補腎壯骨方通過EphB4/Ephrin-B2 軸緩解絕經后骨質疏松

吳志明 袁振興 勒春 曹正柳 萬欣 周易芬 張鵬 （.南昌大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科 南昌 0000；.九江市第六人民醫(yī)院中醫(yī)科 江西 九江 000；.南昌大學第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科 南昌 0000）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMO）主要表現(xiàn)為絕經后老年女性骨量減少，骨結構變化引起髖關節(jié)及椎體壓縮性骨折等［1-2］。PMO使老年人骨折風險﹑致殘風險及死亡率顯著升高，增加公共衛(wèi)生負擔［3］。雌激素替代療法是預防和治療PMO 進展和降低骨折風險的現(xiàn)代醫(yī)學經典的治療方法［4］。然而，雌激素替代療法可能導致乳腺癌﹑婦科腫瘤及冠心病等心血管疾病的發(fā)生［5］。因此，急需尋找療效較佳﹑副作用較小的天然替代品預防和治療骨質疏松引起的骨質流失和骨折風險。補腎壯骨方組成為生地黃15 g，知母15 g，補骨脂12 g，巴戟天12 g，淫羊藿15 g，枸杞子12 g，酸棗仁10 g，黃柏10 g,具有補腎寧心，燮理陰陽的功能。其不僅能有效地改善圍絕經期婦女的神經癥狀，同時對絕經后骨質疏松有良好的防治作用。預試驗結果發(fā)現(xiàn)圍絕經期婦女在口服補腎壯骨方后，外周血雌激素（estrogen 2，E2）水平無明顯變化，Th 細胞比例顯著增加。本實驗通過ELISA 分析補腎壯骨方對絕經后骨質疏松小鼠模型性激素水平及骨生化指標的影響，Western blot 分析補腎壯骨方對成骨細胞和破骨細胞EphB4﹑Ephrin-B2 蛋白表達的影響，Micro-CT 成像檢測體內骨密度及骨小梁參數(shù)，進一步闡明該復方防治絕經后骨質疏松的療效與作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與試劑

補腎壯骨方：江西省國醫(yī)名師曹正柳創(chuàng)立，包含生地黃15 g， 知母15 g，補骨脂12 g，巴戟天12 g，淫羊藿15 g，枸杞子12 g，酸棗仁10 g，黃柏10 g。此方劑中所有中藥飲片均由南昌大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供，按照每100 g 中藥飲片配比800 mL 飲用水，按常規(guī)煎煮方法進行制備。其后，進行過濾濃縮至生藥2.5 g/mL，成品儲存于4 ℃恒溫冰箱之中。雌激素組采用戊酸雌二醇片（補佳樂，拜耳醫(yī)藥上海有限公司，批號J20171038），成人日用量1 mg，換算成小鼠為每天0.13 mg/kg，小鼠每天灌胃容量為0.10 mL/10 g，雌二醇溶液含藥量為0.013 mg/mL，配制好后置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。E2﹑FSH﹑LH 性激素ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號1530503688﹑1533849327﹑1533697166）；Ca﹑P﹑ALP 骨生化指標試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，貨號1529396445﹑1535598798﹑TE0009）；EphB4 抗體﹑Ephrin-B2 抗體﹑GAPDH 抗體（英國Abcam 公司，貨號xy50582-R039﹑Hz-10659R﹑ab9484）。

1.2 主要儀器

170/3940 型轉膜儀（英國伯樂公司）；PVDF膜（美國Millipore 公司）；超凈工作臺（蘇州集團安泰空氣技術有限公司）；萬分之一分析天平（上海精科儀器有限公司 )；自動平衡離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；超低溫冰箱（德國賀利氏公司）；微量移液器（德國Gilson 公司）；Micro-CT系統(tǒng)（德國Siemens AG 公司）；雙能X 骨密度儀（美國 Hologic 公司）。

1.3 動物

清潔級雌性 BALB/c 小鼠50 只，12~13 月齡，體重（21.51±1.20）g，購自南昌大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，合格證號：SYXK（贛）2021-0003。實驗期間，小鼠給予常規(guī)喂養(yǎng)，自由進食﹑飲水，動物房內環(huán)境穩(wěn)定室溫保持在22~26 ℃，相對濕度保持在40%~60%，保持良好的通風。本研究涉及的動物實驗經過南昌大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，倫理編號：（2021）醫(yī)研倫審第（9-006）號。

1.4 分組及模型建立

實驗小鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為5 組，分別為正常對照組﹑假手術對照組﹑去勢手術組﹑補腎壯骨方組﹑雌激素組。去勢手術組給予雌性BALB/c小鼠氯胺酮100 mg/kg 麻醉，之后經背部入腹切除雙側卵巢；假手術組在卵巢附近切除與卵巢質量大致相等的脂肪組織，不對卵巢做任何處理；灌藥6 周后，從正常對照組﹑假手術對照組及去勢手術組隨機取2 只置于雙能X 線吸收測量儀平臺上測定股骨骨密度（BMD），根據(jù) BMD 含量判斷是否造模成功。

1.5 給藥方法及劑量

正常對照組：正常喂食，按0.10 mL/10 g 體重灌服生理鹽水，每日1 次，連續(xù)灌胃12 周。假手術對照組：按0.10 mL/10 g 體重灌服生理鹽水，每日1 次，連續(xù)灌胃12 周。去勢手術組：去勢手術造模成功后，按每天0.10 mL/10 g 灌服生理鹽水，每日1 次，連續(xù)灌胃12 周。補腎壯骨方組：去勢手術造模成功后，按0.10 mL/10 g 體重灌服補腎壯骨方，每日1 次，連續(xù)灌胃給藥12 周。雌激素組：去勢手術造模成功后，雌激素組按含藥量0.013 mg/mL相應溶液0.1 mL/10 g 灌胃，每日1 次，連續(xù)灌胃給藥12 周。

1.6 標本的采集與處理

各組小鼠末次給藥24 h 后，小鼠稱重，用氯胺酮100 mg/kg 對各組小鼠進行麻醉，麻醉狀態(tài)下通過摘眼球取血，所取全血置于室溫下2 h，以3 000 r/min 離心20 min，分離血清，采用ELISA法檢測血清性激素及骨生化指標。取血結束后脫頸處死小鼠，酒精浸泡消毒后完整取出雙側股骨。

1.7 實驗檢測指標及方法

1.7.1 ELISA 檢測血清E2﹑FSH﹑LH 性激素及Ca﹑P﹑ALP 骨生化指標 各組小鼠采集全血后進行提取血清，保存于-80 ℃低溫冰箱備用。ELISA 實驗操作依照廠家說明書，最后分別計算E2﹑FSH﹑LH性激素及Ca﹑P﹑ALP 骨生化指標的血清濃度。

1.7.2 Western blot 檢測骨組織中EphB4﹑Ephrin-B2蛋白表達 分別收集各組小鼠右側股骨組織，置于預冷的生理鹽水中，剔除骨外膜，用蒸餾水清洗干凈血液等雜質，之后剪碎骨組織進行稱重，后將碎骨放入裝有液氮的研缽中研磨成粉末狀。研磨完成后放入離心管中，每100 mg 骨粉末加入300 μL 蛋白提取試劑，輕輕混勻，冰浴30 min，每5 min 用漩渦混合儀振蕩20 s。最后在12 000 r/min轉速條件下離心15 min，所得上清液為骨組織總蛋白。蛋白變性后進行SDS-PAGE 凝膠電泳和轉膜反應，將膜放入封閉液中，用TBST 稀釋脫脂牛奶至濃度為5%，室溫下脫色及封閉60 min，加入所需EphB4﹑Ephrin-B2 一抗和二抗進行免疫反應。以GAPDH 作為參照進行實驗指標檢測。

1.7.3 Micro-CT 檢測骨密度和骨結構參數(shù) 各組小鼠處死后，迅速取小鼠左側股骨，去除附著的軟組織，將骨組織固定在4%多聚甲醛溶液中。將股骨標本置于標本杯中固定，采用體外Micro-CT 斷層掃描技術對股骨骨密度﹑骨結構進行掃描。掃描條件設置為電壓70 kV，掃描電流200 μA，層間距14.80 μm，平面分辨率300 ms，連續(xù)掃描約808 層。檢測骨密度（BMD）﹑骨體積/ 總體積（BV/TV）﹑小梁骨數(shù)目（Tb.N）和小梁厚度（Tb.Th）。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果用均數(shù)±標準差（）表示，每組間用單因素方差分析，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體重的比較

實驗開始前及第6 周各組小鼠的體重無統(tǒng)計學意義，12 周后去勢手術組﹑雌激素組小鼠體重均高于正常對照組﹑假手術對照組及補腎壯骨方組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠不同時間點體重變化（，n=10） g

表1 各組小鼠不同時間點體重變化（，n=10） g

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術對照組比，▲P<0.05；與去勢手術組比較，＃P<0.05。

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2.2 各組小鼠血清性激素水平的比較

去勢手術組小鼠FSH﹑LH 水平明顯高于正常對照組﹑假手術對照組﹑補腎壯骨方組及雌激素組，差異具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；去勢手術組小鼠血清E2水平低于其他4 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；雌激素組E2水平高于正常對照組﹑假手術對照組﹑補腎壯骨方及去勢手術組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清E2、FSH、LH含量的比較（，n=10）

表2 各組大鼠血清E2、FSH、LH含量的比較（，n=10）

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術對照組比，▲P<0.05；與去勢手術組比較，＃P<0.05。

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2.3 各組小鼠血清骨生化指標的比較

去勢手術組小鼠血清ALP 明顯高于正常對照組﹑假手術對照組﹑補腎壯骨方組及雌激素組，差異具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；去勢手術組小鼠血清Ca﹑P 含量明顯低于其他4 組（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清骨生化指標的比較（，n=10）

表3 各組小鼠血清骨生化指標的比較（，n=10）

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術對照組比，▲P<0.05；與去勢手術組比較，＃P<0.05。

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2.4 補腎壯骨方對各組小鼠BMD 及骨參數(shù)的影響

去勢手術組小鼠BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th 低于正常對照組﹑假手術對照組﹑補腎壯骨方組及雌激素組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），補腎壯骨方組與雌激素組中BMD﹑BV/TV 低于正常對照組與假手術組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組小鼠Tb.N 比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05） 。見表4。

表4 各組小鼠骨密度參數(shù)和骨結構參數(shù)的比較（，n=10）

表4 各組小鼠骨密度參數(shù)和骨結構參數(shù)的比較（，n=10）

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術對照組比，▲P<0.05；與去勢手術組比較，＃P<0.05。

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2.5 各組小鼠EphB4、Ephrin-B2 蛋白水平

Western blot 檢測提示，EphB4 蛋白表達在去勢手術組中低于正常對照組﹑假手術對照組﹑補腎壯骨方組及雌激素組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），補腎壯骨方組與雌激素組低于正常對照組與假手術對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Ephrin-B2 蛋白表達在去勢手術組顯著高于其他4 組，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），補腎壯骨方組與雌激素組高于正常對照組與假手術對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5﹑圖1。

圖1 各組小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白表達情況

表5 各組小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白水平（，n=10）

表5 各組小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白水平（，n=10）

注：與正常對照組比較，△P<0.05；與假手術對照組比，▲P<0.05；與去勢手術組比較，＃P<0.05。

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3 討論

骨質疏松癥是一種累及全身的代謝性疾病，表現(xiàn)為骨組織內部微細結構出現(xiàn)變化，導致骨組織脆性增加，骨量減少［6］。絕經后骨質疏松癥是臨床中常見的一種骨質疏松癥，對絕經后婦女造成巨大影響。此外，研究發(fā)現(xiàn)大約80%的骨折與骨質疏松癥相關，即使骨折經過治療后愈合，患者生活質量亦受較大影響［7-8］。成骨細胞（osteoblast，OB）和破骨細胞（osteoclast，OC）在維持骨量和骨強度過程中起到非常重要的作用，不斷更新骨基質，OC 將舊骨或受損骨移除，并由OB 形成新骨，這一高度協(xié)調的過程被稱為骨重塑［9］。骨重塑障礙是導致骨質疏松的常見原因［10］。在OB 和OC 維持的骨代謝平衡中，OB 起著非常重要的作用，而目前應用的經典抗骨質疏松藥物（降鈣素﹑二磷酸鹽﹑雌激素等），多為抑制OC 活性的藥物，缺乏刺激OB 活性或既刺激OB 又抑制OC 的藥物。因此，在深入研究和發(fā)掘化學合成藥物時，應注重中藥的開發(fā)應用［11］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除后的去勢手術組小鼠體重高于正常對照組﹑假手術對照組及補腎壯骨方組，給予補腎壯骨方處理的卵巢切除的小鼠體重增加不明顯，低于雌激素組及去勢手術組，提示補腎壯骨方治療絕經期后骨質疏松時無雌激素樣增加體重的副反應。針對補腎壯骨方對小鼠血清性激素及骨生化指標的影響發(fā)現(xiàn)，補腎壯骨方不增加性激素FSH﹑LH 與骨生化指標ALP 水平，能夠提高卵巢切除術后小鼠性激素E2及骨生化Ca﹑P 水平，血清Ca﹑P 水平能夠間接反映骨代謝情況。眾所周知，骨重塑的過程是動態(tài)的，維持骨量和骨質量，限制過度礦化的骨在體內的積累，并通過釋放Ca 和P 的儲備保持礦物質的平衡。當血液中的Ca含量下降時，甲狀旁腺激素分泌增加，導致骨質中的Ca 進入血液中，引起骨質疏松。提示補腎壯骨方治療絕經期后骨質疏松時無明顯雌激素樣副反應，具有較好臨床應用前景。

骨密度是目前公認的用于評估骨質疏松嚴重程度及治療療效的一項非常重要的檢測指標［12-13］。骨質疏松癥表現(xiàn)為骨重塑障礙，骨轉換率增加，BMD 和骨結構參數(shù)BV/TV﹑Tb.N 和Tb.Th 等降低。本研究發(fā)現(xiàn)去勢手術組小鼠BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th顯著低于正常對照組﹑假手術對照組﹑補腎壯骨方組及雌激素組（P<0.05），補腎壯骨方能夠改善卵巢切除后導致的BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th 下降，改善去卵巢引起的骨質疏松癥。因給予藥物干預時間較短，補腎壯骨方組與雌激素組中BMD﹑BV/TV低于正常對照組與假手術組，持續(xù)更長時間使用補腎壯骨方BMD﹑BV/TV 可能會漸接近正常值。

Eph 受體家族是酪氨酸蛋白激酶受體最常見的亞家族，它的配體是Ephrin 家族的蛋白質，分為A和B 兩種類型［14］。成骨細胞膜上的EphB4 受體與破骨細胞膜的Ephrin-B2 配體結合抑制破骨細胞的形成，促進體外成骨細胞的分化［15］。

研究發(fā)現(xiàn)EphB4/Ephrin-B2 信號通路既有正向信號又有反向信號，呈雙向性，其中反向信號抑制破骨細胞分化，正向信號調節(jié)成骨細胞的功能和活性［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)Ephrin-B2 配體和EphB4受體在成骨細胞膜上同時表達，Ephrin-B2 配體在破骨細胞膜上也有表達［18-21］。當配體與受體結合時，2 條下游信號通路都被激活。當成骨細胞膜上EphB4 受體與破骨細胞膜上Ephrin-B2 配體結合，激活下游信號通路，抑制破骨細胞的成熟，這被稱為“反向信號”。相反，當Ephrin-B2 與成骨細胞膜上的EphB4 結合時，會促進成骨細胞的礦化，這被稱為“正向信號”［22］。根據(jù)以往的數(shù)據(jù)，推測補腎壯骨方通過EphB4/Ephrin-B2 軸緩解絕經后骨質疏松。

本研究發(fā)現(xiàn)EphB4 蛋白表達在去勢手術組顯著低于正常對照組﹑假手術對照組﹑補腎壯骨方組及雌激素組，提示補腎壯骨方可提高成骨細胞膜上EphB4 蛋白表達；Ephrin-B2 蛋白表達在去勢手術組顯著高于其他4 組，補腎壯骨方組與雌激素組高于正常對照組與假手術對照組，提示補腎壯骨方可能抑制成骨細胞和破骨細胞膜上Ephrin-B2蛋白表達。

綜上所述，補腎壯骨方治療絕經期后骨質疏松臨床效果顯著且無明顯增加體重副反應，其能夠升高血清E2水平，降低FSH﹑LH 水平，增加EphB4蛋白表達，抑制Ephrin-B2 蛋白表達，無雌激素樣副反應，提示其可能通過EphB4/Ephrin-B2 軸緩解絕經后骨質疏松，為臨床治療絕經后骨質疏松提供理論依據(jù)。