丙酮酸鈉溶液灌胃治療糖尿病大鼠深Ⅱ°燒傷效果及其機(jī)制

弭倩，孟祥熙，田雨沫，何澤，孫奎

1 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，河北承德067000；2 保定市第二醫(yī)院醫(yī)療美容科

深Ⅱ°燒傷是指真皮深層的熱損傷，局部表現(xiàn)為水皰，創(chuàng)面基底紅白相間，有細(xì)小網(wǎng)狀栓塞血管網(wǎng)。創(chuàng)面愈合過程中伴隨著創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)、壞死組織溶解、細(xì)胞增殖和組織重塑，及早閉合創(chuàng)面對患者預(yù)后非常重要。如果燒傷患者有糖尿病史，則容易出現(xiàn)繼發(fā)感染、傷口延遲愈合等問題。丙酮酸鈉參與三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝、糖酵解代謝和線粒體氧化，進(jìn)而參與全身各組織器官的代謝［1］。丙酮酸已被證實(shí)能夠增強(qiáng)耐缺氧能力，糾正2型糖尿病糖代謝紊亂和酸堿失衡，抗氧化應(yīng)激，保護(hù)線粒體，抑制細(xì)胞凋亡［2］，減輕炎癥反應(yīng)［3］。丙酮酸不僅對多種致病性損傷的糖代謝有保護(hù)作用［2，4-6］，對病變細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)也有保護(hù)作用。丙酮酸鈉在糖尿病合并燒傷創(chuàng)面治療中的應(yīng)用報(bào)道較少，因此，2022年10月—2023年6月，本研究建立了糖尿病深Ⅱ°燒傷大鼠模型，觀察丙酮酸鈉溶液對創(chuàng)面的治療作用，并探討其可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 雄性SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量220 ～ 250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0008。購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以上，室溫22 ～ 25 ℃，自由飲食。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。丙酮酸鈉購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，10%水合氯醛購自吉泰科技生物有限公司，鏈脲佐菌素（STZ）購自吉泰科技生物有限公司。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。血糖儀，電子秤，恒溫箱，酶標(biāo)儀。

1.2 糖尿病大鼠深Ⅱ°燒傷模型制備及分組給藥將50只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及實(shí)驗(yàn)1、2、3組。模型組和各實(shí)驗(yàn)組制作糖尿病大鼠深Ⅱ°燒傷模型。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h、禁飲4 h，動(dòng)物稱重后給予STZ 60 mg/kg腹腔注射，喂食5%葡萄糖溶液，自由飲食，72 h后采集大鼠尾靜脈血測量血糖，血糖≥11.1 mmol/L表示糖尿病大鼠造模成功［7］。將制備好的糖尿病大鼠禁食8 h、禁飲4 h，使用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉［8］，麻醉滿意后，剪除大鼠背部毛發(fā)，充分暴露出背部皮膚。將直徑4 cm鐵棒置于90 ℃熱水中靜置15 min，取出后使用毛巾吸干表面水分，貼緊大鼠背部10 s，建立深Ⅱ°燒傷模型［9］，燒傷深度經(jīng)病理組織切片檢驗(yàn)證實(shí)。分別將2.5、7.5、10.0 g丙酮酸鈉溶解于100 mL雙蒸水中，制作濃度為2.5%、5%、10%的丙酮酸鈉溶液。實(shí)驗(yàn)1、2、3組分別給予2.5%、5%、10%的丙酮酸鈉溶液灌胃，每次5 mL，每天1次，連續(xù)21 d；對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)21 d。造模成功后各組大鼠的存活情況：對照組9只，模型組8只，實(shí)驗(yàn)1組8只，實(shí)驗(yàn)2組8只，實(shí)驗(yàn)3組9只。

1.3 創(chuàng)面愈合情況觀察 分別于給藥1、3、7、14、21 d對大鼠背部創(chuàng)面拍照，觀察大體愈合情況。采用Image pro plus軟件分析創(chuàng)面面積并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（初始創(chuàng)面面積-當(dāng)前測量面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.4 血糖及體質(zhì)量檢測 分別于給藥1、3、7、14、21 d測量大鼠空腹尾靜脈血糖水平及體質(zhì)量。

1.5 創(chuàng)面組織中NAD+/NADH、MDA、SOD、IL-6、TNF-α檢測 分別于給藥1、3、7、14、21 d切取各組大鼠創(chuàng)面皮膚組織，取20 mg，加入PBS（pH 7.4），3 000 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清液，采用ELISA法檢測NAD+/NADH、MDA、SOD、IL-6、TNF-α，按試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組創(chuàng)面愈合情況比較 模型組給藥14、21 d創(chuàng)面愈合率低于對照組，各實(shí)驗(yàn)組給藥14、21 d創(chuàng)面愈合率高于對照組，且實(shí)驗(yàn)3組高于實(shí)驗(yàn)1、2組（P均＜0.05）。見表1、OSID碼圖1。

表1 各組給藥不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率、血糖、體質(zhì)量及創(chuàng)面組織中NAD+/NADH、MDA、SOD、IL-6、TNF-α水平比較（）

表1 各組給藥不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率、血糖、體質(zhì)量及創(chuàng)面組織中NAD+/NADH、MDA、SOD、IL-6、TNF-α水平比較（）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與模型組組相比，bP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)1組相比，cP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2組相比，dP＜0.05。

組別創(chuàng)面愈和率（%）血糖（mmol/L）體質(zhì)量（g）NAD+/NADH MDA（nmol/mg prot）SOD（U/mL）IL-6（pg/mL）TNF-α（mol/mL）對照組1 d 3 d 7 d 14 d 21 d模型組1 d 3 d 7 d 14 d 21 d實(shí)驗(yàn)1組1 d 3 d 7 d 14 d 21 d實(shí)驗(yàn)2組1 d 3 d 7 d 14 d 21 d實(shí)驗(yàn)3組1 d 3 d 7 d 14 d 21 d 4.49 ± 0.57 12.71 ± 0.52 56.17 ± 1.48 97.08 ± 0.92 8.43 ± 1.04 7.74 ± 0.82 6.62 ± 0.99 4.69 ± 0.31 4.81 ± 0.38 237.00 ± 2.40 241.00 ± 2.40 249.11 ± 2.20 259.00 ± 2.33 271.00 ± 2.65 1.41 ± 0.13 3.38 ± 0.31 2.28 ± 0.39 2.00 ± 0.20 1.57 ± 0.27 28.12 ± 1.35 48.41 ± 1.01 47.01 ± 1.46 27.47 ± 1.12 19.61 ± 1.91 315.44 ± 11.15 302.56 ± 9.10 319.67 ± 12.41 346.89 ± 9.98 365.22 ± 12.05 30.65 ± 1.72 34.43 ± 1.69 33.64 ± 1.65 30.46 ± 2.29 26.96 ± 1.30 47.18 ± 1.09 49.77 ± 1.92 52.26 ± 1.14 45.34 ± 1.24 41.24 ± 1.95 4.46 ± 0.98 12.37 ± 0.67 48.68 ± 0.83a 87.79 ± 1.44a 17.96 ± 6.12a 16.10 ± 4.15a 15.40 ± 2.96a 14.18 ± 2.09a 13.09 ± 1.47a 237.00 ± 2.03 233.00 ± 1.64a 232.00 ± 1.51a 241.00 ± 2.39a 251.00 ± 2.72a 1.33 ± 0.16 1.98 ± 0.16a 1.90 ± 0.33a 1.62 ± 0.16a 1.47 ± 0.24a 33.47 ± 1.93a 54.09 ± 1.17a 50.65 ± 1.45a 32.18 ± 1.67a 24.35 ± 1.24a 272.00 ± 12.34a 257.75 ± 14.67a 262.88 ± 9.05a 299.88 ± 14.19a 309.63 ± 22.17a 34.47 ± 1.64a 38.11 ± 1.60a 36.96 ± 2.98a 34.94 ± 2.17a 30.67 ± 1.51a 51.81 ± 1.68a 55.18 ± 1.57a 57.92 ± 2.27a 52.40 ± 1.77a 48.61 ± 1.65a 4.46 ± 0.67 12.42 ± 0.43 52.39 ± 1.18ab 93.22 ± 1.09ab 16.50 ± 6.49ab 15.51 ± 4.88ab 13.53 ± 2.79ab 12.89 ± 1.70ab 12.46 ± 1.46ab 237.00 ± 1.69 235.00 ± 0.99a 237.00 ± 2.92ab 246.00 ± 2.43ab 256.00 ± 3.80ab 1.35 ± 0.10 2.14 ± 0.21ab 1.93 ± 0.21a 1.81 ± 0.12ab 1.48 ± 0.22a 32.18 ± 1.45ab 52.44 ± 1.31ab 49.35 ± 0.86ab 31.79 ± 0.61a 23.90 ± 1.19a 276.63 ± 17.93 266.13 ± 12.97a 282.25 ± 15.04ab 302.63 ± 10.65a 312.00 ± 12.74a 33.87 ± 2.15a 37.21 ± 2.02ab 35.90 ± 1.34ab 33.53 ± 1.66ab 29.20 ± 1.79ab 50.75 ± 1.39ab 53.84 ± 1.76ab 56.30 ± 2.10ab 51.36 ± 1.86ab 47.49 ± 2.18ab 4.46 ± 0.47 12.47 ± 0.88 53.56 ± 1.19abc 94.48 ± 1.23abc 15.03 ± 3.54ab 14.27 ± 1.19abc 13.52 ± 1.26ab 12.58 ± 2.06ab 12.08 ± 1.50ab 237.00 ± 1.25 239.00 ± 1.60abc 242.00 ± 1.91abc 250.00 ± 1.77abc 260.00 ± 2.30ab 1.38 ± 0.11 2.22 ± 0.22abc 1.97 ± 0.22ab 1.83 ± 0.21ab 1.49 ± 0.21a 31.93 ± 0.64ab 51.88 ± 0.75ab 48.70 ± 0.77abc 30.13 ± 1.57abc 22.95 ± 0.74abc 282.89 ± 11.68ab 285.63 ± 14.48b 303.88 ± 12.51abc 330.50 ± 11.44abc 344.25 ± 12.04abc 33.16 ± 1.67ab 35.95 ± 1.28abc 35.86 ± 1.40ab 32.83 ± 1.64abc 28.24 ± 1.36abc 49.80 ± 1.83ab 52.06 ± 1.60ab 54.57 ± 1.42abc 49.44 ± 1.78ab 45.76 ± 3.50abc 48.13 ± 2.83abcd 51.25 ± 2.66abc 53.15 ± 2.55abcd 47.48 ± 2.82abcd 43.64 ± 2.87abcd 4.47 ± 0.63 12.67 ± 0.51 55.02 ± 1.87abcd 95.95 ± 1.25abcd 13.97 ± 2.20abcd 13.11 ± 2.33abcd 12.11 ± 1.93abcd 11.60 ± 1.86ab 10.81 ± 1.58abcd 237.00 ± 1.27 240.00 ± 1.64bc 245.00 ± 1.54abcd 254.00 ± 2.47abcd 264.00 ± 3.02abcd 1.40 ± 0.26 2.92 ± 0.31abcd 2.04 ± 0.20abcd 1.98 ± 0.15bcd 1.50 ± 0.13a 31.42 ± 1.77ab 50.11 ± 1.54abcd 48.30 ± 1.34abc 29.53 ± 1.51abc 21.83 ± 1.42abcd 296.38 ± 9.16abcd 290.56 ± 11.58bc 308.44 ± 10.67bc 335.11 ± 11.07abc 352.67 ± 10.64bc 32.60 ± 1.46abc 35.38 ± 1.38abc 34.39 ± 0.88abcd 31.87 ± 2.26abcd 27.11 ± 1.70bcd

2.2 各組血糖、體質(zhì)量比較 見表1。

2.3 各組創(chuàng)面組織NAD+/NADH水平比較 見表1。

2.4 各組創(chuàng)面組織MDA、SOD水平比較 見表1。

2.5 各組創(chuàng)面組織IL-6、TNF-α水平比較 見表1。

3 討論

糖尿病患者長期處于高血糖狀態(tài)，造成全身各個(gè)臟器持續(xù)性損害，使機(jī)體代謝紊亂，大小血管、神經(jīng)損傷［10］，若患者被燒傷則可引起創(chuàng)面持久不退的慢性炎癥反應(yīng)，因此控制血糖、減輕炎癥反應(yīng)是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的重要環(huán)節(jié)。

丙酮酸鈉具有調(diào)節(jié)血糖的功能，并能促進(jìn)胰島素分泌。研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸鹽能夠糾正2型糖尿病患者體內(nèi)血糖負(fù)反饋調(diào)節(jié)受損，使血糖維持在一定范圍內(nèi)［11］。當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷時(shí)，胰島素抵抗造成血糖濃度升高，高血糖會(huì)引起炎癥加重，因此將血糖濃度穩(wěn)定在適當(dāng)范圍內(nèi)對創(chuàng)面愈合至關(guān)重要［12］。本研究中使用丙酮酸鈉灌胃的實(shí)驗(yàn)組給藥后血糖水平低于模型組，表明丙酮酸鈉能夠控制糖尿病燒傷大鼠的血糖水平。

丙酮酸可以促進(jìn)機(jī)體能量代謝。在生理?xiàng)l件下，體內(nèi)NAD+/NADH處于一種動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷后NAD+/NADH失衡，NADH升高會(huì)引起線粒體電子傳遞鏈上供電體過量，導(dǎo)致線粒體復(fù)合物I過載，造成線粒體復(fù)合物I損傷，同時(shí)還可能使線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生更多的氧自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激［15］。有研究表明，丙酮酸可以在乳酸脫氫酶的作用下還原成乳酸，促進(jìn)NAD+產(chǎn)生［12］，提高胞質(zhì)內(nèi)NAD+/NADH比值，重新激活糖酵解［14］和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生ATP，促進(jìn)機(jī)體能量代謝，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究中，實(shí)驗(yàn)組與模型組相比NAD+/NADH增高，且實(shí)驗(yàn)3組增高最明顯，表明丙酮酸鈉能改善糖尿病燒傷大鼠創(chuàng)面組織代謝水平。

丙酮酸鈉具有抗氧化、抗炎作用［1，15］，能夠?qū)M織器官損傷起到保護(hù)作用［12］。在生理?xiàng)l件下，體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與代謝趨于平衡。當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí)，易產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，也是消除氧自由基的主要物質(zhì)［16］。MDA是活性氧氧化脂質(zhì)反應(yīng)的終產(chǎn)物，在一定程度上反映活性氧的代謝情況［17］，其濃度可以反映細(xì)胞損傷程度［18］。有文獻(xiàn)報(bào)道丙酮酸鈉能夠降低氧自由基含量［8］，可能通過促進(jìn)SOD產(chǎn)生、降低MDA水平來減輕機(jī)體損傷。糖尿病患者在燒傷后會(huì)出現(xiàn)不同程度的全身炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡，造成機(jī)體胰島素缺乏，使血糖升高，導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合。IL-6、TNF-α水平可以反映組織損傷程度，有研究顯示，丙酮酸能夠抑制IL-1、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，可用于亞臨床急性炎癥的治療［1］，能夠減少炎癥細(xì)胞浸潤，減輕臟器損傷［8］，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組IL-6、TNF-α、MDA水平降低，SOD水平增高，且實(shí)驗(yàn)3組效果最明顯，表明丙酮酸鈉能抑制糖尿病燒傷大鼠創(chuàng)面組織過氧化損傷及炎癥反應(yīng)，作用呈劑量依賴性。

綜上所述，本研究證實(shí)了丙酮酸鈉能促進(jìn)糖尿病深Ⅱ°燒傷大鼠創(chuàng)面愈合，控制血糖，維持體質(zhì)量，抑制創(chuàng)面炎癥反應(yīng)及過氧化損傷，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，為丙酮酸鈉治療糖尿病燒傷創(chuàng)面提供一定依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)論是從動(dòng)物研究中獲得，實(shí)際臨床應(yīng)用效果有待進(jìn)一步考證。