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    射流空化對大豆分離蛋白-磷脂酰膽堿乳化特性的影響

    2020-03-01 21:27:36江中洋王中江
    食品科學 2020年3期
    關鍵詞:層析空化水性

    田 甜,江中洋,王中江,李 楊,2,李 良,*

    (1.東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.哈爾濱食品產業(yè)研究院,黑龍江 哈爾濱 150028)

    大豆分離蛋白(soy protein isolates,SPI)因其營養(yǎng)價值及其功能特性如凝膠化、發(fā)泡性、水結合能力和乳化性而廣泛應用于食品配方中,但天然SPI的功能特性不能滿足實際需要,因此需對其改性。最近的研究表明,引入外部乳化劑如卵磷脂可以增強天然SPI的乳化性能[1]。磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)是卵磷脂中的主要磷脂,是一種有效的天然乳化劑,廣泛用于降低乳液的界面張力。Mottola等[2]發(fā)現(xiàn),添加卵磷脂改善了使用天然或變性SPI制備的乳液的物理穩(wěn)定性,SPI乳液的乳化率隨著PC添加量的增大而增大。Li Chen等[3]研究得出,當PC與SPI相互作用時,他們之間發(fā)生疏水結合使蛋白質表面活性發(fā)生改變,乳液的乳化性增加。

    近年來,在SPI的工業(yè)生產過程中,一些極端條件例如酸沉淀和高溫,會導致蛋白質變性,降低其溶解性、乳化性和其他功能特性。為改善SPI物理結構性質并促進其與PC相互作用,已有部分研究學者利用包括物理、化學改性及酶法修飾對SPI進行改性處理[4]。Jambrak等[5]發(fā)現(xiàn),40 kHz超聲波處理可提高大豆?jié)饪s蛋白的溶解度和乳液活性指數(shù)。此外,高壓處理(包括高靜水壓和動態(tài)高壓)也被用來改變SPI的乳化特性[6]。這些修飾的潛在機制主要歸因于高壓處理期間蛋白質分子的三級和四級構象變化。熱處理是最重要和最常用的食品加工方法之一,也可用于改變蛋白質的功能特性,但這種改性的程度取決于蛋白質變性的程度[7]。在某些情況下,熱誘導的變性通過增加SPI的表面疏水性使乳化性能得到改善[8]。常規(guī)物理化學處理方法可重復性低、成本較高且能耗高,產生的過高溫度會影響大豆食品的營養(yǎng)成分;因此可利用射流空化處理得到高功能特性復合乳液。射流空化可以產生與超聲相同的空化現(xiàn)象,流動液體在空壓機中由孔板、葉輪或轉子引起的壓力差,從而產生空化氣泡,空化氣泡的破裂引發(fā)各種物理化學效應,包括產生剪切力、沖擊波和壓力,這類似于超聲空化[9]。射流空化產生的空化強度略低于聲學反應,但其空化率和能量效率高于聲學設備(超聲波)。Kumar等[10]利用碘化鉀水溶液的分解/氧化模型反應比較射流空化和聲空化的影響,結果表明射流空化會產生較超聲空化更高效率的化學效應。

    本實驗利用射流空化調節(jié)SPI-PC復合乳液的構建,探究空化及剪切作用力對乳液乳化性等功能性質的影響。對比不同空化壓力和空化時間對乳液的作用,對改性蛋白分子結構、溶解度以及復合乳液粒徑、表面疏水性、乳化性和顯微結構進行分析和表征,以期為射流空化技術產生高乳化性和乳化穩(wěn)定性的SPI-PC復合產品提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大豆品種為‘東農46號’,由東北農業(yè)大學大豆研究所贈予;PC、1-苯胺基-8-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS) 美國Sigma公司;HCl、NaOH 北京新光化工試劑廠;NaH2PO4、Na2HPO4天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠;正己烷天津北科化學品有限責任公司;其他基礎試劑(均為分析純) 北京化學試劑公司。

    1.2 儀器與設備

    Ultra-Turrax T25型高速分散器 德國IKA公司;F-4500型熒光分光光度計、UV-2600型紫外-可見分光光度計 日本日立公司;ATN-300型全自動凱氏定氮儀 上海洪紀儀器設備有限公司;Bettersize2000型激光粒度分布儀丹東市百特儀器有限公司;BX53型顯微鏡 日本奧林巴斯公司;射流空化機 北京華瑞創(chuàng)世科技有限公司;AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司;pHSJ-4A型實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;GL-20G-II高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 SPI制備

    SPI制備參考Speroni等[11]的方法。新鮮大豆磨粉后與正己烷以1∶3(m/V)的比例混合,在40 ℃條件下攪拌2 h。將所得混合物在4 ℃、10 000hg條件下離心20 min,棄去上層油脂,再重復離心3 次,得到脫脂豆粉。將脫脂豆粉按1∶10(m/V)的料液比與蒸餾水混合,然后用2 mol/L NaOH溶液調節(jié)溶液的pH值至8.5,45 ℃條件下攪拌2 h后,將其懸浮液在4 ℃、10 000hg條件下離心20 min,取上清液再用2 mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH值至4.5。靜置后在4 ℃、6 000hg條件下離心20 min,得蛋白質沉淀,水洗2 次,最后用2 mol/L NaOH溶液調節(jié)蛋白質pH值至7.0。將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀SPI(蛋白質量分數(shù)為93.2%)。

    1.3.2 射流空化處理制備SPI-PC復合乳液

    實驗分為SPI粗乳液組、未經射流空化處理的SPI-PC復合乳液組和經射流空處理的SPI-PC復合乳液組,各組乳液具體配制如下。

    將SPI溶解于100 mL錐形瓶中,得到質量濃度為10 mg/mL的SPI乳液,加入葵花油使體系油相體積分數(shù)為20%后,置于高速分散器的探頭下高速分散處理,20 000 r/min分散5 min后得到SPI粗乳液。

    將PC與SPI以質量比1∶10的比例混合溶解于1 000 mL錐形瓶中,加入蒸餾水使SPI質量濃度為10 mg/mL,室溫下不斷攪拌2 h,得到SPI-PC混合液,再加入葵花油,使體系油相體積分數(shù)為20%,將溶液置于高速分散器的探頭下高速分散處理,20 000 r/min分散5 min后得到SPI-PC復合乳液。

    對SPI-PC復合乳液,采用射流空化處理,壓力為0.2、0.4 MPa和0.6 MPa,處理時間為5、10 min。實驗過程中,將射流空化裝置置于2 ℃的冰水浴中,每5 min向冰水浴中加入冰塊保持低溫,以免溫度對SPI-PC復合乳液產生影響。

    1.3.3 熒光光譜測定

    采用F-4500型熒光分光光度計測定樣品的熒光光譜[12]。用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)制備0.2 mg/mL經射流空化處理的樣品,設置激發(fā)波長為300~400 nm區(qū)域,激發(fā)狹縫為10 nm,發(fā)射狹縫為10 nm,重復掃描3 次。

    1.3.4 表面疏水性測定

    表面疏水性的測定參考Hu Hao等[13]的方法稍加修改,將不同射流空化處理的乳液在20 000hg、4 ℃下離心15 min獲取上層清液,并用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋復合乳液,得到蛋白梯度質量濃度為0.000 5~0.100 0 mg/mL的上清液。將所得梯度的上清液溶液與6.0 mmol/L ANS以體積比100∶1混合,用分光熒光計在365 nm(激發(fā))和484 nm(發(fā)射)的波長處測量相對熒光強度。以相對熒光強度對蛋白質量濃度作圖,曲線的初始斜率即樣品的表面疏水性。

    1.3.5 乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)的測定

    乳液的乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(emulsion stability index,ESI)的測定參考文獻[14]。將SPI-PC復合乳液用0.001 g/mL十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液稀釋200 倍,混合均勻后在500 nm波長處測定吸光度(A0),靜置10 min后測定吸光度(A10),以0.1% SDS溶液做空白對照,EAI和ESI分別按公式(1)、(2)計算。

    式中:ρ表示乳化液質量濃度/(g/mL);N表示稀釋倍數(shù)(200);φ表示乳液中油相體積分數(shù)(25%);A0、A10為乳液分別在0、10 min時的吸光度;t10-t0表示時間差(10 min)。

    1.3.6 乳層析指數(shù)的測定

    乳液乳析穩(wěn)定性的測定參考Moschakis等[15]的方法。將制備好的乳液分別置于20 mL的具塞比色管中,25 ℃條件下靜置7 d,每天觀察SPI-PC乳液的相分離現(xiàn)象并記錄乳液高度。按公式(3)計算乳層析指數(shù)。

    式中:HC、HE分別為底部清液層高度/cm、乳液總高度/cm。

    1.3.7 乳液粒徑測定

    參考Yang Ying等[16]的方法,使用激光粒度分布儀測定乳液的平均液滴直徑。為了防止多次散射的影響,在測量之前使用磷酸鹽緩沖溶液在室溫下將每個樣品稀釋1 000 倍。乳液顆粒的折射率為1.46,分散介質的折射率為1.33,檢測溫度保持在25 ℃。所有測量做3 次平行,結果以D[4,3]/μm表示粒徑的累積平均直徑。

    1.3.8 光學顯微鏡觀察

    乳液的光學顯微鏡觀察參考文獻[17]。將經過射流空化處理的新鮮乳液置于顯微鏡載物臺上,固定載玻片,用40 倍光學顯微鏡觀察,通過BX53型照相機獲取照片,照片在連接到電腦的數(shù)字圖像處理軟件獲得。

    1.3.9ζ-電位的測定

    參照齊軍茹等[18]的方法,采用激光粒度分布儀測定樣品的ζ-電位。將制備的不同乳液分散到pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中,使其質量分數(shù)為0.005%,上樣體積為1 mL,測定溫度為25 ℃,溫度平衡2 min,每個樣品平行測定3 次。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

    每組數(shù)據(jù)至少重復3 次,利用Origin 9.1軟件作圖。利用SPSS 20.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析及相關性分析,P<0.05表示差異顯著。

    2 結果與分析

    2.1 射流空化處理后SPI-PC復合乳液熒光光譜分析結果

    蛋白質的內源熒光光譜由熒光氨基酸的化學環(huán)境決定,即色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe),這三者的熒光強度比通常為100∶9∶0.5,由此認為SPI的熒光主要來自于Trp殘基。研究發(fā)現(xiàn)如果最大吸收波長(λmax)小于330 nm,表示蛋白質中Trp殘基被掩埋,Trp處于“非極性”環(huán)境中;λmax大于330 nm則表明Trp殘基位于蛋白質分子外部的“極性”環(huán)境中[19]。圖1為各組乳液的熒光光譜圖。親水性較強的PC與SPI結合,使Trp殘基的微環(huán)境發(fā)生改變,從而使SPI的熒光強度發(fā)生改變,與未加入PC的樣品相比,加入PC的乳液中SPI的內源熒光強度降低,λmax發(fā)生紅移,說明PC與SPI發(fā)生相互作用,并改變了SPI的結構,進而使Trp殘基微環(huán)境發(fā)生改變。與未處理的SPI-PC樣品相比,經過射流空化作用的SPI-PC復合乳液的最大熒光強度均降低,說明空化作用力對SPI產生了猝滅作用。熒光猝滅可以用來解釋射流空化對乳液穩(wěn)定性的影響[20]。與未空化處理樣品相比,空化樣品的λmax均發(fā)生輕微紅移,并伴隨著熒光強度的減小,這說明在射流空化處理過程中,產生的大量氣泡使蛋白質解折疊,蛋白質疏水基團暴露,從而增強了蛋白質與PC的結合[19]。

    圖 1 射流空化作用下SPI-PC的熒光光譜圖Fig. 1 Fluorescence spectra of SPI-PC with jet cavitation

    2.2 射流空化處理對SPI-PC復合乳液表面疏水性的影響

    圖 2 射流空化處理對SPI-PC復合乳液表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of jet cavitation treatment on surface hydrophobicity of SPI-PC

    乳液的乳化性能與蛋白質的表面疏水性呈正相關,表面疏水性作為蛋白的結構特性,對蛋白的功能性質具有很大的影響[21]。如圖2所示,與SPI乳液相比,SPI-PC復合乳液表面疏水性增加,是因為PC具有修飾SPI表面結構的作用。除0.6 MPa、10 min處理組外,經射流空化的SPI-PC復合乳液均比未射流空化處理的SPI-PC乳液表面疏水性高,說明未射流空化處理的SPI-PC復合乳液中,SPI的大多數(shù)疏水基團被緊密包埋在蛋白質的緊密結構中,SPI的疏水基團和探針之間的接觸受到抑制,射流空化處理產生的壓力使蛋白質中的弱氫鍵和分子間相互作用力減弱,進而改變了SPI的結構及其表面疏水性[22]。射流空化處理時間5 min時,隨著處理壓力的增加,乳液的表面疏水性先增加后降低;樣品經射流空化0.2 MPa、10 min處理后表現(xiàn)出最高的表面疏水性,這可能是射流空化產生的作用力使SPI與PC結合更緊密,蛋白質以疏水作用固定在PC上,復合體系的疏水性進一步提高。射流空化處理時間10 min時,隨著處理壓力增加,復合乳液的表面疏水性下降,可能是因為過長的處理時間使SPI產生一定聚集,蛋白質的疏水基團被包埋在結構中,疏水性探針未能接觸到復合乳液疏水基團中的疏水性氨基酸,SPI與PC之間的結合程度下降[23]。

    2.3 射流空化處理對SPI-PC復合乳液EAI和ESI的影響

    圖 3 射流空化處理對SPI-PC復合乳液乳化特性的影響Fig. 3 Effect of jet cavitation treatment on emulsifying characteristics of SPI-PC

    乳化特性是衡量SPI在油-水界面上吸附能力的指標,包括EAI和ESI[24]。SPI的乳化能力是影響復合乳液乳化能力的重要因素之一,如圖3所示,經射流空化處理后SPI-PC復合乳液的EAI和ESI都顯著增加(P<0.05),這主要是因為空化處理使SPI分子結構發(fā)生解折疊,其疏水基團暴露,蛋白質表面疏水性增加,ESI和EAI更高[25]。經過0.2 MPa微射流空化處理10 min的SPI-PC復合乳液呈現(xiàn)出最高的EAI和ESI,與SPI相比,0.2 MPa、10 min處理組SPI-PC復合乳液的EAI和ESI分別增加了82.7%和9.43 倍。然而,在處理時間為5 min時,隨著空化壓力增加,復合乳液體系的EAI和ESI先增加后下降;空化時間為10 min時,復合乳液體系的EAI和ESI隨著空化壓力的增加顯著下降(P<0.05)。Yildiz等[26]發(fā)現(xiàn)在中性pH值下進行高壓處理可以提高SPI的EAI,但對ESI無顯著影響。因此,射流空化能促進蛋白質的修飾,從而改變復合乳液的物理化學性質(溶解度、表面疏水性)以及乳化性質(EAI和ESI)。

    2.4 射流空化處理對SPI-PC復合乳液乳層析指數(shù)的影響

    圖 4 射流空化處理對SPI-PC復合乳液乳層析指數(shù)的影響Fig. 4 Effect of jet cavitation treatment on creaming index of SPI-PC composite emulsion

    乳層析指數(shù)能表征乳液抵抗重力分層的程度[27]。如圖4所示,乳液的乳層析指數(shù)隨著貯藏時間延長逐漸增加,放置5 d后乳液的乳層析指數(shù)基本保持不變。大部分樣品在室溫條件下放置24 h即會產生相分離現(xiàn)象(0.2 MPa、10 min處理組除外),可能是由于乳液表面的組成物電荷含量較低,未能為液滴間提供足夠的排斥力,阻止乳層析的發(fā)生,這與Mantovani等[28]的研究結果一致。與未射流空化的SPI-PC乳液相比,經過射流空化的樣品的乳層析指數(shù)均減小,這是因為射流空化產生的剪切作用力使蛋白柔性結構舒張,SPI與PC形成的復合體系構象發(fā)生改變,SPI與PC緊密結合形成穩(wěn)定的界面膜,包覆油滴使其聚集程度減小,因此乳層析指數(shù)較低。靜置5 d后,空化時間為5 min的SPI-PC乳液,乳層析指數(shù)隨著空化壓力增加先降低后升高,因為在一定條件下壓力增大時,射流空化產生的剪切力會破壞蛋白質結構,使疏水基團重新包埋進蛋白質中,乳液乳化性降低,乳液不穩(wěn)定??栈瘯r間為10 min時,乳層析指數(shù)隨著空化壓力增加而增加,這是因為射流空化時間過長會破壞蛋白質的結構,使其乳化能力減弱,乳層析指數(shù)增加。

    2.5 射流空化制備的SPI-PC乳液的顯微結構和粒徑

    粒徑分布可以衡量射流空化處理SPI-PC乳液的穩(wěn)定性,也是乳液理化和功能特性的主要參數(shù),為了進一步表征不同樣品的乳液穩(wěn)定性,將粒徑分布圖疊加在顯微圖像上,以更好地描述乳液微觀結構。由圖5A、B1、B2、C3可知,未經處理的SPI-PC復合乳液和0.2 MPa 5 min、0.4 MPa 5min、0.6 MPa 10 min處理組SPI-PC復合乳液中有一些大液滴并且廣泛絮凝,樣品粒徑呈現(xiàn)雙峰分布狀態(tài);由圖5B3、C1和C2可知,0.6 MPa 5 min、0.2 MPa 10 min、0.4 MPa 10 min處理組SPI-PC復合乳液粒徑呈現(xiàn)單峰分布,液滴小且分布均勻。這種現(xiàn)象主要是因為未處理的SPI-PC樣品穩(wěn)定性差,空化時間為5 min時,隨著空化壓力增加,液滴逐漸減小,乳液粒徑由雙峰分布變?yōu)閱畏宸植?,這是因為空化產生的渦流作用將絮凝物剪切成小聚集體??栈瘯r間為10 min時,隨著空化壓力持續(xù)增大,液滴由單峰分布變?yōu)殡p峰分布,液滴變大,說明乳液聚集。當空化壓力相同時,壓力較低(0.2、0.4 MPa)的樣品隨著空化時間的延長,液滴變小,而當空化壓力為0.6 MPa時,隨著空化時間延長,液滴出現(xiàn)聚的現(xiàn)象。Sui Xiaonan等[29]指出,長時間超聲處理會導致液滴增大,這與本實驗結果一致。這主要是由于高壓使蛋白質結構發(fā)生改變,蛋白質的疏水基團減少,使得SPI失去表面活性,蛋白質形成的乳液形成易于聚結的界面膜,復合乳液穩(wěn)定性降低,SPI分子重新聚集。

    圖 5 射流空化處理SPI-PC復合乳液顯微鏡圖及粒徑分布圖Fig. 5 Effect of jet cavitation treatment on microstructure and particle size distribution of SPI-PC composite emulsion

    圖 6 射流空化處理SPI-PC復合乳液的平均粒徑Fig. 6 Average particle size of jet cavitation-treated SPI-PC composite emulsion

    如圖6所示,未經處理的SPI-PC復合乳液樣品的平均粒徑為(15.4f0.4)μm,射流空化處理會顯著降低SPI-PC復合乳液的平均粒徑,其中空化壓力0.2 MPa、空化時間10 min時,復合乳液的平均粒徑最低,比未處理的SPI-PC復合乳液降低了79.60%。0.2、0.4、0.6 MPa下處理10 min,復合乳液平均粒徑分別降至3.30、3.97、5.78 μm。因為復合乳液的聚集體經射流空化處理后,其在局部溫度、壓力、剪切力或沖擊波的作用下發(fā)生解離,較高的壓力可能導致氣體以更高的注入速率進入射流空化室,導致渦旋中心的壓力下降更大,形成更多的空化氣泡,空化強度的影響更強,平均粒徑減小[20]。Morales[25]和Wu Yu[30]等研究的超聲及超高壓均質對乳液粒徑影響的結論與本研究結果一致。

    2.6 射流空化處理對SPI-PC復合乳液ζ-電位的影響

    圖 7 射流空化處理SPI-PC復合乳液的ζ-電位Fig. 7 ζ-Potential of SPI-PC composite emulsion treated with jet cavitation

    ζ-電位可用來表征乳滴之間的靜電相互作用,乳液表面凈電荷越多,乳滴之間靜電斥力越大,乳液越穩(wěn)定[31]。如圖7所示,在中性條件下,各組SPI-PC復合乳液均呈負電性,未經射流空化處理的復合乳液的ζ-電位的絕對值為2.7 mV。射流空化處理使乳液ζ-電位的絕對值增加,空化壓力0.4 MPa、空化時間5 min時,SPI-PC復合乳液表面電荷密度最大,ζ-電位絕對值為13.1 mV??赡苁怯捎谏淞骺栈幚砥茐牧说鞍踪|結構,蛋白質解折疊,帶電基團暴露,乳液電位絕對值增加。處理時間為5 min時,隨著空化壓力的增加,SPI-PC復合乳液ζ-電位的絕對值先升高后降低,處理時間為10 min時,ζ-電位的絕對值降低??赡苁且驗榭栈瘔毫κ谷橐褐袔щ娀鶊F暴露,然而隨著壓力持續(xù)增加,空化作用力誘導蛋白質聚集,帶電基團被重新包埋在蛋白質內部結構中[32]。

    3 結 論

    通過制備不同射流空化條件處理的SPI-PC復合乳液,發(fā)現(xiàn)射流空化產生的高速剪切作用力會使SPI疏水基團暴露,SPI與PC之間的相互作用增強,與未處理的復合乳液相比,SPI-PC復合乳液的EAI和ESI增加,乳液粒徑減小且分布均勻。對比不同射流空化條件制備的復合乳液的熒光光譜、表面疏水性、粒徑分布和乳化性分析發(fā)現(xiàn),射流空化破壞了蛋白的分子結構,蛋白分子展開,使更多的PC與蛋白結合,蛋白質中的熒光基團暴露于水溶液中而產生熒光猝滅,熒光強度降低,蛋白與PC復合乳液ESI高,然而空化壓力較高和時間過長影響了蛋白的結構和活性基團的暴露,進而影響復合物的乳化特性,形成的乳液粒徑較大,導致乳液不穩(wěn)定,EAI和ESI下降。

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