樺褐孔菌醇提物對胃癌模型裸鼠和BGC-823胃癌細(xì)胞Ras/MAPK信號通路的影響

喬羽，項楠，周忠光，劉旭

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一［1］，預(yù)后相對較差，嚴(yán)重威脅人類健康［2］。中國是胃癌高發(fā)國家［3］，發(fā)病率位居全球第五，病死率位居全球第三［4］，疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，是我國癌癥防治的重點［5］。然而，大部分胃癌被發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，錯過了最佳手術(shù)治療時間［6］，加上對放療化療不敏感，治療效果很難盡如人意［7］。近年來，通過阻斷致癌的分子信號通路，從而逆轉(zhuǎn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展、阻滯癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，成為胃癌研究的焦點。研究表明，激活裸鼠的K-Ras基因，可以激活MAPK信號途徑，從而引起前胃鱗狀上皮細(xì)胞的過度增殖和胃腺體的化生［8］。因此，筆者選擇Ras/MAPK信號通路作為切入點，研究樺褐孔菌醇提物對該信號通路的影響，為尋找胃癌的潛在治療靶點和藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性裸鼠49只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2016-0006，3～5周齡，體質(zhì)量（20±2）g，清潔級飼養(yǎng)，自由攝入水和飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實驗。

1.2 瘤株

人系胃癌細(xì)胞株BGC-823由中科院上海細(xì)胞所提供。

1.3 藥物

樺褐孔菌由黑龍江儒泰科技發(fā)展有限責(zé)任公司提供。按照醇提法常規(guī)操作，取樺褐孔菌1 kg，加70%乙醇10 L，加蓋常溫浸泡24 h，100 ℃加熱回流1 h提取，得到濾液1，殘渣再加70%乙醇，加熱回流1 h提取，得到濾液2，合并濾液1與濾液2，水浴箱蒸干，打粉；卡培他濱片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20133366）；5-FU（索萊寶生物科技有限公司，批號：IF0170）。

1.4 主要儀器與試劑

Ras試劑盒、JNKS試劑盒、p38MAPK試劑盒［愛必信（上海）生物科技有限公司，貨號：abs123144、abs131533、abs131944］；PVDF膜（Summus，S59825）；丙烯酰胺（Vetec，V900845）；甲叉雙丙烯酰胺（Sigma，146072）；過硫酸銨（Sigma，9913）；SDS、Tween20（Biotopped，貨號：S6010、P9416）；TEMED（Sigma，T7024）；Glycine（Sigma，G7126）；TRIS（Sigma，T3253）；PageRuler?Prestained Protein Ladder（Thermo，26616）；Western bloting及IP裂解液（碧云天，P0013）；PMSF（碧云天，ST506）；一抗稀釋液（碧云天，P0023A）；一抗二抗去除液（碧云天，P0025）；二抗（中杉，ZB2301）；20XTBS（Solarbio，T1080）；Western專用脫脂奶粉（BD，1174551）；甲醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，2018.6.10）；BeyoECL Plus（碧云天，P0018）。

-80 ℃低溫冰箱（日本三洋，MDF-C8V1）；制冰機(jī)（Simag，SPR80）；超純水儀（美國密理博，Milli-Q）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP，MegaCam815）；低溫離心機(jī)（德國Sigma，4-16S）；高速離心機(jī)（上海安亭，TGL-20B）；電子恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司，DK98-1）；普通PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，ETC811）；水平電泳系統(tǒng)（北京六一，DYCP-31CN）；精密天平（瑞士賽多利斯，BSA124S）；酸度計（美國奧德龍，StartA2117）；紫外分光光度計（日本島津，UV-2401）；熒光定量PCR（美國ABI，7500）；PH復(fù)合電極棒（梅特勒-托利多，LP115）；磁力攪拌器（金城國勝實驗儀器廠，78-1）；SDS電泳儀（Bio-Rad，042BR13724）；微量光吸收儀（Implen，p330）；轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，221BR52130）；垂直凝膠電泳槽（Bio-Rad，552BR113758）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，Universal hood Ⅱ）；脫色搖床（沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司，WD-9405B）；全自動圖像分析系統(tǒng)（TANON，5020）。

2 方法

2.1 體內(nèi)實驗

2.1.1 動物分組及模型制備

49只雄性裸鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陰性對照組、西藥組和樺褐孔菌醇提物高、中、低劑量組。除空白組外，其余6組在每只裸鼠腋下皮膚接種0.2 mL BGC-823細(xì)胞（2 × 107個/mL）。每天觀察腫瘤形成情況，第7天開始可在皮下觸及粟粒樣腫瘤，所有裸鼠模型均制備成功。

2.1.2 給藥

樺褐孔菌醇提物高、中、低劑量組給予羧甲基纖維素鈉（CMC）溶解的樺褐孔菌醇提物1.56、0.78、0.39 mg/g；西藥組藥物依據(jù)臨床應(yīng)用，選用抗消化道腫瘤常用口服藥物卡培他濱片，劑量經(jīng)人鼠等效劑量折算確定為0.5 mg/g，每只裸鼠灌胃給藥0.3 mL；陰性對照組只給予CMC溶劑；空白組和模型組不給藥，每日1次，連續(xù)21 d。

2.2 體外實驗

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用90%RPMI-1640，10%胎牛血清和1%雙抗制作培養(yǎng)液、用于人系胃癌細(xì)胞株BGC-823的培養(yǎng)。

2.2.2 體外實驗分組在腫瘤細(xì)胞BGC-823的對數(shù)生長期，用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 × 104個/mL。隨機(jī)分為模型組、陰性對照組、西藥組、高劑量組、中劑量組和低劑量組。模型組給予同體積培養(yǎng)液，陰性對照組給予同體積二甲基亞砜，西藥組給予5-氟尿嘧啶（5-Fu）120 mg/mL，高、中、低劑量組分別給予褐孔菌醇提物0.4、0.2、0.1 mg/mL。

2.3 檢測指標(biāo)與方法

2.3.1 免疫組化法檢測腫瘤組織Ras、JNKS、p38MAPK給藥21 d后，取腫瘤組織用多聚甲醛溶液固定，采用免疫組化法檢測Ras/MAPK通路上下游相關(guān)因子Ras、JNKS、p38MAPK的表達(dá)水平。切片、65 ℃烘片2 h、脫蠟、水化、滴加3% H2O2，靜置10 min，把切片放入枸櫞酸鈉溶液中，微波修復(fù)，冷卻至室溫37 ℃，滴加山羊血清封閉10 min、滴加一抗，裝入濕盒，放入冰箱4 ℃過夜，次日37 ℃復(fù)溫45 min，滴加二抗試劑1，37 ℃孵育15 min，滴加二抗試劑2，37 ℃孵育15 min，加DAB試劑顯色，鏡下觀察，隨時清洗，蘇木復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，400倍鏡下觀察并拍照。

2.3.2 熒光定量PCR檢測腫瘤細(xì)胞Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK的基因表達(dá)

設(shè)計與合成引物，擴(kuò)增的片段長度為100～300 bp，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，65 ℃（1 min）→30 ℃（5 min）→65 ℃（25 min）→98 ℃（5 min）→5 ℃（5 min）從30 ℃升溫到65 ℃時，必須15～30 min內(nèi)勻速升溫。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃34 s 40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2.3.3 Western blot檢測p-Raf-1、p-MEK、p-ERKs、p-p38MAPK蛋白表達(dá)

稱取樣品100 mg置于裂解液中冰上裂解，30 min后離心10 min，取中間層。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書操作完成分離膠的配制，插入齒梳水平放置約15 min，將蛋白樣品用移液槍注入泳道，每孔上樣10 μL，接通電泳儀。結(jié)束電泳，取下玻璃板，切取分離膠，于轉(zhuǎn)膜液中平衡10 min。自下而上依次放置平衡過的厚濾紙，PVDF膜，分離膠，厚濾紙，接通電源進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜移入盛有TBST緩沖液的平皿中，用TBST洗滌兩次，每次10 min。移膜至盛有封閉液的平皿中，置水平搖床上，封閉2 h。封閉結(jié)束后，將PVDF膜用TBST洗滌兩次，每次10 min。之后將膜放入雜交袋中，置入4 ℃冰箱過夜。次日，移至盛有TBST液的平皿中，洗滌4次，每次10 min，將膜及二抗液封入雜交袋中，水平搖床上搖動，室溫下孵育1 h，洗脫二抗。濾紙吸干液體，ECL發(fā)光液滴注于PVDF膜上，約1 min后曝光，保存圖像。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，多組間連續(xù)變量采用單因素方差分析（OneWay ANOVA），數(shù)據(jù)均以±s表示，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組裸鼠腫瘤組織Ras、JNKS、p38MAPK的表達(dá)情況

模型組和陰性對照組Ras陽性表達(dá)強(qiáng)，西藥組和樺褐孔菌醇提物高劑量組Ras陽性表達(dá)弱，樺褐孔菌醇提物中、低劑量組Ras陽性表達(dá)高于西藥組和樺褐孔菌醇提物高劑量組，低于模型組。見圖1。

圖1 各組腫瘤組織Ras的表達(dá)情況（× 400）

模型組和陰性對照組JNKS陽性表達(dá)強(qiáng)，西藥組JNKS陽性表達(dá)最弱，樺褐孔菌醇提物高、中、低劑量組JNKS陽性表達(dá)高于西藥組，低于模型組。見圖2。

圖2 各組腫瘤組織JNKS的表達(dá)情況（× 400）

模型組和陰性對照組p38MAPK陽性表達(dá)強(qiáng)，西藥組p38MAPK陽性表達(dá)弱，樺褐孔菌醇提物高、中、低劑量組p38MAPK陽性表達(dá)高于西藥組，低于模型組。見圖3。

圖3 各組腫瘤組織p38MAPK的表達(dá)情況（× 400）

與模型組比較，西藥組與樺褐孔菌醇提物高、中、低劑量組Ras、JNKS、p38MAPK蛋白的陽性表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。見表2。

表2 各組腫瘤組織Ras、JNKS、p38MAPK表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組腫瘤組織Ras、JNKS、p38MAPK表達(dá)水平比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.01。

p38MAPK 0.529±0.395 0.550±0.380 0.145±0.009*0.182±0.175*0.313±0.283*0.419±0.277*組別模型組陰性對照組西藥組樺褐孔菌醇提物高劑量組樺褐孔菌醇提物中劑量組樺褐孔菌醇提物低劑量組n6 6 6 6 6 6 Ras 0.365±0.018 0.365±0.018 0.079±0.011*0.106±0.008*0.148±0.017*0.231±0.014*JNKS 0.351±0.020 0.352±0.013 0.292±0.012*0.107±0.011*0.178±0.014*0.218±0.017*

3.2 PCR檢測BGC-823腫瘤細(xì)胞Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK的基因表達(dá)

與模型組比較，西藥組與高、中、低劑量組Raf-1、p38MAPK基因相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；與模型組比較，西藥組與高、中劑量組MEK、ERKs基因相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。見表3。

表3 各組Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK基因相對表達(dá)量比較（±s）

表3 各組Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK基因相對表達(dá)量比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.01。

p38MAPK 6.058±0.422 5.964±0.537 2.309±0.347*2.919±0.281*3.486±0.316*4.072±0.392*組別模型組陰性對照組西藥組高劑量組中劑量組低劑量組n5 5 5 5 5 5 Raf-1 1.271±0.092 1.252±0.082 0.653±0.065*0.814±0.067*0.962±0.074*1.059±0.091*MEK 0.081±0.008 0.079±0.007 0.041±0.004*0.054±0.005*0.063±0.008*0.069±0.005*ERKs 0.159±0.010 0.161±0.012 0.077±0.006*0.104±0.008*0.126±0.006*0.148±0.009

3.3 Western blot檢測BGC-823腫瘤細(xì)胞p-Raf-1、p-MEK、p-ERKs、p-p38MAPK蛋白表達(dá)

與模型組比較，西藥組與樺褐孔菌醇提物處理后高、中、低劑量組p-Raf-1、p-MEK、p-ERKs和pp38MAPK表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。見表4。

表4 各組p-Raf-1、p-MEK、p-ERKs、p-p38MAPK表達(dá)水平比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.01。

p-p38MAPK/GAPDH 0.889 3±0.034 7 0.896 3±0.020 4 0.146 1±0.009 7*0.189 2±0.005 9*0.573 2±0.024 6*0.785 3±0.011 3*組別模型組陰性對照組西藥組高劑量組中劑量組低劑量組n5 5 5 5 5 5 p-Raf-1/GAPDH 6.139 4±0.210 9 5.973 2±0.146 6 1.159 5±0.018 5*1.510 8±0.026 5*2.430 5±0.067 4*3.224 1±0.151 9*p-MEK/GAPDH 3.676 2±0.133 9 3.605 1±0.081 5 0.242 1±0.012 9*0.385±0.005 8*0.907 9±0.023 8*1.677 1±0.042 0*p-ERKs/GAPDH 3.094 6±0.089 4 2.954 9±0.080 0 0.364 6±0.009 9*0.469 6±0.005 0*1.508 5±0.039 5*2.296 4±0.033 1*

與模型組比較，樺褐孔菌醇提物處理后低、中、高劑量組和西藥組p-Raf、p-MEK、p-ERKs和pp38MAPK的蛋白表達(dá)逐漸減少，而Raf、MEK、ERK蛋白水平保持不變。見圖4。

圖4 各組p-Raf-1、Raf-1、p-MEK、MEK、p-ERKs、ERKs、p-p38MAPK蛋白表達(dá)圖

4 討論

本研究采用體內(nèi)與體外實驗相結(jié)合的方式進(jìn)行。體內(nèi)實驗采取免疫組織化學(xué)法檢測樺褐孔菌醇提物治療后的腫瘤中Ras、JNKS、p38MAPK蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，與模型組比較，各給藥組腫瘤組織中Ras、JNKS、p38MAPK蛋白的陽性表達(dá)降低。Ras的活化是MAPK途徑級聯(lián)反應(yīng)的第一步［9］，有研究表明，胃癌患者癌組織中Ras的表達(dá)明顯高于癌旁組織［10］。Ras活化后，與Raf結(jié)合，磷酸化后激活MAPK/ERK激酶（MAPK/ERK kinase）1和MAPK/ERK激酶2，MAPK/ERK激酶2活化Erk1和Erk2，移位至細(xì)胞核，作用于相關(guān)基因，促進(jìn)RNA的合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。JNKS是MAPK家族成員之一，可被炎癥因子、氧化損傷等多種因素激活，通過細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)在多種人類疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用［11］。在MAPK家族中，p38激酶在腫瘤中被發(fā)現(xiàn)有改變，對腫瘤的形成有負(fù)向調(diào)控作用［12］。體外實驗應(yīng)用PCR和Western blot檢測信號通路中的關(guān)鍵因子Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK。PCR結(jié)果表明，給藥組的腫瘤細(xì)胞中Raf-1、MEK、ERKs和p38MAPK表達(dá)水平降低，Western blot結(jié)果表明，各給藥組p-RAF-1、p-MEK、p-ERKs和p-p38MAPK表達(dá)水平降低。以上結(jié)果說明樺褐孔菌醇提物可能通過下調(diào)Ras、JNK、p38MAPK表達(dá)，抑制Ras/MAPK信號通路的活化，從而延緩胃癌病情發(fā)展。

樺褐孔菌是一種極具研究價值的藥食兩用大型真菌，在民間治療惡性腫瘤已有悠久歷史，可明顯抑制胃癌，防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)［13］。研究表明，樺褐孔菌提取物對多種惡性腫瘤有抑制作用［14］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌醇提物在體外可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)其可抑制胃癌荷瘤裸鼠的腫瘤生長速度［15］。本研究首次從Ras/MAPK信號通路角度探討樺褐孔菌醇提物的抗胃癌作用機(jī)制，為樺褐孔菌應(yīng)用于臨床治療胃癌提供了實驗依據(jù)，但本研究還存在著一定的局限性，如無法確定提取物中具體哪一種有效成分在發(fā)揮作用，實驗設(shè)計還有待完善，下一步計劃加入Ras/MAPK信號通路抑制劑驗證樺褐孔菌對胃癌的拮抗作用。