不同品種石榴汁中沒食子酸含量測定及其抗氧化能力比較

唐大為 羅凱文 張夢曉 劉浩

摘 要：研究以紅瑪瑙、白玉籽2個石榴品種為材料，采用高效液相色譜法（HPLC）和福林酚法分別測定了石榴汁中沒食子酸和總多酚的含量，并采用ABTS快速法和FRAP法綜合評價了2種石榴汁的抗氧化能力，以期更加深入地了解石榴的營養(yǎng)價值和應用潛力，同時為篩選優(yōu)質(zhì)石榴品種提供參考。結果表明：在試驗條件下，沒食子酸在3.125～50 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，紅瑪瑙和白玉籽石榴汁中沒食子酸的含量分別為7.49和24.56 μg/mL；總多酚含量在0～1 000 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，紅瑪瑙和白玉籽石榴汁中總多酚的含量分別為287.6 和737.6 μg/mL；當總多酚含量為0～200 μg/mL時，2種石榴汁的總抗氧化能力均隨著總多酚濃度的增加而增強；白玉籽石榴汁中沒食子酸和總多酚的含量均高于紅瑪瑙石榴汁，故其總抗氧化能力也強于紅瑪瑙石榴汁。

關鍵詞：石榴；沒食子酸；高效液相色譜法；總多酚；抗氧化活性

中圖分類號：TS201.4? 文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2023）10-0074-05

Determination of Gallic Acid Content in Fruit Juice of Different Pomegranate Varieties and Comparison of Their Antioxidant Capacity

TANG Da-wei， LUO Kai-wen， ZHANG Meng-xiao， LIU Hao

（School of Pharmacy， Bengbu Medical College， Anhui Engineering Technology Research Center of Biochemical Pharmaceutical， Bengbu 233000， PRC）

Abstract：This paper aims to further explore the nutritional value and application potential of pomegranate （Punica granatum）， and provide reference for screening quality varieties. Using two pomegranate varieties 'Red Agate' （Hongmanao） and 'White Nephrite Bead' （Baiyuzi） as materials， gallic acid and total polyphenol contents in fruit juice were determined by the high performance liquid chromatography （HPLC） and Folin-Ciocalteu method. The antioxidant capacity of fruit juice was assayed by the ABTS method and FRAP method. Results showed that the gallic acid content showed a good linear relationship between 3.125-50 μg/mL under experiment conditions， reaching 7.49 μg/mL in 'Red Agate' and 24.56 μg/mL in 'White Nephrite Bead'. The total polyphenols showed a good linear relationship between 0-1 000 μg/mL， reaching 287.6 μg/mL in 'Red Agate' and 737.6 μg/ml in 'White Nephrite Bead'. In the range of 0-200 μg/mL of total polyphenols contents， the total antioxidant capacity of the two pomegranate juices increased with the increase of total polyphenols concentration. 'White Nephrite Bead' pomegranate juice were higher than 'Red Agate' in the contents of gallic acid and total polyphenols， so had a stronger antioxidant capacity.

Key words：pomegranate （Punica granatum）; gallic acid; high performance liquid chromatography; total polyphenols; antioxidation activity

收稿日期：2023–05–05

基金項目：安徽省優(yōu)秀科研創(chuàng)新團隊項目（2022AH010084）；安徽省學術和技術帶頭人后備人選科研活動經(jīng)費資助項目（2019）；蚌埠市聯(lián)合攻關項目（BYLK201801）；安徽省生化工程中心科研平臺開放課題（2023SYKFD06）

作者簡介：唐大為（2001—），男，安徽蕪湖市人，本科生，藥學專業(yè)。

通信作者：劉 浩

石榴（Punica granatum L.）為千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（Punica）的落葉灌木或小喬木，別名安石榴、山力葉等。在我國，石榴具有悠久的栽培歷史，且具有產(chǎn)量充足、品種豐富等優(yōu)點。懷遠石榴為安徽省懷遠縣特產(chǎn)，同時也是國家地理標志產(chǎn)品，其中以紅瑪瑙、白玉籽2種石榴品種為典型代表。

石榴汁富含可溶性多酚，具有顯著的抗高血壓作用[1]。與此同時，日常飲用石榴汁可以起到對心血管的保護作用，降低冠心病發(fā)生的風險[2]。石榴多酚提取物作為一種天然的抗氧化劑和抑菌劑，具有抗氧化作用強、抑菌時間長、不易引起耐藥性等特征，可充分應用于改善氧化應激狀態(tài)和細菌感染類疾病的輔助治療[3]。研究表明，石榴多酚除具備抗氧化、抑菌的功效之外，還在預防動脈粥樣硬化、心血管疾病以及抗腫瘤、抗病毒等領域有著積極的作用[4]。

目前，常用的多酚類化合物檢測方法為福林酚法[5]，該方法可有效檢測石榴汁提取物中總多酚的含量，且該方法兼具操作簡便、準確性好、適用性強等特點。沒食子酸是石榴提取物中多酚類化合物的主要成分之一，具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抑菌[8]、保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]等功效。采用高效液相色譜法（HPLC）可將沒食子酸與其他多酚類成分進行有效分離，從而確定石榴汁中沒食子酸的含量。

石榴汁的抗氧化活性可通過總抗氧化能力來評價[10]，常采用ABTS快速法[11]和FRAP法[12]綜合測定石榴汁的總抗氧化能力，這2種方法分別以Trolox和FeSO4為陽性對照[13-15]，其結果具有一定的客觀性。總多酚為石榴汁中起主要抗氧化作用的成分，沒食子酸則為總多酚中最能代表抗氧化活性的成分。因此，該研究以紅瑪瑙和白玉籽2個石榴品種為材料，測定了石榴汁中沒食子酸和總多酚的含量，并采用ABTS快速法[11]和FRAP法綜合評價了2種石榴汁的抗氧化能力，以期更加深入地了解石榴的營養(yǎng)價值和應用潛力，同時為篩選優(yōu)質(zhì)石榴品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試石榴品種為安徽懷遠紅瑪瑙、白玉籽石榴，均購自安徽省蚌埠市水果批發(fā)市場。主要試劑有沒食子酸對照品（純度≥98%）；甲醇、三氟乙酸（TFA）作為流動相為色譜純；乙酸乙酯、福林酚、Na2CO3等其余試劑均為分析純；所用水為超純水；另外還有碧云天總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS快速法和FRAP法）。

主要儀器設備有萬分之一電子天平、LNG-96型真空離心濃縮儀、LC-16型島津高效液相色譜儀、UV-2700型紫外分光光度計、M22R-MB-8型低溫冷凍離心機、Synergy-HT型酶標儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 沒食子酸含量的測定 （1）色譜條件。色譜柱為 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35℃；流動相采用二元體系，A為甲醇，B為TFA（0.1%），梯度洗脫條件[16]：0～10 min，B 98%～87%； 10 ～15 min，B 87% ；流速 1.0 mL/min；進樣量10 μL；沒食子酸檢測波長 為254 nm[17]。（2）對照品溶液制備。精密稱定10 mg沒食子酸標準品于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解定容制得1 mg/mL的沒食子酸標準品母液。采用等比稀釋法，依次制成濃度為50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的系列對照品溶液備用。（3）標準曲線繪制。以系列對照品溶液進行測定，以溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。（4）供試品溶液制備及測定。 新鮮石榴去皮剝籽，將種粒與果肉分離，手動榨汁并收集，5 000 r/min離心5 min沉淀懸浮物；取上清液2 mL于離心管中，再次以8 000 r/min離心，取上層石榴汁0.5 mL轉(zhuǎn)移至新的離心管中；用0.5 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，經(jīng)真空離心濃縮儀濃縮蒸干后，加入0.5 mL的甲醇復溶，12 500 r/min離心5 min，取上層液在254 nm下測定沒食子酸含量。每種石榴隨機選取6個樣品按上述方法制備供試品溶液，采用外標法對供試品中的沒食子酸進行定量，分別計算2種石榴中沒食子酸含量的平均值。

1.2.2 方法學驗證 （1）精密度試驗。 隨機選取一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次進樣量均為10 μL，測定沒食子酸的峰面積。（2）穩(wěn)定性試驗。隨機選取一供試品溶液，分別在制備完成0、3、6、9、12、15 h進樣，每次進樣量均為10 μL，測定沒食子酸的峰面積。（3）重復性試驗。采用供試品溶液的制備方法，另外制備6個樣品進行平行試驗，色譜條件相同，每次進樣量均為10 μL，測定沒食子酸的峰面積。（4）加標回收率。選取9份已知沒食子酸含量的1 mL供試品，分成3組（3份為一組），分別加入濃度為原樣品中沒食子酸含量50%、100%、150%的對照品溶液1 mL [18]，按照1.2.1種的方法進行測定，計算加標回收率。

1.2.3 總多酚含量測定 參考Tarantino等[19]的方法，采用福林酚法測定石榴汁中總多酚含量。取250 μL果汁，加入19.5 mL雙蒸水和1.25 mL福林酚試劑中；3 min后，加入3.75 mL質(zhì)量分數(shù)為 2%的Na2CO3溶液，室溫下避光反應2 h；使用紫外分光光度計測定溶液在760 nm處的吸光度；以沒食子酸標準品為對照，以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標繪制標準曲線，采用外標法進行定量。

1.2.4 總抗氧化能力評價 （1）ABTS快速法。 2種石榴分別隨機選取6個樣品，按照1.2.3中的方法測定各石榴汁樣品的總多酚含量，根據(jù)測得的總多酚含量分別將樣品中的總多酚含量用蒸餾水分別稀釋成20、40、60、80、160、200 μg/mL，按ABTS快速法使用酶標儀測定其在405 nm下的吸光度，石榴汁的總抗氧化能力以達到同樣吸光度所需的Trolox溶液的毫摩爾數(shù)表示。以ΔA405（即A405空白對照－A405標準品）為縱坐標，不同濃度的Trolox溶液為橫坐標繪制標準曲線，代入各樣品的ΔA405計算其總抗氧化能力，結果取平均值。（2）FRAP法。2種石榴分別隨機選取6個樣品，按照1.2.3中的方法測得各石榴汁樣品的總多酚含量，根據(jù)測得的總多酚含量分別將樣品中的總多酚含量用蒸餾水分別稀釋成10、20、40、60、80、100 μg/mL，按FRAP法使用酶標儀測定其在593 nm下的吸光度，石榴汁的總抗氧化能力以達到同樣吸光度所需的FeSO4溶液的毫摩爾數(shù)表示。以吸光度為縱坐標，不同濃度的FeSO4溶液為橫坐標繪制標準曲線，代入各樣品的A593計算總抗氧化能力，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證結果

試驗結果表明，沒食子酸含量測定的標準方程為y=18 075x－25 601，R2=0.999 4，在3.125～50 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關系良好。精密度試驗結果表明，6次測定的峰面積RSD為1.32%，表明該方法精密度良好。穩(wěn)定性試驗結果表明，樣品放置0～15 h后測得的峰面積RSD為2.48%，表明供試品溶液在配置15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復性試驗結果表明，6個樣品平行測定后峰面積RSD為1.05%，表明該方法具有較好的重復性。加標回收率試驗結果（表1）表明，樣品在加標量為50%、100%、150%時的回收率RSD分別為2.87%、1.81%、1.79%，表明在不同濃度水平下，該方法的加標回收率是合格的。綜上所述，各項方法學的考察結果均符合要求，表明該方法可用于測定石榴汁中沒食子酸的含量。

2.2 2種石榴中沒食子酸含量的測定結果

按照1.2.1的方法進行測定，對照品及樣品的色譜圖如圖1所示，沒食子酸與其他共存峰得到較好的分離。經(jīng)測定，紅瑪瑙石榴汁中沒食子酸的含量為7.49 μg/mL，白玉籽石榴汁中沒食子酸含量為24.56 μg/mL（表2）。

2.3 總多酚含量測定結果

按照1.2.3的方法測定石榴汁中的總多酚含量，標準方程為y=0.000 5x－0.010 8，R2=0.997 9，在0～1 000 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關系。經(jīng)測定，紅瑪瑙石榴汁中總多酚含量為287.6 μg/mL，白玉籽石榴汁中總多酚含量為737.6 μg/mL（表2）。

2.4 總抗氧化能力測定結果

2.4.1 ABTS快速法 采用ABTS快速法測定石榴汁的總抗氧化能力，如圖2所示，在0～200 μg/mL的范圍內(nèi)，隨著總多酚濃度的增加，2種石榴汁的總抗氧化能力均增強，石榴汁的總抗氧化能力與總多酚的濃度具有明顯的相關性，白玉籽石榴汁的總抗氧化能力略強于紅瑪瑙石榴汁。

2.4.2 FRAP法 采用FRAP法測定石榴汁的總抗氧化能力，結果如圖3所示，在0～100 μg/mL的范圍內(nèi)，隨著總多酚濃度的增加，2種石榴汁的總抗氧化能力均增強，石榴汁的總抗氧化能力與總多酚的濃度具有明顯的相關性，白玉籽石榴汁的總抗氧化能力略強于紅瑪瑙石榴汁。

3 討論與結論

研究測定了紅瑪瑙和白玉籽2個石榴品種的沒食子酸、總多酚含量，結果表明，白玉籽石榴汁中沒食子酸的平均含量高于紅瑪瑙，約為紅瑪瑙石榴汁中沒食子酸含量的3.3倍。同時，白玉籽石榴汁中總多酚含量也高于紅瑪瑙，約是紅瑪瑙石榴汁中總多酚含量的2.6倍。采用ABTS快速法和FRAP測定石榴汁的總抗氧化能力，結果表明，在總多酚濃度相同的情況下，白玉籽石榴汁的總抗氧化能力

略強于紅瑪瑙，且在總多酚含量0～200 μg/mL的范圍內(nèi)，2種石榴汁的總抗氧化能力與其總多酚含量呈現(xiàn)明顯的相關性。由此推測，石榴汁的抗氧化活性與其沒食子酸及總多酚的含量密切相關，白玉籽石榴汁的沒食子酸與總多酚含量均高于紅瑪瑙，其抗氧化活性與紅瑪瑙石榴汁相比也更強。

石榴是一種常見水果，石榴汁提取物兼具食用價值與藥用價值[20-22]。研究采取石榴汁中的沒食子酸這一成分作為切入點，重點討論石榴汁的抗氧化活性。通過對有效成分含量的測定以及體外抗氧化能力的綜合比較，更加充分、深入地了解了石榴的營養(yǎng)價值和開發(fā)應用潛力，為篩選優(yōu)質(zhì)石榴品種提供了一定的科學依據(jù)。

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（責任編輯：成 平）