幾種環(huán)境因子對IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖的影響

張麗　馬文婷　姚洪旺　李娜　包海巖

摘要：為闡明在凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖過程中影響傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）增殖的關(guān)鍵因子，在實(shí)驗(yàn)室條件下，研究了溫度、鹽度、氨氮、亞硝酸鹽氮等環(huán)境因子變化對凡納濱對蝦體內(nèi)IHHNV增殖的影響。結(jié)果顯示：在同樣條件下，水溫25 ℃和30 ℃凡納濱對蝦體內(nèi)IHHNV病毒數(shù)具有明顯差異，且在30℃時(shí)最大；2.5‰、10.0‰、20.0‰三個鹽度梯度IHHNV增殖組間差異顯著，且增殖速度與鹽度呈正相關(guān)；在氨氮0.05、3.00、7.00 mg/L三個濃度梯度下，IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖數(shù)量的變化未表現(xiàn)出線性關(guān)系，但氨氮0.05 mg/L濃度組凡納濱對蝦體內(nèi)病毒數(shù)明顯低于3.00、7.00 mg/L濃度組；在亞硝酸鹽氮0.05、5.00、10.00 mg/L三個濃度梯度下，IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖數(shù)的變化組間差異不顯著。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）；環(huán)境因子；傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）；增殖

隨著凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖疾病逐年增多，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。環(huán)境因子作為養(yǎng)蝦池塘生態(tài)系統(tǒng)的主要部分，對對蝦病毒病的暴發(fā)起著重要作用。環(huán)境因子超出對蝦的適應(yīng)范圍就會成為脅迫因子，這種脅迫既影響生物體也影響病原體。養(yǎng)殖環(huán)境涉及的脅迫因子包括水質(zhì)理化因子（溫度、鹽度、pH、溶解氧、環(huán)境污染物等）、生物因子（媒介生物等）。近年來環(huán)境脅迫因子對養(yǎng)殖生物的生理病理影響受到越來越多國內(nèi)外科研工作者的重視。已有研究表明：疾病暴發(fā)主要是宿主、環(huán)境和病原體三者經(jīng)過復(fù)雜的相互作用的結(jié)果，在一定環(huán)境條件下，宿主與其攜帶的病原體可以共存，當(dāng)某些環(huán)境條件發(fā)生了大的變化，可能會導(dǎo)致疾病的暴發(fā)。黃燦華等[1]對養(yǎng)蝦水體環(huán)境因子變化與對蝦病毒病之間的關(guān)系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明某些環(huán)境因子（如高鹽、低溶氧）的變化能明顯誘發(fā)對蝦發(fā)病死亡。

對蝦被病毒感染后是否發(fā)病是多種因素相互作用、相互影響的結(jié)果。包括機(jī)體自身的抗病力水平、病原微生物以及環(huán)境條件等[2]。徐麗美等[3]通過研究發(fā)現(xiàn)了每毫克組織含103個病毒粒子可作為疾病暴發(fā)的危險(xiǎn)臨界數(shù)值。本試驗(yàn)研究了部分環(huán)境因子變化對傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）在對蝦體內(nèi)增殖的影響，在室內(nèi)條件下，模擬自然養(yǎng)殖環(huán)境，研究溫度、鹽度、氨氮、亞硝酸鹽氮等環(huán)境因子變化對凡納濱對蝦體內(nèi)IHHNV增殖的影響，分析不同影響因子對IHHNV在對蝦體內(nèi)增殖的影響力大小，以期闡明在對蝦養(yǎng)殖過程中影響IHHNV在對蝦體內(nèi)增殖情況的關(guān)鍵因子，為綜合防治IHHN的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試陽性組織陽性組織取自天津地區(qū)某發(fā)病養(yǎng)殖場池塘采集樣品，試驗(yàn)用陽性凡納濱對蝦經(jīng)PCR方法進(jìn)行多種病毒檢測，根據(jù)檢測結(jié)果取傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）陽性，而白斑綜合征病毒（WSSV）、致急性肝胰腺壞死細(xì)菌（VPAHPND）、偷死野田村病毒（CMNV）、蝦肝腸胞蟲（EHP）均陰性的樣品用于制備攻毒實(shí)驗(yàn)用病毒粗提液。

1.1.2病毒粗提液病毒提取方式參照孔杰等[4]和吳昊等[5]的方法進(jìn)行，于超凈臺內(nèi)無菌條件下取感染IHHNV的凡納濱對蝦的鰓絲，加入三倍體積TNM緩沖液[5] （配方：Tril-HCl 20 mmol/L；NaCl 100 mmol/L；MgCl 5 mmol/L，121 ℃高壓滅菌15 min），冰浴勻漿，勻漿液4 ℃、13 000 rpm/min離心10 min；離心后取上清液再4 ℃、13 000 rpm/min離心5 min，分裝到1.5 mL離心管中，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ抗芊謩e取1 μL用RT-PCR測量IHHNV的濃度。

1.1.3試驗(yàn)用凡納濱對蝦試驗(yàn)凡納濱對蝦取自天津?yàn)I海新區(qū)某對蝦養(yǎng)殖廠，體長10 cm左右，平均體重約15 g。經(jīng)檢測，白斑綜合征病毒（WSSV）、致急性肝胰腺壞死細(xì)菌（VPAHPND）、偷死野田村病毒（CMNV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）、蝦肝腸胞蟲（ EHP）均為陰性，暫養(yǎng)3 d，無死亡。

1.1.4試驗(yàn)場地、設(shè)備試驗(yàn)池為長方體玻璃缸，每個缸水體約80 L，具備循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，每個組設(shè)置3個平行，每個平行養(yǎng)殖對蝦20尾。試驗(yàn)用水為自來水兌鹵水調(diào)節(jié)鹽度。水溫25 ℃，鹽度2‰，氨氮0.01 mg/L，亞硝酸鹽氮0.01 mg/L，pH值 7.6～8.6，暫養(yǎng)3 d。

1.2方法

1.2.1陽性樣品病毒濃度測定隨機(jī)取6管病毒粗提液，用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，分別提取對蝦鰓組織DNA并測定所提取的DNA的A260/A280 比值和IHHNV的濃度。

1.2.2人工感染預(yù)試驗(yàn)

設(shè)病毒粗提液10⁶、10³copies/μL兩個梯度，采用注射感染，每個梯度注射20尾蝦，設(shè)1組平行試驗(yàn)組。從對蝦倒數(shù)第2腹節(jié)側(cè)面連接處的淺層肌肉進(jìn)行注射，每尾注射量為10 μL，對照組注射TNM緩沖液。在注射后48 h、72 h、168 h、216 h取樣，樣品暫存于-20 ℃冰箱中。用DNA提取試劑盒提取對蝦鰓組織DNA，用RT-PCR方法檢測IHHNV濃度。

本試驗(yàn)選擇肌肉注射，可以嚴(yán)格控制進(jìn)入對蝦體內(nèi)病毒的數(shù)量，便于后期對蝦體內(nèi)病毒量的測定和分析。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示病毒濃度為103 copies/μL時(shí)注射后48 h、72 h、168 h、216 h鰓組織中未檢測到IHHNV；而病毒濃度為106 copies/μL注射后，從48 h到168 h病毒濃度呈增長趨勢；從168 h到216 h，病毒濃度趨于緩慢增長趨勢，故后期試驗(yàn)病毒的注射濃度選定為106 copies/μL，檢測時(shí)間≤168 h。

1.2.3病毒檢驗(yàn)方法取對蝦鰓組織10 mg提取DNA，得到100 μL的DNA模板，采用熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測。

1.2.4不同環(huán)境因子對IHHNV在感染對蝦體內(nèi)增殖的影響

暫養(yǎng)后，采用人工感染預(yù)試驗(yàn)的方法，肌肉注射感染IHHNV。試驗(yàn)中觀察記錄對蝦發(fā)病及死亡數(shù)，根據(jù)實(shí)際情況設(shè)定取樣起始時(shí)間點(diǎn)，每隔24 h取2～3尾蝦鰓組織，-20 ℃冷凍保存，用于病毒檢測。人工感染后每天投喂1次人工配合飼料，換水20%～50%，排出殘餌和糞便，試驗(yàn)過程中24 h充氣，保證溶解氧濃度。

溫度變化試驗(yàn)時(shí)，將三組試驗(yàn)水體通過自動控溫系統(tǒng)，把溫度分別控制在（19±1）℃、（25±1）℃、（30±1）℃，在96 h、120 h、144 h、168 h、192 h取樣；鹽度變化試驗(yàn)時(shí)，將三組試驗(yàn)水體通過添加鹵水，將鹽度調(diào)節(jié)到2.5‰±1‰、10.0‰±1‰、20.0‰±1‰，在96 h、120 h、144 h、168 h取樣；氨氮濃度變化試驗(yàn)時(shí)，氨氮濃度用氯化銨調(diào)節(jié)使?jié)舛确謩e為 0.05、3.00、7.00 mg/L，為保持氨氮的濃度，每天換水50%左右，在72 h、 96 h、120 h、144 h、168 h取樣；進(jìn)行亞硝酸鹽濃度變化試驗(yàn)時(shí)，亞硝酸鹽濃度用亞硝酸鈉調(diào)節(jié)使?jié)舛确謩e為0.05、5.00、10.00 mg/L，為保持硝酸鹽氮的濃度，每天換水50%左右，在72 h、 96 h、120 h取樣。

2結(jié)果

2.1陽性樣品病毒濃度測定

測定提取對蝦鰓組織DNA的A260/A280 比值，均在1.8～2.0之間，結(jié)果見表1。用RT-PCR方法測量IHHNV的濃度，結(jié)果見表2。

2.2IHHNV的人工感染試驗(yàn)

濃度為103、106 copies/μL病毒粗提液攻毒試驗(yàn)后不同時(shí)間體內(nèi)病毒含量測定結(jié)果見表3。

2.3溫度變化試驗(yàn)

表4為攻毒后三個溫度組對蝦在96～192 h內(nèi)五次取樣并進(jìn)行病毒濃度測定的結(jié)果。通過SPSS軟件進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果顯示病毒增殖總量在溫度組20 ℃、25 ℃、30 ℃組間P＜0.05，說明不同水溫組病毒增殖數(shù)量有顯著差異。通過表4可以看出，在30 ℃時(shí)病毒增殖數(shù)量高于20 ℃和25 ℃。而在同一組內(nèi)，96～192 h對蝦體內(nèi)IHHNV拷貝數(shù)呈增長趨勢。

2.4鹽度變化試驗(yàn)

表5為攻毒后不同鹽度組對蝦在96～168 h內(nèi)四次取樣并進(jìn)行病毒濃度測定的結(jié)果。通過SPSS軟件進(jìn)行雙因素方差分析顯示，不同鹽度組間P＜0.05，差異顯著。說明在不同鹽度組病毒增殖數(shù)量有顯著差異。不同鹽度組Pearson（皮爾遜）相關(guān)性系數(shù)為0.651，且顯著性水平小于0.05，說明IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖的速度與鹽度呈正相關(guān)，即在鹽度2.5‰～20.0‰范圍內(nèi)，凡納濱對蝦體內(nèi)IHHNV增殖速度隨著鹽度的升高而提高。

2.5氨氮變化試驗(yàn)

表6為攻毒后不同氨氮濃度組對蝦在72～168 h內(nèi)五次取樣并進(jìn)行病毒濃度測定的結(jié)果。

通過SPSS軟件進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果顯示不同氨氮組間P＞0.05，說明在不同氨氮濃度組病毒增殖數(shù)量差異不顯著。不同氨氮組Pearson（皮爾遜）相關(guān)性系數(shù)為0.274，說明IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖的數(shù)量與水體中氨氮的濃度相關(guān)性低。

2.6亞硝酸鹽氮變化試驗(yàn)

表7為攻毒后不同氨氮濃度組對蝦在72～120 h內(nèi)三次取樣并進(jìn)行病毒濃度測定的結(jié)果。通過SPSS軟件進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果顯示不同氨氮組間P＞0.05，說明在不同氨氮濃度組病毒增殖數(shù)量差異不顯著。不同氨氮組Pearson（皮爾遜）相關(guān)性系數(shù)為 -0.218，說明IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖的數(shù)量與水體中亞硝酸鹽氮濃度相關(guān)性低。

3分析與討論

3.1病毒粗提液制備

陽性樣品在病毒粗提過程采取13 000 rpm離心10 min，消除細(xì)菌的影響。對凡納濱對蝦進(jìn)行WSSV、IHHNV、EHP、CMNV、VPAHPND五種病原PCR檢測，保證試驗(yàn)用凡納濱對蝦陽性樣品只攜帶IHHNV，確保感染后病毒的單一性。病毒提取過程中均在冰水中操作，確保病毒的活性。對粗提后的病毒，進(jìn)行熒光定量PCR的檢測，確定病毒濃度，再用不同濃度的病毒進(jìn)行人工感染預(yù)試驗(yàn)，確定人工感染濃度，以證明粗提液的感染性。本試驗(yàn)病毒粗提液的方法參考吳昊等[5]病毒提取的方法，并根據(jù)試驗(yàn)需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。本試驗(yàn)人工感染預(yù)試驗(yàn)結(jié)果滿足試驗(yàn)要求，故病毒未進(jìn)行再次提純，直接用于攻毒試驗(yàn)。

3.2對蝦的IHHNV人工感染技術(shù)

本試驗(yàn)采用了肌肉注射方法進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，而未采用投喂病料、病毒浸泡等方法，雖然投喂感染更接近自然狀況，但與注射感染相比較，由于個體攝食行為差異，攝入的病毒量不同，因而后期試驗(yàn)研究時(shí)可比性較差。注射感染的可控性強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確記錄每尾蝦個體中攻入的病毒劑量，更準(zhǔn)確地對比病毒在不同對蝦個體中數(shù)量的變化。

3.3不同環(huán)境因子對IHHNV在感染對蝦體內(nèi)增殖的影響

3.3.1溫度對IHHNV在感染對蝦體內(nèi)增殖的影響溫度是養(yǎng)殖環(huán)境中重要的環(huán)境因子，對蝦的新陳代謝、抗病力、生長、發(fā)育及進(jìn)食等都會受到影響，李侃等[6]對白斑病毒進(jìn)行研究，結(jié)果顯示病毒在溫度為21～30 ℃之間增殖最快，而當(dāng)溫度低于20 ℃或超過30 ℃時(shí)，病毒的增殖速度受到部分抑制。Du H等[7]發(fā)現(xiàn)蝦體內(nèi)病毒攜帶量在（10±1）℃條件下明顯低于（24±1）℃條件下。Dee Montgomery-Brock等[8]研究發(fā)現(xiàn)高水溫可以抑制凡納濱對蝦體內(nèi) IHHNV 的增殖。柴超[9]研究了23.87～26.8 ℃范圍內(nèi)溫度對IHHNV復(fù)制的影響，研究結(jié)果表明溫度增高可以增加IHHNV 的復(fù)制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在同一時(shí)間點(diǎn)，對蝦體內(nèi)病毒增殖數(shù)量在水溫25 ℃和30 ℃具有明顯差異。在同一時(shí)間采集樣品組織中IHHNV拷貝數(shù)在30 ℃時(shí)最大，與柴超的研究結(jié)果具有一致性，但本試驗(yàn)時(shí)間設(shè)定范圍較大，如果想要得到更加細(xì)致的結(jié)果，需要增加多個溫度點(diǎn)開展進(jìn)一步的研究。

3.3.2鹽度對IHHNV在感染對蝦體內(nèi)增殖的影響B(tài)ray等[10]發(fā)現(xiàn)高鹽度和IHHN病毒感染之間有明顯的相互作用。柴超[9]也發(fā)現(xiàn)鹽度與 IHHNV 拷貝數(shù)具有低相關(guān)性。管越強(qiáng)[2]研究發(fā)現(xiàn)鹽度可顯著影響蝦類的免疫反應(yīng)，超出適鹽范圍免疫反應(yīng)下降。本試驗(yàn)研究了2.5‰、10.0‰、20.0‰三個鹽度梯度內(nèi)對蝦體內(nèi)IHHNV增殖的數(shù)量變化，結(jié)果表明IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖的速度與鹽度呈正相關(guān)，即在鹽度2.5‰～20.0‰范圍內(nèi)，凡納濱對蝦體內(nèi)IHHNV增殖速度隨著鹽度的升高而提高。

3.3.3氨氮對IHHNV在感染對蝦體內(nèi)增殖的影響氨氮是對蝦養(yǎng)殖池塘中最主要的無機(jī)污染物，張輝[11]以日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）為實(shí)驗(yàn)動物開展研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)氨氮脅迫處理后的對蝦感染W(wǎng)SSV后，體內(nèi)病毒復(fù)制水平明顯高于未處理組。郝晨光[12]通過研究發(fā)現(xiàn)在氨氮脅迫下，氨氮濃度越高，協(xié)迫時(shí)間越長，實(shí)驗(yàn)組克氏原螯蝦鰓絲內(nèi)WSSV增殖越快。向赟[13]研究氨氮濃度突變對攜帶WSSV對蝦的影響，發(fā)現(xiàn)濃度 0.05 mg/L感染組病毒含量明顯低于1.25 mg/L和3 mg/L感染組，對于攜帶WSSV的對蝦，不同氨氮濃度突變都給對蝦體內(nèi)WSSV增殖提供機(jī)會。本試驗(yàn)根據(jù)孫國銘等[14]關(guān)于氨氮和亞硝酸氮對凡納濱對蝦的毒性研究的結(jié)果，研究了在0.05、3.00、7.00 mg/L三個氨氮濃度梯度下，IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)病毒增殖數(shù)量的變化，結(jié)果是差異不顯著。Pearson相關(guān)性顯示氨氮濃度變化與IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)病毒增殖數(shù)量不相關(guān)。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示氨氮濃度0.05 mg/L濃度組對蝦體內(nèi)病毒數(shù)量明顯低于3.00、7.00 mg/L濃度組。本試驗(yàn)結(jié)果顯示氨氮濃度與對蝦體內(nèi)病毒數(shù)量未表現(xiàn)出具體的線性關(guān)系，可能與養(yǎng)殖試驗(yàn)過程中氨氮濃度不穩(wěn)定有關(guān)。本試驗(yàn)使用氯化銨調(diào)節(jié)氨氮，但發(fā)現(xiàn)氨氮調(diào)整到所需濃度后第二天會下降到起始濃度的一半以上，為了保證氨氮濃度的穩(wěn)定，采用換水50%的方法，但氨氮還是不能一直保證穩(wěn)定在試驗(yàn)濃度，這或許是造成三個濃度結(jié)果不顯著的一個原因。后續(xù)研究可考慮用其他方法保證氨氮濃度的穩(wěn)定。

3.3.4亞硝酸鹽氮對IHHNV在感染對蝦體內(nèi)增殖的影響管越強(qiáng)[2]研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽氮對凡納濱對蝦抗病力相關(guān)因子有顯著影響。本試驗(yàn)根據(jù)孫國銘等[14]有關(guān)氨氮和亞硝酸氮對凡納濱對蝦的毒性研究結(jié)果，研究了在 0.05、5.00、10.00 mg/L三個亞硝酸氮濃度梯度下，IHHNV在凡納濱對蝦體內(nèi)病毒增殖數(shù)量的變化，結(jié)果差異不顯著。這可能與為維持亞硝酸鹽氮濃度進(jìn)行大量換水，對蝦造成應(yīng)激有關(guān)。而且本試驗(yàn)只進(jìn)行了120 h，如果再開展類似試驗(yàn)，應(yīng)在穩(wěn)定試驗(yàn)水體亞硝酸鹽氮濃度的同時(shí)增加觀察周期，以獲得更有說服力的數(shù)據(jù)。

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proliferation in Litopenaeus Vannamei

ZHANG Li MA Wenting YAO Hongwang LI Na1， BAO Haiyan

（1.Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center，Tianjin 300402，China；

2. BeiliZigu Village， Huangzhuang Town， Baodi District， Tianjin 301800，China）

Abstract：In order to elucidate the key factors that affect the proliferation of IHHNV during the cultivation of Litopenaeus vannamei，the effects of environmental factors such as temperature， salinity， ammonia nitrogen and nitrite nitrogen on the proliferation of IHHNV in Litopenaeus vannamei were investigated under laboratory conditions.The experimental results showed that under the same conditions， there were significant differences in the number of IHHNV viruses in the body of Litopenaeus vannamei at water temperatures of 25 ℃ and 30 ℃. And the maximum number of viruses was in the temperature group of 30 ℃; For the salinity gradient experiments of 2.5， 10.0， and 20.0， there were significant differences between the IHHNV proliferation groups， and the proliferation rate was positively correlated with salinity; Under three concentration gradients of 0.05 mg/L， 3.00 mg/L， and 7.00 mg/L of ammonia nitrogen， there was no linear relationship between the changes in virus proliferation quantity of IHHNV in Litopenaeus vannamei. However， the number of virus in the body of Litopenaeus vannamei with an ammonia nitrogen concentration of 0.05 mg/L was significantly lower than that of the 3.00 mg/L and 7.00 mg/L concentration groups; At three concentration gradients of 0.05 mg/L， 5.00 mg/L， and 10.00 mg/L for nitrite nitrogen， there was no significant difference in the number of virus proliferation in Litopenaeus vannamei between groups.

Key words：Litopenaeus vannamei;environmental factor;IHHNV;proliferation

（收稿日期：2023-09-08）