多脂鱗傘P-YD01的菌絲生物學(xué)特性及引種馴化栽培試驗(yàn)

吳耀越,程欣榮,黃宇柯,朱仁啟,陳文思,張大川,初洋

多脂鱗傘P-YD01的菌絲生物學(xué)特性及引種馴化栽培試驗(yàn)

吳耀越,程欣榮,黃宇柯,朱仁啟,陳文思,張大川,初洋*

煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺 264005

對采自煙臺大學(xué)校園的一株多脂鱗傘(P-YD01)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)及ITS序列分析鑒定，并對其菌絲生物學(xué)特性、最佳培養(yǎng)基配方及馴化栽培進(jìn)行等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，P-YD01的最適碳源、氮源分別為D-果糖、牛肉膏，最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃-30 ℃，最適生長pH在5.0。研究發(fā)現(xiàn)P-YD01以玉米粉作為母種培養(yǎng)基時(shí)生長最快，最適出菇季節(jié)應(yīng)為秋冬季，最適栽培培養(yǎng)基為棉籽殼培養(yǎng)基。搔菌操作可以明顯提高多脂鱗傘其出原基整齊度和子實(shí)體勻稱度。

多脂鱗傘; 菌絲生物學(xué)特性; 培養(yǎng)基; 馴化; 栽培

大型真菌，又稱蕈菌，在自然界中種類繁多，分布廣泛，且具有豐富營養(yǎng)[1,2]。同時(shí)，許多野生大型真菌具有藥用價(jià)值，可用于治療疾病和提高免疫力[3]。野生菌的采摘、加工和銷售都是一種重要的產(chǎn)業(yè)，可創(chuàng)造就業(yè)機(jī)會和增加經(jīng)濟(jì)收入[4].

多脂鱗傘是鱗傘屬（）的一種大型真菌，具有豐富的營養(yǎng)，是一種高蛋白低脂肪的健康食品[5]。此外，多脂鱗傘還有較高的藥用價(jià)值。Peng Deng等在其胞內(nèi)多糖的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)多脂鱗傘胞內(nèi)多糖是一種有潛力的可增強(qiáng)特異性免疫的抗氧化劑[6]；賀智杰等同樣發(fā)現(xiàn)多脂鱗傘具有良好的抗氧化活性和對小鼠免疫的調(diào)節(jié)功能[7]；Basaran Dulger探究了多脂鱗傘提取物的抗菌活性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其60%甲醇提取物對包括大腸桿菌（）、枯草芽孢桿菌（）在內(nèi)的六種細(xì)菌以及兩種酵母具有抑制作用[8]；多脂鱗傘的多糖成分和麥角固醇類衍生物被證實(shí)具有抗糖尿病活性[9,10]；另外，其多糖亦對小鼠H22肝癌細(xì)胞具有抑制作用[11]。提取自多脂鱗傘的多種酶類，亦在生產(chǎn)上可發(fā)揮重要作用[12,13]。

關(guān)于多脂鱗傘的栽培研究，國內(nèi)最早可檢索到楊占國等和苗長海在1985年進(jìn)行的試驗(yàn)[14,15]?？傮w來看，相關(guān)研究較少且大多集中在較為基礎(chǔ)的菌絲生物學(xué)特性方面[16-18]，但關(guān)于具體栽培技術(shù)研究較少且不夠深入。本文在研究了菌絲生物特性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究其具體栽培技術(shù)，并將菌絲生物學(xué)研究的成果與栽培技術(shù)相融合。旨在探明完整且較優(yōu)的多脂鱗傘栽培體系，一定程度上填補(bǔ)了相關(guān)栽培技術(shù)的空白。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生多脂鱗傘采自于煙臺大學(xué)校園中的一棵柳樹上。組織分離后保存菌種，編號為P-YD01。

1.2 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方:葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂20 g，KH2PO40.5 g，MgSO4?7H2O 1 g，K2HPO4?3H2O 1 g，水1000 mL。

1.2.2 母種實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基①土豆培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g；②土豆綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.5 g；③玉米粉培養(yǎng)基：玉米粉40 g，氮源1 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.5 g。

④棉籽殼培養(yǎng)基：棉籽殼100 g，麥麩10 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.5 g。以上各配方均加入最適碳源20 g，瓊脂20 g，水1000 mL[19]。

1.2.3 栽培培養(yǎng)基a. 棉籽殼培養(yǎng)基：78%棉籽殼；b. 雜木屑棉籽殼培養(yǎng)基：39%雜木屑、39%棉籽殼；c. 柳木屑培養(yǎng)基：78%柳木屑。以上各配方均添加20%麥麩，1%蔗糖，1%石膏。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

參照《中國大型真菌》描述[20]，通過觀察P-YD01的子實(shí)體形態(tài)、孢子印、菌絲及孢子的形態(tài)、菌絲間的鎖狀聯(lián)合和分生孢子等顯微結(jié)構(gòu)。根據(jù)這些特征，進(jìn)行了初步的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 分子標(biāo)記鑒定

使用CTAB法提取DNA后用引物ITS1(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’)，ITS4(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’)對其中ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，ddH2O 10.44 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP(10 mmol/L) 0.1 μL，MgCl21.2 μL，ITS1(2 μmol/L)與ITS4(2 μmol/L)各2 μL，TaqE 0. 26 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，開始循環(huán)，94 ℃變性50 s，50 ℃退火45 s，72 ℃復(fù)性50 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。經(jīng)電泳檢驗(yàn)后，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至華大基因測序部進(jìn)行克隆測序，將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站基因庫中的有關(guān)ITS片段進(jìn)行比對，分析確定野生真菌的種類。

1.5 菌絲生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)

碳源實(shí)驗(yàn)分別以蔗糖、D-果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖(CK)；氮源實(shí)驗(yàn)分別以酵母浸膏、牛肉膏、硫酸銨、硝酸銨替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨(CK)。溫度實(shí)驗(yàn)以基礎(chǔ)培養(yǎng)基接種后分別于5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基pH實(shí)驗(yàn)分別以HCl和NaOH調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。每種處理重復(fù)5次。在培養(yǎng)期間，先后于培養(yǎng)第2 d和第10 d對接種后平板的菌絲生長情況進(jìn)行菌絲生長劃線，采用十字交叉法測兩次劃線時(shí)的菌絲生長半徑差值以計(jì)算菌絲生長速度，并觀察菌絲長勢。

1.6 母種培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

母種培養(yǎng)基所使用碳源、氮源、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH皆為1.5實(shí)驗(yàn)中生長速率最快的處理。每種處理重復(fù)5次。

1.7 栽培培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

按照1.2.3中的配方按料水比1:1.4進(jìn)行拌料裝袋，每袋折合干料400 g，滅菌接種等按常規(guī)，接種后25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)期間先后劃線記錄菌絲生長情況，測量和記錄菌絲生長速度，菌絲滿袋后轉(zhuǎn)入菇房出菇管理按常規(guī)，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)兩潮菇產(chǎn)量。培養(yǎng)期間先后劃線記錄菌絲生長情況，測量和記錄菌絲生長速度及產(chǎn)量。每種處理重復(fù)10次。

1.8 出菇季節(jié)實(shí)驗(yàn)

出菇季節(jié)實(shí)驗(yàn)選擇春季和秋季，培養(yǎng)基為1.2.3中提到的培養(yǎng)基a，菇房采用自然溫度，人工控制濕度在90%左右，通風(fēng)等其他管理按常規(guī)。其中，春季出菇實(shí)驗(yàn)在3月中旬接種，4月中旬開袋，5下旬及6月上旬出菇，出菇時(shí)期室內(nèi)溫度在25 ℃左右；秋季出菇實(shí)驗(yàn)9月中旬接種，10月中旬開袋，11月中旬出菇，出菇時(shí)期室內(nèi)溫度在15 ℃左右。

1.9 搔菌出菇對照實(shí)驗(yàn)

搔菌出菇實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基選取及培養(yǎng)步驟同1.8。移至菇房后，對照組正常開袋出菇，搔菌組開袋后用鑷子刮去老舊菌絲后出菇。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定參照《中國大型真菌》[20]初步確定P-YD01是多脂鱗傘()，屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、球蓋菇科、鱗傘屬。如圖1所示，該真菌菌蓋和菌柄呈黃色，菌蓋呈凸透鏡形，表面具粘液和三角形鱗片，平均菌蓋直徑6.7 cm；菌柄具鱗片，實(shí)心，無菌托，菌柄中生，平均菌柄長6.1 cm，平均菌柄粗1.1 cm；菌褶呈褐色，不等長，密度中，延生；菌褶呈輻射狀排列，產(chǎn)生孢子量較大，孢子印印跡清晰，孢子銹色，表面光滑橢圓形，平均長度10 μm，平均寬度5 μm。擔(dān)子呈棒狀具四個(gè)擔(dān)子梗，囊狀體紡錘形。菌絲具有鎖狀聯(lián)合，隔膜清晰。菌絲生長時(shí)間長會產(chǎn)生分生孢子。

(注: ①. 子實(shí)體 ②. 孢子印 A. 擔(dān)子體 B. 囊狀體 C. 鎖狀聯(lián)合 D. 隔膜 E. 孢子 F. 分生孢子)

2.1.2 序列分析及鑒定經(jīng)電泳檢驗(yàn)，所得產(chǎn)物片段大小為700 bp左右(圖2)。將擴(kuò)增后的ITS片段產(chǎn)物送至華大基因測序部進(jìn)行克隆測序，測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站基因庫中的有關(guān)ITS片段進(jìn)行BLAST比對，與NCBI登錄號810180.1的比對結(jié)果最相近。樣本的值顯示其與鱗傘屬()中的多脂鱗傘的同源性最高，最終確定P-YD01為多脂鱗傘。

圖 2 ITS序列PCR電泳結(jié)果

2.2 菌絲生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)

由表1-4可知，當(dāng)多脂鱗傘以D-果糖為碳源時(shí)，與除麥芽糖外的其它實(shí)驗(yàn)組存在顯著性差異。且D-果糖組菌絲極濃密；當(dāng)多脂鱗傘以牛肉膏為氮源時(shí)，與除硫酸銨外的其它實(shí)驗(yàn)組存在顯著性差異。菌絲濃密程度上，酵母浸粉組菌絲極濃密，牛肉膏組濃密；當(dāng)多脂鱗傘在25 ℃、30 ℃恒溫環(huán)境下菌絲生長速率與其他恒溫環(huán)境條件下的菌絲生長速率存在顯著性差異。且溫度為25 ℃實(shí)驗(yàn)組菌絲濃密；多脂鱗傘菌絲在不同pH培養(yǎng)基中隨著pH升高生長速度減慢，長勢最好的是pH5.0，與pH7-9有顯著差異。且pH為5.0、6.0時(shí)菌絲濃密。因此，最適碳源為D-果糖，最適氮源為牛肉膏，最適培養(yǎng)溫度設(shè)置為25 ℃，最適pH為5.0。

表 1 不同碳源對菌絲生長速度的影響

表 2 不同氮源對菌絲生長速度的影響

表 3 不同溫度對菌絲生長速度的影響

表 4 不同pH對菌絲生長速度的影響

2.3 母種培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

如圖3所示，當(dāng)多脂鱗傘以玉米粉培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基時(shí)菌絲生長速度最快，與其它種類培養(yǎng)基存在極顯著性差異。應(yīng)以玉米粉培養(yǎng)基作為最適母種培養(yǎng)基。

圖 3 多脂鱗傘母種培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

2.4 出菇實(shí)驗(yàn)

2.4.1 出菇季節(jié)實(shí)驗(yàn)分析中對秋季和春季出菇的生物學(xué)效率進(jìn)行了獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，結(jié)果顯示秋冬季出菇與春季出菇的生物學(xué)效率存在顯著性差異(<0.05)，秋冬季更適合栽培多脂鱗傘(圖4)。

圖 4 多脂鱗傘栽培季節(jié)實(shí)驗(yàn)

2.4.2 栽培培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示，多脂鱗傘在在以棉籽殼為栽培培養(yǎng)基時(shí)，菌絲生物學(xué)效率最高，與其它種類培養(yǎng)基存在極顯著性差異(圖5)。棉籽殼培養(yǎng)基適合作為最佳栽培培養(yǎng)基。

圖 5 各種類培養(yǎng)基菌絲平均生物學(xué)效率

2.4.3 搔菌出菇實(shí)驗(yàn)由表5可見，搔菌可將出原基時(shí)間提前，但經(jīng)過獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，未見顯著性差異(>0.05)說明搔菌操作對多脂鱗傘出原基時(shí)間沒有顯著影響。通過對產(chǎn)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，搔菌較對照組產(chǎn)量有些微增長，未見顯著性差異，因此搔菌對產(chǎn)量提升不顯著。但由圖6、7(圖6搔菌、圖7搔菌)可見搔菌可以明顯改善原基及子實(shí)體整齊度，對子實(shí)體商品性有較大改善，因此建議搔菌。搔菌對出菇的影響還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，其機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。

表 5 多脂鱗傘搔菌實(shí)驗(yàn)

圖 6 對照

圖 7 搔菌

3 討論

多脂鱗傘在我國北方較為常見，多生長于柳樹上，是一種較為優(yōu)質(zhì)的野生菌[21-25]。不同地區(qū)的多脂鱗傘其生物學(xué)特性存在差異。本實(shí)驗(yàn)所用P-YD01菌種其最適碳源、氮源實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同[22,24]。菌絲最適生長溫度與大多數(shù)研究結(jié)果一致。菌絲最適培養(yǎng)pH與煙臺地區(qū)曾做過的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，但與其他地區(qū)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果稍有差異[16,22]。推測以上差異可能是由不同地區(qū)的生境所導(dǎo)致的，詳細(xì)機(jī)理有待進(jìn)一步研究[16,22]。

多脂鱗傘的最適母種培養(yǎng)基為玉米粉培養(yǎng)基。多脂鱗傘屬于中低溫食用菌，春夏季栽培會出現(xiàn)嚴(yán)重的病蟲害和霉菌污染，造成第二次出菇量銳減，嚴(yán)重者無法二次出菇；在秋季和初冬，溫度在15 ℃左右，尚能滿足多脂鱗傘出菇需要，且該溫度下病蟲害較少，因此最適出菇季節(jié)應(yīng)為秋冬季。雖然野生多脂鱗傘一般都生長在柳樹上，但本實(shí)驗(yàn)用柳木屑做培養(yǎng)基產(chǎn)量顯著低于棉籽殼，可能是棉籽殼的營養(yǎng)成分及通氣含水量等優(yōu)于柳木屑。搔菌操作對于某些種類食用菌具有縮短出原基時(shí)間、提高出原基整齊度和使子實(shí)體更勻稱等作用[26,27]，在本實(shí)驗(yàn)中對于多脂鱗傘僅使其出原基整齊度和子實(shí)體勻稱度得到提升，未明顯縮短出原基時(shí)間。

雖然多脂鱗傘馴化栽培成功已經(jīng)30多年[15]，但其商品化推廣和大面積栽培并不像杏鮑菇、真姬菇、茶樹菇等新興食用菌一樣成功，至少目前在煙臺的市場上沒有銷售，因此多脂鱗傘的推廣及工廠化栽培等是急需解決的問題。

[1] 李泰,盧士軍,孫君茂,等.26種常見市售食用菌營養(yǎng)成分分析及評價(jià)[J].中國食用菌,2021,40(12):66-72

[2] 文春玉,徐明,楊云禮,等.我國野生食用菌營養(yǎng)成分與價(jià)值評價(jià)研究進(jìn)展[J].中國食用菌,2021,40(11):1-10

[3] 張志昌,楊慧,顧昌華,等.“森林黃金”桑黃的多功能研究進(jìn)展綜述[J].黑龍江糧食,2021(6):93-94

[4] 李美嬌.野生菌轉(zhuǎn)型升級新景象[J].致富天地,2016(7):9-10

[5] 陳潤臣,王藝凝,劉瀟文,等.一株野生多脂鱗傘的鑒定、人工栽培與營養(yǎng)成分分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2021,33(12):2330-2338

[6] Deng P, Zhang G, Zhou B,. Extraction and in vitro antioxidant activity of intracellular polysaccharide by Pholiota adiposa SX-02 [J]. J Biosci Bioeng, 2011,111(1):50-54

[7] 賀智杰,陳乙文,劉倩,等.多脂鱗傘的抗氧化活性及對小鼠免疫功能的影響[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2023(1):62-66

[8] Dulger B. Antimicrobial activity of the macrofungus Pholiota adiposa [J]. Fitoterapia, 2004,75(3-4):395-397

[9] Wang XY, Jiang S, Liu Y. Anti-diabetic effects of fungal Ergosta-4,6,8(14), 22-tetraen-3-one from Pholiota adiposa [J]. Steroids, 2023,192:109185

[10] 李春怡,王曉巖.多脂鱗傘多糖提取物對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠抗糖尿病活性[J].菌物學(xué)報(bào),2022,41(7):1112-1122

[11] 王曉巖,李剛,孔凡麗.多脂鱗傘多糖對H22荷瘤小鼠抗腫瘤作用[J].食用菌學(xué)報(bào),2023,30(1):45-52

[12] Jagtap SS, Dhiman SS, Kim T,. Characterization of a β-1,4-glucosidase from a newly isolated strain ofand its application to the hydrolysis of biomass [J]. Biomass and Bioenergy, 2013,54:181-190

[13] Jagtap SS, Dhiman SS, Jeya M,. Saccharification of poplar biomass by using lignocellulases from[J]. Bioresource Technology, 2012,120:264-272

[14] 趙占國,楊秀蘭.多脂鱗傘的人工栽培[J].食用菌,1985(3):18

[15] 苗長海.黃傘及其人工馴化[J].食用菌,1985(1):12

[16] 王歡,圖力古爾.三種鱗傘屬(Pholiota)真菌的菌絲生物學(xué)特性初步研究[J].菌物研究,2006(2):6-10

[17] 馮連榮,張妍,趙鑫聞,等.一株野生黃傘的菌種分離、鑒定及生物學(xué)特性[J].北方園藝,2022(21):115-122

[18] 陳潤臣,王藝凝,劉瀟文,等.一株野生多脂鱗傘的鑒定、人工栽培與營養(yǎng)成分分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2021,33(12):2330-2338

[19] 倪新江,梁麗琨,初洋,等.巴西蘑菇母種培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)[J].食用菌,2002(3):23

[20] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社,2000

[21] 增野和彥,趙銘.多脂鱗傘馴化栽培試驗(yàn)[J].中國食用菌,1997(5):21-22

[22] 陳潤臣,王藝凝,劉瀟文,等.一株野生多脂鱗傘的鑒定、人工栽培與營養(yǎng)成分分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2021,33(12):2330-2338

[23] 苗長海.多脂鱗傘人工栽培研究初報(bào)[J].中國食用菌,1986(6):10-11

[24] 劉淼,林辰壹,曹艷,等.新疆多脂鱗傘對不同氮源物質(zhì)的多樣性利用特征[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,54(4):827-830

[25] 闕志英.一株野生食用菌多脂鱗傘的形態(tài)特征與馴化[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1992(4):64-65

[27] 張玉亭,袁瑞奇,孔維麗,等.不同搔菌方式對瓶栽工藝白靈菇子實(shí)體形成的影響[J].中國食用菌,2017,36(1):84-85

[28] 劉乃旭,顏正飛,何欣,等.不同搔菌方式對杏鮑菇菌絲恢復(fù)的影響研究[J].食藥用菌,2016,24(4):252-255

Mycelial Biological Characteristics and Domestication, Cultivation Experiment ofP-YD01

WU Yao-yue, CHENG Xin-rong, HUANG Yu-ke, ZHU Ren-qi, CHEN Wen-si, ZHANG Da-chun, CHU Yang*

264005,

A strain of(P-YD01) taken from the campus of Yantai University was analyzed and identified by morphological identification and ITS sequence analysis, and its mycelial biological characteristics, optimal medium formulation and domestication and cultivation were studied. The results show that the optimal carbon and nitrogen sources of P-YD01 are D-fructose and beef extract, and the optimal culture temperature is 25°C-30°C, and the optimal growth pH is at 5.0. It is found that P-YD01 grows fastest in cornmeal primary medium, the optimal mushroom season should be fall, and the optimal cultivation medium is cottonseed shell medium. In addition, scratching mycelium operation forcan significantly improve its primodium emergence neatness and fruiting body homogeneity.

; mycelial biological characteristic; culture medium; domestication; cultivation

S736.15

A

1000-2324(2023)05-0650-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.05.002

2023-07-17

2023-11-11

煙臺大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)踐訓(xùn)練計(jì)劃(X202211066081)

吳耀越(2001-),男,本科生在讀,研究方向?yàn)槭秤镁耘? E-mail:Leripot@163. com

Author for correspondence. E-mail:chuyangytu@ytu.edu.cn