云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)在混合樣本檢驗(yàn)中的應(yīng)用

陳安琪

（1.復(fù)旦大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)系，上海 200032； 2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái) 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063）

混合樣本鑒定是法醫(yī)物證領(lǐng)域最為常見(jiàn)的難題之一[1-2]。 源于犯罪現(xiàn)場(chǎng)或涉及刑事糾紛（例如性侵、人身攻擊與謀殺等）的生物學(xué)檢材，其樣本均存在DNA 混合的情況[3-4]。 該類樣本在進(jìn)行基因分型時(shí)，可出現(xiàn)兩個(gè)或多個(gè)同性或異性貢獻(xiàn)者的DNA圖譜，給其中貢獻(xiàn)者的個(gè)體識(shí)別帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。 為克服混合樣本的鑒定困難，提高法醫(yī)工作者對(duì)混合樣本的檢測(cè)能力，越來(lái)越多的分子標(biāo)記借助二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)手段來(lái)解決混合樣本的鑒定問(wèn)題[5-6]。 雖然這些方法能夠在一定程度上解決混合樣本的拆分問(wèn)題，但其應(yīng)用依舊面臨兩大弊端：一方面，基于NGS 的方案將產(chǎn)出數(shù)量巨大的原始數(shù)據(jù)，其分析需要依賴強(qiáng)大的生信團(tuán)隊(duì)，故并不適用于普通法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；另一方面，這些依賴新技術(shù)的新型分子標(biāo)記沒(méi)有可供比對(duì)的人群數(shù)據(jù)庫(kù)，意味著在缺乏嫌疑人基因分型數(shù)據(jù)的情況下將很難鎖定罪犯，無(wú)法對(duì)案件偵破提供更具指向性的線索。

基于毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）的短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）分型方法（CE-STR）是當(dāng)今世界范圍內(nèi)公認(rèn)的法醫(yī)物證鑒定方法[7]，STR 具有高度多態(tài)性和顯著的個(gè)體間差異，許多國(guó)家都建立了基于STR 的人群數(shù)據(jù)庫(kù)[8]。 因此，開(kāi)發(fā)一款以法醫(yī)常用STR 分子標(biāo)記為目標(biāo)的窗口化分析系統(tǒng)極具價(jià)值。 云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)是一項(xiàng)基于全連續(xù)法概率分型的軟件[9]，相較于其他常用概率模型（如：二進(jìn)制法、半連續(xù)法），其更為全面地考量了影響STR 準(zhǔn)確檢出的各種因素（如：峰值變異性、混合比例及stutter 峰等），通過(guò)分析圖譜中的全部信息，以概率的形式給出可能的分型結(jié)果。 全連續(xù)法概率模型是目前領(lǐng)先的混合圖譜拆分方法，該分析系統(tǒng)或許是一個(gè)可靠的混合樣本分析系統(tǒng)。 為探究該分析系統(tǒng)對(duì)混合樣本的拆分能力，本研究應(yīng)用Power-Plex21R○基因分型試劑盒對(duì)13 例2～3 人混合樣本進(jìn)行了STR 分型，觀察了其在預(yù)設(shè)閾值條件下的分型情況，探究了云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)對(duì)模擬混合樣本的基因型拆分情況。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用DNA 樣本源于5 名已知基因型的無(wú)關(guān)個(gè)體，模擬混合樣本按以下比例（表1）進(jìn)行混合。

表1 混合樣本概況

1.2 方法

1.2.1 STR 分型

采用Power-Plex21R○試劑盒（美國(guó)Promega 公司）對(duì)13 例混合DNA 樣本進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用3130XL 型遺傳分析儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型檢測(cè)，STR 基因座分型結(jié)果用GeneMapper ID-X 軟件（美國(guó)Applied Biosystems公司）在試劑盒預(yù)設(shè)的默認(rèn)閾值下進(jìn)行分析。

1.2.2 基于云算GPM 分析系統(tǒng)的混合圖譜分析

將毛細(xì)管電泳輸出的“FSA”格式原始文件導(dǎo)入云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)（北京瑞源文德科技有限公司），并在軟件內(nèi)部完成STR 分型分析。為減少人工判讀誤差對(duì)后續(xù)軟件分析的影響，本研究以混合樣本理論上的分型結(jié)果作為參考，對(duì)混合圖譜上的等位基因應(yīng)標(biāo)盡標(biāo)，繼而進(jìn)行下游的混合圖譜拆分分析。

2 結(jié)果

2.1 混合樣本的基因型檢出情況

本研究利用Power-Plex21R○試劑盒檢測(cè)了13例混合樣本的基因分型情況。 在系統(tǒng)預(yù)設(shè)的默認(rèn)閾值條件下，其基因型檢出情況與預(yù)期結(jié)果存在較大差異。 如圖1 所示，絕大多數(shù)基因座的分型結(jié)果均不符合預(yù)期。 在基因座水平上，Amel 的基因型一致性最高，高達(dá)100%（13/13），TH01 次之（92.31%，12/13），D3S1358 位列第三（69.23 %，9/13）。 D13S317 與D16S539 是檢出一致性最低的基因座，僅為7.68%（1/13）。 在樣本水平上，多數(shù)樣本僅有1/4～1/5 的等位基因分型結(jié)果與預(yù)期相符， 樣本9 的分型結(jié)果一致性最高，約為76.19%（16/21）。 此外，樣本12、樣本10 和樣本6 的分型一致性同樣相對(duì)較高，分別為52.38%（11/21）、47.62%（10/21）和38.10%（8/21）。

圖1 混合樣本基因型的預(yù)期分型與實(shí)際檢出情況的比較

2.2 基于云算GPM 的混合圖譜拆分

云算GPM 分析系統(tǒng)可對(duì)混合圖譜的基因型進(jìn)行拆分，結(jié)果如圖2 所示（紅色表示分型結(jié)果完全不符合預(yù)期；橙色表示分型結(jié)果有部分符合預(yù)期；綠色表示分型結(jié)果與預(yù)期完全相同）。 13 例混合圖譜均可被成功拆分，除樣本1 的主要貢獻(xiàn)者與次要貢獻(xiàn)者的基因型拆分結(jié)果完全正確外，其他樣本的基因型結(jié)果均存在一定的誤差。 其中，主要貢獻(xiàn)者的檢出情況較為準(zhǔn)確，僅樣本3 存在一個(gè)基因座（D12S391）的分型錯(cuò)誤，約6.54%（18/273）的基因座分型存在拆分結(jié)果錯(cuò)誤的情況，絕大多數(shù)基因座（93.04%，254/273）的分型結(jié)果完全正確[圖2（a）]。在次要貢獻(xiàn)者的等位基因檢出方面，其總體分型準(zhǔn)確率遠(yuǎn)不如主要貢獻(xiàn)者。 15 個(gè)次要貢獻(xiàn)者共產(chǎn)生315 個(gè)基因座分型結(jié)果，約50.48%（159/315）的次要貢獻(xiàn)者的基因型完全正確，約41.59%（131/315）的基因型僅有部分滿足預(yù)期，約7.94%（25/315）的分型結(jié)果是完全錯(cuò)誤的[圖2（b）]。

圖2 基于云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)的混合樣本基因型拆分結(jié)果

總體來(lái)看，雖然各基因座的分型正確的個(gè)數(shù)均占多數(shù)，但不同基因座水平間的拆分結(jié)果準(zhǔn)確性仍存在差異。 D7S820 是基因型拆分準(zhǔn)確率最高的基因座（89.29%，25/28），Amel 次之（85.71%，24/28），TH01 位列第三（85.71%，24/28）。 除以上3 個(gè)基因座之外，還有其他9 個(gè)基因座（D3S1358、D1S1656、D6S1043、D13S317、Penta E、D2S1338、CSF1PO、D5S818和FGA）的準(zhǔn)確率均在70%以上。 其中，Amel、D3S1358、D13S317、TH01 和vWA 沒(méi)有分型完全錯(cuò)誤的情況發(fā)生。與此同時(shí)，基因型拆分結(jié)果較差的基因座分別為D18S51、TPOX 和D12S391（圖3）。

圖3 混合圖譜基因型拆分結(jié)果在基因座水平的表現(xiàn)

2.3 weight 值與分型結(jié)果的可靠性分析

為確保拆分結(jié)果的準(zhǔn)確性，云算GPM 分析系統(tǒng)采用預(yù)設(shè)weight 值（權(quán)重）衡量所得基因型的可靠性。 本研究結(jié)果中，weight 值在90%以上的基因座有267 個(gè)，占總數(shù)的41.01%（267/651），其中，分型完全正確的基因座、部分正確的基因座和完全錯(cuò)誤的基因座所占比例分別為99.63%（266/267）、0.37%（1/267）和0%（0/267）。值得注意的是，并非所有正確分型的基因座weight 值均大于90%?；蜃中屯耆_、部分正確和完全錯(cuò)誤這3 種情況所對(duì)應(yīng)的weight 平均值分別為82.36 %±24.68 %、40.22%±16.56%和35.12%±18.24%[圖4（a）]。為進(jìn)一步分析各分型結(jié)果下的weight 值分布情況，本研究對(duì)各分型結(jié)果下的基因座數(shù)進(jìn)行了基于該頻率的擬合分析[圖4（b）]。 結(jié)果顯示，3 種分型結(jié)果在weight 值低于90 %時(shí)，均存在一定的交疊，雖然weight 值越低，其歸屬于錯(cuò)誤分型的可能性越高，但無(wú)法完全根據(jù)某一weight 值作出結(jié)果是完全正確、部分正確或是完全錯(cuò)誤的推斷。

圖4 混合圖譜基因型拆分結(jié)果與weight 值的關(guān)系

3 討論

混合樣本的鑒定一直以來(lái)都是司法鑒定的重點(diǎn)與難點(diǎn)，其基因分型的成功拆分將為后續(xù)的案件偵破提供有效證據(jù)與線索[2]。 雖然用于混合樣本基因型檢測(cè)的方案層出不窮，但基于STR 分子標(biāo)記的窗口化分析系統(tǒng)卻較為少見(jiàn)。 STRmix 和云算GPM分析系統(tǒng)是目前較為成熟的混合樣本拆分系統(tǒng)，李甫等[9]曾對(duì)這兩種分析系統(tǒng)進(jìn)行了比較，認(rèn)為兩者均可用于混合樣本的拆分，但其結(jié)果存在一定差異。 上述研究的樣本來(lái)源多限于真實(shí)案件樣本，缺乏對(duì)已知組分的模擬混合DNA 研究，因而難以確定檢測(cè)系統(tǒng)的正確性。 為進(jìn)一步探究云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)在混合樣本檢驗(yàn)中的表現(xiàn)，本研究模擬了13 例2～3 人DNA 混合樣本，并用經(jīng)過(guò)廣泛驗(yàn)證的Power-Plex21R○試劑盒[10-14]對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。為確保分型數(shù)據(jù)的有效性，避免因DNA 不足而導(dǎo)致的等位基因丟失，本研究中所有次要貢獻(xiàn)者的投入量均高于其最低檢出限（50 pg[11]）。 由于該試劑盒的主要檢測(cè)對(duì)象為單一來(lái)源樣本，因此其系統(tǒng)內(nèi)置的分析閾值在混合樣本的結(jié)果輸出上或許并不準(zhǔn)確。 不出所料，在Power-Plex21R○試劑盒預(yù)設(shè)的默認(rèn)閾值條件下，絕大多數(shù)的基因型均與預(yù)期不同（圖1）。 在對(duì)這21 個(gè)基因座的分型分析中發(fā)現(xiàn)，不同等位基因間的分型一致性存在差異。 所有Amel的基因型均符合預(yù)期，TH01 與D3S1358 的分型一致性同樣較高，分別為92.31 %和69.23 %，而D13S317 與D16S539 的一致性卻僅為7.68%。 基于人類遺傳基本規(guī)律，正常人的Amel 分型結(jié)果僅可能是XX、XY 的一種，故而推測(cè)本研究中STR 分型的一致性差異或與基因座的遺傳多態(tài)性相關(guān)。 有研究[15]表明，D13S317 與D16S539 的多態(tài)信息量（polymorphism information content，PIC）分別為0.794 3 和0.791 7，約是TH01（PIC 為0.603 6）與D3S1358（PIC為0.649 1）的1.22～1.32 倍，提示TH01 與D3S1358的高一致性極有可能是由該基因座有限的基因型組合所致。 對(duì)于多數(shù)混合樣本而言，僅有約20%的基因座分型結(jié)果一致，然而樣本9、樣本12、樣本10和樣本6 中分型一致的基因座數(shù)卻遠(yuǎn)高于平均水平。 由于以上4 例樣本的投入量均為5 ng，因此可排除因投入量差異而帶來(lái)的分型差異。 在混合比例方面，由于以上3 個(gè)混合樣本的混合比例相對(duì)均衡，故而其主要貢獻(xiàn)者與次要貢獻(xiàn)者的信號(hào)也相對(duì)均衡，不易被占比高的組分所掩蓋，這可能是造成其在默認(rèn)閾值下一致性相對(duì)較高的原因。 用于CESTR 分型檢測(cè)的試劑盒有很多，絕大多數(shù)的CESTR 檢測(cè)均是服務(wù)于單一來(lái)源DNA，而非混合樣本。使用默認(rèn)閾值下的分析結(jié)果，必然會(huì)存在次要等位基因被覆蓋的偏差。 因此，混合圖譜的基因型認(rèn)定依舊非常依賴法醫(yī)工作者的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)。

由于云算GPM 分析系統(tǒng)主要依賴于研究人員對(duì)混合圖譜的基因型認(rèn)定，而混合DNA 的等位基因認(rèn)定對(duì)于結(jié)果拆分的正確性起著至關(guān)重要的作用。 為排除人工誤差，并最大限度地測(cè)試云算GPM分析系統(tǒng)的去卷積能力，本研究根據(jù)預(yù)期的DNA混合圖譜結(jié)果對(duì)電泳圖譜進(jìn)行注釋，以期探究其對(duì)主要貢獻(xiàn)者和次要貢獻(xiàn)者的基因型識(shí)別情況。 結(jié)果顯示，混合圖譜的拆分結(jié)果并不能確保100%的準(zhǔn)確性，在13 例混合樣本中，除樣本1 的拆分結(jié)果完全正確外，其他混合樣本或多或少均存在差錯(cuò)（圖3）。主要貢獻(xiàn)者的總體分型準(zhǔn)確率（93.04%）高于次要貢獻(xiàn)者（50.48%），該結(jié)果與常識(shí)相符，主要貢獻(xiàn)者因其投入量高的原因，信號(hào)也往往更強(qiáng)，能提供更為確切的信息[16-17]。

在法醫(yī)實(shí)踐中，拆分所得的基因型往往有同罪犯數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的需求，因此，用于比對(duì)的基因座分型正確性對(duì)于嫌疑目標(biāo)的篩選至關(guān)重要?；蜃谌后w遺傳學(xué)中的多態(tài)性及其在特定檢測(cè)試劑盒中的性能表現(xiàn)，造成了其拆分的難易度存在差異。本研究中，各基因座拆分后的準(zhǔn)確率顯示出了明顯的差異，基因型拆分準(zhǔn)確性最高的基因座是D7S820，其準(zhǔn)確率（89.29%）約為最低者（D21S11 和D12S391，53.57%）的1.67 倍（圖3），這提示某些基因座或許不適用于混合樣本的檢測(cè)。 如法醫(yī)工作人員有進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的必要，則可優(yōu)先選擇weight 值較高的基因型，避免因基因型的拆分差錯(cuò)而導(dǎo)致嫌疑人篩查錯(cuò)誤。 就如何判斷已拆分基因分型的正確與否，云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)內(nèi)置的weight 值可用于判斷結(jié)果的可靠性，一般而言，weight 值大于90%被認(rèn)為是分型結(jié)果可靠的指標(biāo)[18]。 本研究中，各分型結(jié)果的weight 值存在差異，分型完全正確的基因座weight 值最高，部分正確與完全錯(cuò)誤的基因座weight 值均較低，且這兩者間的差異也相對(duì)較小[圖4（a）]。 與此同時(shí)，基于weight值的頻率分布圖也顯示絕大多數(shù)weight 值大于90%的分型結(jié)果是完全正確的[圖4（b）]。 以上結(jié)果表明，區(qū)分基因座分型結(jié)果完全正確者相對(duì)較易，weight 值大于90%是基因分型正確的既不充分也不必要條件。

4 結(jié)論

服務(wù)于單一來(lái)源樣本的STR 分型檢測(cè)試劑盒對(duì)混合樣本的分型幫助有限，現(xiàn)有的混合樣本拆分軟件也不能解決混合圖譜中的基因型認(rèn)定問(wèn)題，混合樣本中的等位基因識(shí)別仍舊高度依賴法醫(yī)工作者的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)。 基因分型的準(zhǔn)確與否與該貢獻(xiàn)者的占比存在相關(guān)性，weight 值大于90%是一個(gè)相對(duì)可靠的分型結(jié)果評(píng)價(jià)指標(biāo)。 由于多數(shù)樣本并未達(dá)到100%的分型一致性， 因此在有參考數(shù)據(jù)庫(kù)的情況下，選擇weight 值較高的基因座進(jìn)行嫌疑人的篩選或許是最佳選擇。 綜上，本研究測(cè)試了云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)對(duì)混合樣本基因型拆分的結(jié)果，探討了該系統(tǒng)在混合樣本基因型拆分上的可靠性，可為云算GPM 混合圖譜分析系統(tǒng)的使用及未來(lái)優(yōu)化提供參考數(shù)據(jù)。