3D打印磷酸鎂銨/聚己內(nèi)酯引導骨再生支撐性膜的制備及其生物學性能的研究

劉蘊賢 朱蓉蓉 常曉峰 李哲

引導骨再生術（guided bone regeneration，GBR）因為其操作簡便、技術敏感性低、結(jié)果可靠等優(yōu)點，目前已成為臨床種植中骨增量最常用的技術之一［1］。維持穩(wěn)定且充足的成骨空間對于GBR至關重要，臨床工作中常使用不同類型的GBR膜來達到這一目的。臨床上最常使用的可吸收膠原膜因其機械性能差，不具備支撐能力，易導致成骨空間的早期塌陷［2］。因此，在進行大范圍骨增量或垂直骨增量時，需要使用機械強度高的GBR支撐性膜來維持成骨空間。目前臨床上最常使用的支撐性膜是各種類型的鈦網(wǎng)，其良好的機械強度提供了足夠的空間支撐。但鈦網(wǎng)不可降解，。因此，亟待開發(fā)出一種兼具良好機械強度和生物降解性的支撐性膜以解決目前GBR所面臨的困境。

目前，各種高分子聚合物已被廣泛應用于生物和醫(yī)學領域。聚己內(nèi)酯（PCL）因其良好的生物安全性已獲得美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于生物醫(yī)學領域。同時，PCL還具備良好的機械強度和可生物降解性［4］。此外，PCL優(yōu)異的可加工性使它可以通過熔融沉積建模（FDM）3D打印方法制備成具有特定形狀、孔徑和孔隙率的支架，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和組織的生長，并使其能夠很好的應用于各類復雜的骨缺損形態(tài)［5］。但PCL表現(xiàn)為疏水性，這會抑制細胞黏附和增殖［6］，不具備顯著的促成骨能力［7］。因此，單純使用PCL并不能制備出理想的GBR支撐性膜。有研究表明，在PCL中摻雜其他物質(zhì)可以顯著提高其親水性和生物相容性［8］。磷酸鎂骨水泥因其優(yōu)異的成骨潛力而被認為可作為經(jīng)典磷酸鈣骨替代物的更優(yōu)選擇［9］。鎂是天然骨組織中的重要元素，鎂離子（Mg2＋）具有多種生物學特性，包括抗菌活性、調(diào)節(jié)炎癥和促進成骨等［10］。與其他磷酸鎂骨水泥（如Mg3（PO4）2、MgHPO4等）相比，磷酸鎂銨（MNP，MgNH4PO4·6H2O）具有更好的溶解度、生物相容性和促成骨潛能，極具發(fā)展前景［11］。

綜上所述，本研究擬采用MNP作為功能性添加物，PCL作為打印基材，采用FDM 3D打印技術制備復合GBR支撐性膜（MNP／PCL膜）。而混合材料的3D打印一直被認為是一項工藝難點，其均質(zhì)程度及添加物的比例會對3D打印的成功率、成品的工藝精度和機械強度產(chǎn)生極大的影響［12］。因此，研究擬設計不同的MgNH4PO4·6H2O比例，以尋找最佳打印模型、合成比例及打印參數(shù)。樣品打印后，對其進行理化性能表征，并探究其生物相容性和促成骨潛能。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

PCL顆粒（Mn＝80 000 Da）、六水合磷酸鎂銨（MNP；MgNH4PO4·6H2O）、碳酸二甲酯（DMC）、氯化十六烷基吡啶（CPC）（上海麥克林生化有限公司）；CCK-8試劑盒（武漢博士德）；活／死細胞染色試劑盒（上海貝博）；ALP染色試劑盒、茜素紅S溶液（北京索萊寶）；Trizol試劑、SPARKscriptⅡRT Plus試劑盒、SYBR Green qPCRMix（青島思科捷）；掃描電子顯微鏡（SEM，S-4800，日立，日本）；電子萬能試驗機（EZ-SX，Shimadzu，日本）；接觸角儀（DSA100S，Kruss，德國）；酶標儀（Multiskan FC，Thermo Fisher Scientific，美國）；激光掃描共聚焦顯微鏡（FV3000，奧林巴斯，日本）。

1.2 MNP／PCL膜的制備

以DMC作為溶劑，采用溶液共混法得到均勻的MNP／PCL／DMC溶液，隨后經(jīng)過超低溫凍干去除DMC，最終得到海綿狀的MNP／PCL混合物。純PCL亦經(jīng)過上述加工。使用FDM 3D打印機進行材料打印。3D打印模型層數(shù)設定為4層，打印尺寸為25 mm×25 mm，打印間距700μm，打印噴頭孔徑250μm，層間交角為45°／135°／0°／90°（圖1）。充填結(jié)構(gòu)的孔徑為150～400μm，有利于新生骨組織和血管的生長［13］。

圖1 3D打印模型Fig 1 Models of 3D printing

1.3 表面形貌表征

通過掃描電子顯微鏡觀察膜的表面形態(tài)并評價打印精度。

1.4 力學性能表征

使用電子萬能試驗機進行拉伸性能測試（n＝3）。

1.5 親水性檢測

采用接觸角儀測量表面親水性。將1μL水滴加到每個樣品的表面，30 s后測量接觸角（n＝3）。

1.6 體外生物相容性評價

1.6.1 細胞增殖檢測 將MC3T3-E1接種在膜表面，孵育1、3、5 d后，使用CCK-8試劑盒測定細胞活力。使用酶標儀在450 nm處測量吸光度（n＝6）。

1.6.2 細胞毒性檢測 將MC3T3-E1接種在膜表面，孵育3 d后，用活／死細胞染色試劑盒進行染色，并使用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.6.3 細胞黏附觀察 將MC3T3-E1接種在膜表面，孵育3 d后取出樣品，用PBS溶液清洗后固定、梯度脫水，使用SEM進行觀察。

1.7 體外促成骨性能檢測

1.7.1 堿性磷酸酶（ALP）染色及茜素紅（ARS）染色

將MC3T3-E1接種在膜表面并成骨誘導7 d后，使用ALP染色試劑盒進行ALP染色。同時，使用ALP檢測試劑盒進行ALP活性定量檢測，在405 nm處測量吸光度。成骨誘導21 d后，使用茜素紅S溶液進行ARS染色。觀察鈣結(jié)節(jié)后，用10%氯化十六烷基吡啶溶解鈣結(jié)節(jié)，并在560 nm處測量吸光度（n＝3）。

1.7.2 實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR） RT-qPCR用于分析成骨相關基因的表達，包括Runx-2、Col-1和OPN。將MC3T3-E1接種在膜表面并成骨誘導7 d后，使用Trizol試劑提取RNA，并使用SPARK-scriptⅡRT Plus試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Green qPCR Mix在ABI Prism 7500系統(tǒng)上進行RT-qPCR。小鼠GAPDH、Runx-2、OPN和Col-1的引物序列見表1。使用2－ΔΔCT方法計算目的基因相對于對照組的倍數(shù)變化（n＝3）。

1.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以珋x±s表示。使用GraphPad Prism 8軟件（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）通過單因素方差分析及SNK-q檢驗對各組進行比較。P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

表1 用于RT-qPCR的引物序列Tab 1 Primer sequences used for RT-qPCR

2 結(jié) 果

2.1 MNP／PCL復合膜的制備及表面形貌表征

所有組別均可成功完成材料打印。SEM圖像顯示PCL組打印絲粗細均勻，直徑約為250μm，呈現(xiàn)出形狀規(guī)則的孔隙，兼具較大的方形孔（直徑約400 μm）和較小的三角形孔（直徑約150μm），內(nèi)部為互相交通的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，微觀結(jié)構(gòu)與打印前的模型設計基本相符（圖2）。但MNP／PCL復合材料的打印難度增加，打印絲徑均勻度差，絲徑在100～500μm之間，內(nèi)部孔隙不規(guī)則，與預先設計的模型不符（圖2A～B）。優(yōu)化打印參數(shù)后，5% MNP／PCL組和10% MNP／PCL組可以完成高精度打印，達到預先設計的效果。然而當添加比例達到15%時，易堵塞打印噴頭，材料無法打印，故篩選PCL組，5% MNP／PCL組，10% MNP／PCL組進行后續(xù)實驗。

圖2 MNP／PCL復合膜的微觀形貌Fig 2 Micromorphology of MNP／PCL compositemembranes

2.2 MNP／PCL復合膜的力學性能表征

MNP／PCL復合膜的屈服強度［5% MNP／PCL：（0.824±0.047）MPa；10% MNP／PCL：（0.883±0.026）MPa］和楊氏模量［5% MNP／PCL：（23.73±3.39）MPa；10%MNP／PCL：（29.26±0.88）MPa］顯著高于PCL膜，表明MNP的添加提高了PCL的機械強度（P＜0.01）。但同時也顯著降低了PCL的最大應變（5% MNP／PCL：22.88%±1.84%；10% MNP／PCL：14.37%±0.59%）（P＜0.05）（圖3A～B）。

2.3 親水性檢測

PCL組的水接觸角（110.27°±2.05°）顯著高于5%MNP／PCL組（87.63°±1.45°）和10% MNP／PCL組（68.00°±1.53°），這表明MNP的添加提高了PCL的親水性（P＜0.001）（圖3C）。

圖3 MNP／PCL復合膜的力學性能及親水性表征Fig 3 Mechanical properties characterization and hydrophilicity of MNP／PCL compositemembranes

2.4 MNP／PCL復合膜的生物相容性評價

CCK-8分析結(jié)果表明，相較于空白對照組和純PCL組，MNP／PCL復合膜表現(xiàn)出明顯的促進細胞增殖的效果（P＜0.001）（圖4A）?；睿廊旧旧慕Y(jié)果顯示，所有膜的表面主要是活細胞，而死細胞很少，證明材料不具備明顯的細胞毒性（圖4B）。SEM圖像顯示，細胞在PCL表面多呈球形，但在5%MNP／PCL和10%MNP／PCL表面則伸展更為充分，可見大量絲狀偽足及片狀偽足，這提示其具有更高的細胞黏附性（圖4C）。同時，活／死染色染色及SEM結(jié)果均顯示，5%MNP／PCL和10% MNP／PCL表面細胞數(shù)量顯著多于PCL膜，再次證明其具有促細胞黏附特性。

2.5 MNP／PCL復合膜的體外促成骨性能評價

ALP染色結(jié)果顯示，相較于PCL組，MNP／PCL膜表面紫色染色面積更大，顏色更濃，表明其上的細胞具有更高的ALP活性（圖5A）。ALP活性檢測結(jié)果與ALP染色結(jié)果一致（P＜0.01）（圖5B）。同時，10%MNP／PCL的ALP活性略高于5%MNP／PCL。ARS染色圖像顯示含有MNP的膜表面紅色鈣結(jié)節(jié)顯著增加（圖5C）。ARS染色的半定量測量結(jié)果與ARS染色一致（P＜0.001）（圖5D）。通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)：7 d后與空白對照組和PCL組相比，MC3T3-E1接種于MNP／PCL后表現(xiàn)出以下基因的高水平表達（圖5E）：5%MNP／PCL組和10%MNP／PCL組的OPN基因相對表達量分別約為1.88倍和2.56倍；Col-1基因相對表達量分別約為2.67倍和2.94倍；Runx-2基因相對表達量分別約為1.88倍和1.96倍。上述實驗結(jié)果表明，MNP／PCL復合膜表現(xiàn)出了顯著的促成骨能力（P＜0.05）。

3 討 論

GBR支撐性膜除了具有良好的空間支撐能力之外，還應盡可能減小其自身重量以減輕其對骨組織的壓迫，同時也應該盡可能減小其厚度以避免其自身占據(jù)過多的成骨修復空間和造成過大的組織張力。足夠的機械強度是擁有穩(wěn)定空間支撐性的前提。本研究選擇了一種45°／135°／0°／90°的充填結(jié)構(gòu)，相較于經(jīng)典的0°／90°／0°／90°充填結(jié)構(gòu)，該種充填結(jié)構(gòu)可以在同等打印絲直徑、打印間距和打印尺寸下形成更小的孔徑，且具有更優(yōu)秀的力學性能［14］，更符合GBR膜的應用要求。

本研究使用磷酸鎂銨作為功能性添加物形成了MNP／PCL復合材料，用以改善PCL生物相容性和促成骨潛能不佳的缺陷。在本研究中，親水性測試的結(jié)果表明，MNP顯著提高了PCL的親水性，且與MNP的的釋放速率及釋放量仍需要更深入的研究加以探索。同時，PCL作為一種可降解的生物材料，其在添加MNP后對其降解速率的影響也有待更進一步的研究。更加重要的是，作為GBR膜另一至關重要的功能，MNP／PCL復合GBR膜的促成骨潛能仍有待通過體內(nèi)動物實驗進行更深入的探索。

圖4 MNP／PCL復合膜的生物相容性評價Fig 4 Biocompatibility evaluation of MNP／PCL compositemembrane

圖5 MNP／PCL復合膜的促成骨能力評價Fig 5 Evaluation of bone-promoting ability of MNP／PCL compositemembrane

MNP／PCL混合材料對3D打印的工藝提出了更高的要求。相較于純PCL，熔融狀態(tài)下的MNP／PCL混合物流動性下降，黏性上升，無法使用PCL組的參數(shù)進行打印。提升熔融溫度至90℃以提高混合材料流動性使其可以順利擠出，但過高的材料流動性會導致材料擠出過多，且更高的溫度會導致材料擠出后凝固時間延長，材料流動擴散更為明顯，造成打印絲直徑明顯高于設定直徑，且過高的擠出量會導致打印成品厚度和重量的上升（圖2A）。提高噴頭移動速度至10 mm／s可以減少單位時間內(nèi)擠出到同一位點的材料量，但過高的速度會導致打印絲拉伸變細甚至中斷，孔隙增寬，打印精度也隨之下降（圖2B）。最終，經(jīng)過反復調(diào)節(jié)參數(shù)，通過適當提高熔融溫度以提高混合材料流動性，降低打印平臺溫度加速熔融材料凝固以減少材料的流動擴散，下調(diào)擠出速度百分比和提高打印速度以保證打印絲的均勻度，實現(xiàn)了5% MNP／PCL和10%MNP／PCL膜的高精度打印（表2）。但是15%MNP／PCL因為添加比例過高，極易造成噴頭堵塞，提高熔融溫度至100℃仍然無法順利擠出，又因MNP在100℃以上易分解［17］，故現(xiàn)有條件下無法完成15%MNP／PCL組的材料打印。如何實現(xiàn)高添加比例MNP／PCL混合材料的3D打印仍需進一步的探索。

4 結(jié) 論

本研究從目前臨床階段GBR所面臨的難點出發(fā)，開發(fā)出了一種兼具生物降解性和機械性能的GBR支撐性膜。本研究選擇了力學性能更強的45°／135°／0°／90°充填結(jié)構(gòu)，并經(jīng)過打印工藝的優(yōu)化，成功實現(xiàn)了MNP／PCL復合材料的打印。隨后通過體外細胞實驗證明MNP／PCL復合膜具有優(yōu)異的生物相容性和促成骨能力。綜上，本研究為3D打印可降解支撐性GBR膜的研發(fā)提供了可行方案，但未來仍需大量體內(nèi)研究以實現(xiàn)最終臨床效果。

表2 3D打印參數(shù)Tab 2 Parameters of 3D printing