外源線粒體移植減輕紫外線刺激下皮膚成纖維細胞的凋亡

石晉 張文慧 陳怡成 齊開 寧小娜 丁明超 路子涵 劉富偉

頜面部皮膚裸露在外,長期或高強度的暴露于紫外線刺激下,將出現(xiàn)皮膚光老化,表現(xiàn)為受累皮膚干燥、粗糙、皺紋、過角化,甚至誘發(fā)皮膚癌[1-2]。

線粒體作為細胞的能量轉化和信號轉導中心,紫外線刺激會造成皮膚成纖維細胞內線粒體結構與功能損害,從而導致活性氧(reactive oxygen species,ROS)等毒素堆積,破壞細胞功能,是皮膚成纖維細胞凋亡或死亡的關鍵。目前解決該問題的主要策略有兩種,一是應用SOD、CoQ10等ROS清除藥物;二是通過促進線粒體自噬等方式清除已經受損的線粒體,維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。然而上述方法并不能補充已損失的線粒體,整體功能依舊處于受損狀態(tài)[3-6]。

線粒體移植(mitochondrial transplantation,MTP)是將具備呼吸能力的健康線粒體注射到受損器官中,直接補充細胞內線粒體。分離純化到的線粒體與細胞共培養(yǎng),外源線粒體通過肌動蛋白依賴性內吞作用或胞飲進入細胞,形成內體或巨飲小體,通過MFN1/2和OPA1蛋白介導與內源線粒體融合。一小部分外源線粒體與溶酶體結合并被降解;大量外源線粒體從核內體、大蛋白酶體或溶酶體中逃逸出來。線粒體移植已被證明可快速恢復心肌、神經、骨等細胞的功能,并開展了部分臨床實驗,從而在線粒體異常相關疾病的治療中備受關注[7]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)線粒體含量較高,增殖能力強,且具有分化為皮膚成纖維細胞潛能,是理想的供體細胞。本研究將基于紫外線刺激皮膚成纖維細胞的皮膚光老化體外模型,明確移植BMMSCs來源的線粒體是否可以恢復細胞內整體線粒體功能,從而減輕紫外線刺激引起的細胞凋亡,為治療皮膚光老化等相關問題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

MEM-α培養(yǎng)基(Gibco公司,美國);DMEM/F-12、胎牛血清(Cytiva公司,美國);磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA消化液(PCM公司,法國);二甲基亞砜(DMSO)(Sigma-Aldrich公司,德國);熒光染料JC-1、細胞線粒體提取試劑盒、碘化丙啶(PI)、CCK-8(上海碧云天)。紫外UVA固化燈、UVA輻照劑量檢測計(臺灣泰瑪斯公司);CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國);倒置顯微鏡、流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司,日本);離心機(eppendorf公司,德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 BMMSCs線粒體提取 體外穩(wěn)定擴增的BMMSCs按2 000 萬的比例加入1 mL線粒體分離試劑,輕懸細胞后冰浴靜置15 min,隨后將細胞懸液轉移至玻璃勻漿器中,勻漿15 次左右后進行臺盼藍染色,當陽性比例超過50%時將細胞勻漿在600 g,4 ℃離心10 min。小心將上清轉移至新的EP管中,11 000 g,4 ℃離心10 min。棄去上清,沉淀即為分離得到的BMMSCs線粒體。

1.2.2 細胞模型的建立 選用小鼠成纖維細胞NIH/3T3,購自上海酶研生物科技。當細胞融合度約60%時,PBS緩沖液清洗1 次,加入1%的H2O2稀釋液覆蓋成纖維細胞進行預處理,置于紫外光源正下方10 cm處進行輻照,使用流式細胞儀檢測細胞存活,細胞存活率到50%(輻照強度:10 mW/cm2,輻照時間:10 min,累計輻照劑量:6 J/cm2。輻照劑量=輻照強度×輻照時間)。輻照結束后,棄廢液,依據(jù)實驗分組,加入DMEM/F-12(紫外刺激組)或DMEM/F-12稀釋的外源性線粒體(線粒體治療組)置于細胞孵育箱進行培養(yǎng)[8]。

1.2.3 線粒體數(shù)量及膜電位檢測 線粒體處理組分別設置3 個共培養(yǎng)時間(6、12和24 h)和3 個線粒體質量濃度1×、5×、10×(1.56、7.8、15.6 mg/mL)進行檢測。在1.5 J/cm2低輻照下處理細胞后進行實驗。按照50 μL JC-1(200×)加入8 mL超純水的比例稀釋。充分溶解混合之后加入2 mL JC-1染色緩沖液(5×)得到JC-1染色工作液。待檢測成纖維細胞先用PBS清洗1 遍,分別加入1 mL JC-1染色工作液,充分混勻后細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。在孵育期間,按照每1 mL JC-1染色緩沖液(5×)加入4 mL蒸餾水的比例,配制適量的JC-1染色緩沖液(1×),并放置于冰浴。37 ℃孵育結束后,吸除上清,用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2 次。隨后加入2 mL細胞培養(yǎng)液,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,每組選擇3 個視野,每個視野拍攝3 次,并通過image J軟件計算分析線粒體數(shù)量及膜電位。首先分離出單獨紅色熒光通道。其次通過Threshold調整閾值,清除背景,該實驗中后續(xù)分析平均熒光強度時均用此閾值。分析綠色熒光通道的平均熒光強度方法同上。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 依據(jù)模擬環(huán)境針對性設計分組,增加未經紫外刺激的正常細胞為空白對照組。對于普通刺激,線粒體處理組設置3 個質量濃度,1×、5×、10×(1.56、7.8、15.6 mg/mL),時間為12 h;對于極端刺激,提高線粒體處理組質量濃度為2.81、14.0、28.1 mg/mL,并增加處理時間為36 h。每個分組設置3 個重復孔。對各組細胞,取對數(shù)生長期細胞消化后接種至10 mm小皿中,待細胞鋪板率達到60%時進行紫外處理以及外源性線粒體移植治療。將提取的BMMSCs來源線粒體用DMEM/F-12稀釋成所需質量濃度,并分別加入紫外處理后的成纖維細胞中。給藥完成后將培養(yǎng)皿放置在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞孵育培養(yǎng)至檢測時間點后棄掉上清,收集細胞并用PBS清洗1 次,加入PI染料劑使用流式細胞儀進行凋亡檢測。

1.2.5 CCK-8(Cell Counting Kit-8)檢測細胞存活

設計分組為未經紫外刺激的空白對照組,經過紫外刺激的陰性對照組以及不同質量濃度的線粒體處理組1×、5×、10×。將制備好的細胞懸液計數(shù)后接種于96孔板上,加入100 μl細胞懸液,每組設置3 個復孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)(37 ℃,5%CO2)使細胞貼壁。每孔加入10 μL CCK-8試劑后將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1 h。酶標儀測定共培養(yǎng)6 h,12 h和24 h后450 nm處的吸光度A值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism8.3.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析,檢驗水平P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 紫外刺激對皮膚成纖維細胞存活率的影響

采用流式細胞儀對不同紫外照射劑量后的皮膚成纖維細胞進行了細胞凋亡測試。如圖1,在10 mW/cm2光照條件下,隨著光照時間的增加,0～5 min(輻照劑量為1.5 J/cm2)細胞存活率由96.3%到88.5%(P<0.01),下降緩慢。5～15 min(輻照劑量為6 J/cm2),細胞存活率下降速度增加,由88.5%到25.8%(P<0.000 1)。15～30 min(輻照劑量為9 J/cm2),細胞存活率趨于平緩(P>0.05)。由此可知,細胞在低劑量輻照條件下?lián)p傷程度較輕,隨著時間的增加,細胞損傷逐漸嚴重并且速度加快。但是超過15 min后細胞損傷趨于平緩,故輻照劑量為9 J/cm2,細胞基本壞死。根據(jù)文獻[9],本研究將選擇1.5 J /cm2作為低輻照劑量代表平原紫外線強度,6 J/cm2作為高輻照劑量代表高原紫外線強度展開后續(xù)試驗。

2.2 線粒體濃度、時間對細胞內移植效率的影響

為了闡明皮膚成纖維細胞對外源性線粒體的接受程度,在1.5 J/cm2低輻照下處理細胞后,使用JC-1染料檢測線粒體膜電位的變化。單體JC-1顯示綠色熒光,在膜電位高,即線粒體功能正常時,聚集顯示紅色熒光。故JC-1染色后線粒體的顏色差異可以用來評估移植線粒體對細胞內最終線粒體的影響。

如圖2,在同樣的共培養(yǎng)治療時間下,激光共聚焦顯微鏡觀察外源性線粒體質量濃度對細胞內最終線粒體的影響。與紫外刺激組相比,在1×(1.56 mg/mL)線粒體濃度下,綠色熒光稍弱,但難以發(fā)現(xiàn)紅色熒光(P>0.05)。隨著外源性線粒體濃度的增加,綠色熒光強度先減弱后增強(P>0.05)。其原因可能是隨著外源性線粒體濃度增加,部分線粒體膜電位降低,導致綠色熒光增強,但是紅綠熒光強度比值整體呈上升趨勢(P<0.05)。而紅色熒光強度明顯增強(P<0.05),并且紅色熒光集落形成單位面積增加。因此,在同樣的共培養(yǎng)治療時間下,加入的BMMSCs外源性線粒體質量濃度越大,細胞攝取的外源性線粒體越多,且能逆轉原有細胞內降低的線粒體膜電位,改善線粒體功能。

圖2 移植線粒體濃度對細胞內移植效率的影響

如圖3,在加入同等質量分數(shù)的外源性線粒體后,與紫外刺激組相比,紅色熒光強度隨著時間的增加明顯增強(P<0.05),綠色熒光強度減弱(P<0.01),表明此時線粒體膜電位處于較高的水平。并且紅色熒光集落形成單位面積增加,在孵育24 h后達到50%。故說明在移植外源性線粒體之后,共培養(yǎng)處理時間越長,皮膚成纖維細胞接受外源性線粒體程度越高。

圖3 移植線粒體時間對細胞內移植效率的影響

2.3 線粒體移植對普通和極端紫外線刺激下細胞凋亡的影響

采用低輻照劑量:1.5 J/cm2,以模擬普通紫外輻照強度。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。如圖4A,紫外刺激組與空白組相比,細胞存活率由97.9%減少到87.5%(P<0.000 1),并且晚期凋亡細胞率由1.5%上升至7%(P<0.000 1),說明該條件下,紫外對細胞有一定的損傷作用。在移植不同質量分數(shù)的外源性線粒體進行治療后,3 組實驗組相比,壞死細胞和晚期凋亡細胞數(shù)量未發(fā)生明顯變化,但存活細胞比例隨著移植線粒體質量濃度增加,10×(1.56 mg/mL)濃度的外源性線粒體存活率較于1×的外源性線粒體存活率由83.2%增至89.4%(P<0.001),并且,早期凋亡的細胞由11.6%降至5.6%(P<0.001),呈現(xiàn)劑量依賴特點。隨著加入的外源性線粒體的濃度的增加,存活細胞增加以及早期凋亡細胞比例成倍減少。這說明在低輻照情況下,外源性的線粒體治療可以增強細胞活性,減緩細胞凋亡和壞死。

高輻照劑量:6 J/cm2,模擬極端紫外輻照強度。如圖4B,紫外刺激組相比于空白組細胞存活率顯著減低,由96.1%減少至48.7%(P<0.0001),壞死細胞、早期凋亡和晚期凋亡細胞比例均大幅度增加,其中晚期凋亡的細胞由3.1%增長至37.1%(P<0.0001),由此說明高劑量紫外輻照對細胞的損傷巨大。在加入不同劑量的線粒體治療之后,3 組實驗組相比,壞死細胞、早期凋亡和晚期凋亡比例均有明顯減少。其中,10×外源性線粒體細胞晚期凋亡率較于1×外源性線粒體相比,晚期凋亡率由11.6%減少至4.5%(P<0.0001),壞死細胞與早期凋亡率分別由1.1%和3.9%減少至0.3%和2.7%(P>0.05)。實驗組中隨著加入的線粒體濃度的增加,細胞存活率由83.4%增長至92.6%(P<0.0001),已基本恢復至正常。由此可見,高紫外輻照后的皮膚成纖維細胞在經過外源性線粒體治療之后不僅可以減緩細胞凋亡,而且有望恢復正常的細胞代謝功能。

2.4 線粒體移植對紫外刺激的細胞存活CCK-8驗證

為了驗證線粒體移植對細胞的存活率的影響,采用紫外(1.5 J/cm2)輻照刺激成纖維細胞,利用CCK-8試劑盒進行檢測。如圖5,與線粒體共培養(yǎng)6 h后,與空白對照組相比,紫外刺激組的歸一化細胞存活率急劇減少,在加入不同濃度的外源性線粒體之后,細胞存活率有所上升。成纖維細胞與外源性線粒體共培養(yǎng)12 h和24 h之后,紫外刺激組的細胞活性均有所恢復。相比于紫外刺激組,不同濃度外源性線粒體組的細胞存活率呈上升趨勢,且在10×的濃度的恢復效果更好。隨著成纖維細胞與外源性線粒體共培養(yǎng)時間越長,以及外源性線粒體濃度越高,受損成纖維細胞的恢復能力越強。在培養(yǎng)24 h后,添加10×外源性線粒體的細胞存活率達到85%(P<0.01),已幾乎接近正常細胞。由此得出,紫外輻照后的皮膚成纖維細胞在經過外源性線粒體治療后可以促進細胞存活,表明外源性的線粒體對受損的成纖維細胞有積極作用。

3 討 論

皮膚受到紫外線輻射后會引起皮膚細胞的光損傷,加速皮膚的衰老,嚴重的甚至會誘發(fā)皮膚癌。線粒體作為生物體的立命之本,通過氧化呼吸鏈反應為細胞持續(xù)供能。然而,長時間或高強度的紫外刺激會造成線粒體結構與功能損害,從而導致ROS等毒素堆積,嚴重影響細胞狀態(tài),誘發(fā)細胞凋亡或死亡[10-11]。因此,逆轉線粒體損傷從而減輕細胞凋亡成為治療皮膚光老化的重要方式。

結果顯示:BMMSCs來源線粒體可移植進入皮膚成纖維細胞中,并成功治療紫外線刺激造成的線粒體膜電位下降,治療效果具有時間、濃度依賴性。尤其在極端刺激環(huán)境中,該方法可全面減輕細胞死亡、晚期與早期凋亡,恢復存活細胞數(shù)量。從而證實外源性線粒體移植可顯著減輕紫外線刺激引起的細胞凋亡,為其在皮膚光老化治療中的應用提供實驗依據(jù)。

首先,線粒體移植直接補充了受損線粒體的空缺,高效恢復細胞功能。目前,針對紫外線造成的皮膚光老化,除應用氧化鋅、二氧化鈦等高反光材料進行遮擋預防外,主要采用兩種策略:一是應用SOD、CoQ10等ROS清除藥物,減少毒素影響。CoQ10作為呼吸鏈復合物I/II和III之間的電子穿梭者,研究表明局部應用CoQ10可以防止紫外線引起的皮膚損傷,并增加膠原密度和成纖維細胞的數(shù)量。但是CoQ10的分離提取方法較難,產率不高[12-14]。同時,更為關鍵的是,此類方法對已發(fā)生的ROS累積所致病變效果有限,因此多提前應用與預防。近年來,多款植物提取物與中藥成分,如從甘草根部提取的Licochalcone A成分,從橄欖果實中提取的羥基酪醇等,也被證實有清除ROS能力,促進膠原蛋白產生,具有預防光老化可能,在皮膚美容領域應用廣泛;二是通過促進線粒體自噬等方式清除已經受損的線粒體,改善受損細胞內的線粒體質量[15]。也可通過藥物直接刺激線粒體功能,如甲狀腺激素,能顯著增強線粒體活性。然而上述方法并不能補充已損失的線粒體,細胞的整體功能依舊處于受損狀態(tài)。而線粒體移植則直接將健康線粒體補充到受損細胞中,恢復受損細胞的功能,這為逆轉正在發(fā)生的病變提供可能。研究結果顯示,通過線粒體移植,不但膜電位正常的線粒體增多,紫外損傷造成的膜電位降低的線粒體也逐漸減少,并最終使細胞由凋亡過程逆轉回存活細胞狀態(tài)。

從物種演化角度,線粒體高度保守,免疫原性低,應用安全性高。Ramirez-Barbieri等[16]通過觀察小鼠自體和同種異體的線粒體移植產生的免疫排斥反應發(fā)現(xiàn),自體細胞或異體細胞來源及注射方式,均未引起血清炎性標志物表達的明顯變化。雖然平均每個BMMSCs細胞內有300～400 個線粒體,更活躍的細胞如肌肉、心臟、肝等細胞有成百上千的線粒體,約占細胞質的40%,但上述細胞難以提取或連續(xù)傳代,而BMMSCs線粒體含量較高,增殖能力強,且具有分化為皮膚成纖維細胞潛能,是理想的供體細胞。

局部注射進行線粒體移植簡單、安全、方便,更易臨床轉化。越來越多的證據(jù)表明,機體內存在線粒體在細胞間的主動轉運,如脂肪細胞內線粒體可主動轉運至巨噬細胞中,從而調節(jié)局部免疫微環(huán)境[17-18]。該研究中,通過體外共孵育模擬單純局部注射線粒體的情況,線粒體可轉運至細胞內部起到治療作用,甚至在極端刺激環(huán)境中,該方法幾乎恢復了紫外照射前的存活細胞數(shù)量。目前,線粒體移植在改善心、肝、肺等方面的缺血再灌注損傷、以及癌癥方面已經取得不錯的治療效果[19-21]。McCully組研究了線粒體移植在不同時間點對肝臟缺血再灌注損傷的治療效果,在缺血前或灌注后2 h注射含線粒體載體可以改善引起肝臟缺血再灌注損傷的心肌梗死[22]。Chien等[23]研究表明,用從大鼠皮質神經元新提取的線粒體補充受損的海馬神經元可促進神經突再生并在受傷神經元中重新建立膜電位。因此,局部注射進行線粒體移植有望滿足臨床需要,無需增加囊泡等遞送形式。

本研究為外源性線粒體移植在皮膚光老化治療中的應用提供了實驗依據(jù)。進一步研究將探討線粒體移植后的功能變化,逆轉衰老等問題,拓展其應用領域。