeks; the shoot tips were stripped, cultured in the preculture solution containing 0.4 mol/L sucrose for 5 days; followed by permeating in loading solution for 30 min; vitrified by PVS3 for 60 min at 0 ℃;frozen in liquid nitrogen for 24 h; thawed in water bath at 40 ℃for 1 min; washed twice by dilution solution, 10 min each time; finally recovered in the medium, the shoot tips grew stably and the regeneration rate was up to 96.6%. The study has successfully established effective vitrification cryopreservation protocol of 'Gala' shoot tips, and provided an innovative way for long-term conservation of apple germplasm.

‘Gala’ apple; cryopreservation; tissue culture

S602.4

A

1000-2324(2023)05-0718-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.05.011

2023-06-21

2023-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(32000194);山東省自然科學(xué)基金(ZR2017BC081);作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目(2017KF08);山東省高等學(xué)校青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2022KJ102);山東省教育科學(xué)規(guī)劃創(chuàng)新素養(yǎng)專項(xiàng)課題(2022CYB210);濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院教師國(guó)內(nèi)訪學(xué)項(xiàng)目

徐娜(1985-),女,博士研究生,研究方向:植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)及果樹種質(zhì)資源保存. E-mail:xuna828@163.com

Author for correspondence. E-mail:liufei092531@163.com