干細胞移植在急性腎損傷治療中的應用研究進展

李青霞，劉雪倩，馮一卓，白璐，趙凌霞

山西醫(yī)科大學第三醫(yī)院（山西白求恩醫(yī)院 山西醫(yī)學科學院 同濟山西醫(yī)院）內(nèi)分泌科，太原030032

目前，急性腎損傷（AKI）呈現(xiàn)高發(fā)病率、高病死率的特點。在導致AKI的諸多原因中，腎臟缺血再灌注損傷是主要原因之一，它常常引起急性腎小管上皮細胞壞死、凋亡、細胞脫落或結(jié)構(gòu)異常，最終引起腎小管梗阻、腎小管濾過液回漏和濾過功能衰竭。目前針對腎臟缺血再灌注損傷的治療以改善腎臟缺血癥狀為主，而不能從根本上解決腎實質(zhì)細胞壞死、數(shù)目減少等問題。干細胞能夠自我復制和更新，并且有一定的分化潛能，在特定條件下能向多種細胞分化進而形成相應組織和器官。與干細胞不同的是，祖細胞在發(fā)育過程中比干細胞更依賴于某些細胞系，但與完全分化和成熟的細胞相比，它們在生物結(jié)構(gòu)上均處于未分化或未成熟的狀態(tài)。干/祖細胞可以從骨髓、脂肪、臍帶等多種組織中獲得，具有來源廣泛的優(yōu)點［1-2］。多項研究表明，干細胞移植治療AKI具有較好的應用前景［3-5］，現(xiàn)將相關(guān)研究綜述如下。

1 胚胎干細胞（ESCs）

ESCs是多能干細胞，來源于哺乳動物受精卵的內(nèi)部細胞群，具有全能性。ESCs可自我更新和增殖，亦可多向分化形成外胚層、中胚層、內(nèi)胚層等多種細胞類型。學者們希望利用ESCs的全能性，體外誘導分化得到腎干/祖細胞，并移植到體內(nèi)分化為腎臟實質(zhì)細胞，治療腎臟疾病、改善腎臟功能。已有研究通過應用不同的生物技術(shù)方法得到能夠無限增殖和全能分化的人ESCs，這將很好地應用于移植治療、基因治療及生物發(fā)育等相關(guān)研究。

有學者誘導小鼠ESCs進入腎祖細胞和充分分化的腎細胞，使用腎源性生長因子或化學物質(zhì)聯(lián)合處理ESCs，使ESCs產(chǎn)生表達特定腎系細胞標志物的細胞，誘導后的細胞能夠在發(fā)育中的小鼠腎臟中形成管狀結(jié)構(gòu)，或被整合到腎臟實質(zhì)中，提示ESCs可以被應用于腎臟損傷后的細胞治療［6］。在體外，ESCs可以通過抑制分化獲得連續(xù)傳代，并且分化為腎臟的多種細胞類型。另有研究發(fā)現(xiàn)，胚胎發(fā)育過程中，一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子可鑒別腎臟祖細胞，如腎間充質(zhì)表達的SALL1和SIX2可以做為腎祖細胞的標志物，幫助研究者觀察到ESCs分化至腎臟祖細胞的過程［7］，進而識別、篩選和使用腎祖細胞。

在成功獲得人ESCs后，體外移植ESCs產(chǎn)生器官特異性細胞類型，可實現(xiàn)對功能障礙器官的功能恢復。從ESCs可獲得腎臟祖細胞、較多種類的腎臟細胞及類腎器官。由ESCs獲得的類腎器官能夠體外模擬腎臟的功能，是一種有效的腎臟再生方法。但人ESCs的臨床應用存在諸多問題：首先是與人類受精卵使用相關(guān)的倫理問題，其次是移植后的排斥反應，最后是通過ESCs誘導分化所得的類腎器官常是不成熟的，沒有血管及尿液排出的途徑，遠遠未達到臨床移植應用的標準，僅可用于生物組織工程、細胞治療、藥物篩選和疾病模型的制備。

2 胚胎腎中的干/祖細胞

人類胚胎發(fā)育分為三個胚層，腎臟來自于中胚層。按腎臟發(fā)育時間及先后順序，哺乳動物腎臟的形成經(jīng)歷了前腎、中腎和后腎共3個發(fā)育階段。前腎和中腎是腎臟在胚胎發(fā)育過程的暫時性器官，在胚胎期相繼退化，而后腎的發(fā)生是永久性的，哺乳動物的成年腎臟來源于后腎。后腎是由生腎索周圍未分化的腎間充質(zhì)和中腎導管的輸尿管芽相互作用形成的，這兩種組織均來自中胚層。輸尿管芽分泌誘導分化的因子誘導腎間充質(zhì)分化為上皮化的腎單位和間質(zhì)，同時引導輸尿管芽延長、分支形成下尿路，從集合管經(jīng)腎盂、輸尿管至部分膀胱［8］。多項研究表明，腎間充質(zhì)中含有腎干細胞，一個單獨的后腎未分化間充質(zhì)細胞可生成除集合管以外的所有腎上皮細胞［9-10］。因此，胚胎期后腎未分化間充質(zhì)細胞是一種多能的腎上皮前體細胞［11］，即多能性腎臟祖細胞，在合適的環(huán)境下能夠定向分化為腎單位上皮細胞，如腎小球足細胞、腎近端和遠端小管及髓袢的上皮細胞，其在腎臟祖細胞相關(guān)研究方面具有廣闊應用前景。

近年來，有學者分別將人胚胎中提取的包含神經(jīng)細胞黏附分子1的腎祖細胞分別移植到病鼠腎臟和5/6腎切除模型中，顯示出對慢性腎功能衰竭的抑制作用［12］。然而，目前還沒有關(guān)于胚胎腎祖細胞對AKI模型治療潛能的研究報告。雖然有研究顯示腎祖細胞仍然存在于斑馬魚的成年腎臟中，并參與腎臟損傷后的再生和分化［13］，然而SIX2的譜系追蹤研究證實，成年小鼠中不存在胚胎腎祖細胞，這些細胞在腎臟完全發(fā)育成熟后就逐漸消失［14］。目前需明確腎祖細胞的鑒別、提取和體外培養(yǎng)方法，進一步研究腎祖細胞的應用。胚胎腎臟中的腎祖細胞增殖依賴于其周圍的生存環(huán)境，但對于其適宜環(huán)境尚未研究清楚，體外擴增胚胎腎祖細胞的方法尚未建立，因此，加速胚胎腎祖細胞的體外擴增研究才有望將此類細胞應用于移植治療。

3 成體腎臟干/祖細胞

腎臟結(jié)構(gòu)復雜，其再生的難度也高于其他器官，而成體腎臟干/祖細胞具有自我復制、多向分化的能力，且來源相對容易，故成為腎臟再生醫(yī)學中最有前景的研究對象。研究證實，不同的哺乳動物成熟腎臟組織中均含有干細胞，即成體腎臟干/祖細胞，這些成體腎臟干/祖細胞能分化成腎臟內(nèi)的各種細胞，體外誘導下甚至可以產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)的腎臟［15］。通過多種鑒定方法，可以從成體腎臟的不同部位分離腎臟干/祖細胞，如標記保留法、克隆基因測定法、使用細胞表面標記的流式細胞術(shù)、譜系追蹤法和側(cè)群細胞測定法［16-17］，雖然這些成體腎干/祖細胞與胚胎腎干/祖細胞一樣參與腎小球和腎小管上皮細胞的形成，但它們可能代表不同于胚胎腎祖細胞的細胞群，具有不同的基因表達譜和細胞表達機制。

各國研究者通過不同實驗方法找出了多種類型的成體腎臟干/祖細胞，但是關(guān)于成體腎臟干/祖細胞還存在一些爭議。研究者提出成體腎臟干/祖細胞在急性、慢性腎損傷的修復過程中能夠發(fā)揮有益作用［18］。但也有部分研究認為，成年腎臟不再出現(xiàn)SIX2基因的活化現(xiàn)象，腎臟的損傷修復與成體腎臟的干/祖細胞無關(guān)，可能是成熟的腎小管上皮細胞去分化后再現(xiàn)干細胞標志物有關(guān)［19］。還有學者發(fā)現(xiàn)，腎臟細胞的自我更新和損傷修復是成熟腎小管上皮細胞對壞死細胞的替代［20］。所以研究者還需對這些細胞進行詳細的特征描述，并驗證細胞的分離方法是否科學、可重復，并檢查成體腎臟干/祖細胞群體的治療潛力。

4 誘導性多能干細胞（iPSCs）

有學者用Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后導入小鼠的成纖維細胞，成功誘導出與ESCs相似的全能干細胞，即iPSCs。將體細胞重編程為iPSCs是再生醫(yī)學的一個潛在治療方向，也是藥物篩選的一種工具［21］。

iPSCs作為全能型干細胞，可定向分化成腎祖細胞。BASTA等［7］通過誘導iPSCs形成腎臟祖細胞，體外誘導iPSCs 9 d后獲得SIX2陽性、SALLl陽性、WTl陽性、PAX2陽性的腎臟祖細胞，誘導效率高達90%，并且能在體外重構(gòu)后腎。有研究報道，可以用iPSCs在體外模擬體內(nèi)腎祖細胞發(fā)育產(chǎn)生的過程，先誘導人iPSCs高效分化為中胚層細胞，這些中胚層細胞具有分化為胚胎腎祖細胞和成人腎細胞類型（如腎小球足細胞和腎小管細胞）的潛力，進而能夠在器官培養(yǎng)環(huán)境中形成三維腎小管結(jié)構(gòu)［22］。然而人iPSCs來源的中胚層細胞如何高效分化為腎臟前體細胞還需要進一步研究。有學者利用人來源的iPSCs，通過調(diào)控CHIR99021、FGF9細胞因子的作用時間，控制輸尿管芽與后腎間充質(zhì)的形成比例，進而控制輸尿管、集合管及腎單位的形成比例，構(gòu)建了類腎體［23］。類腎體尚未形成完整的腎臟結(jié)構(gòu)，但這些類腎體可以作為腎臟體外研究的模型、遺傳性腎臟疾病模型，用來研究藥物的腎臟毒性及人類腎臟發(fā)育過程。

重編程成體細胞誘導產(chǎn)生iPSCs為臨床干細胞治療創(chuàng)造了新的機會。有研究發(fā)現(xiàn)，通過重編程外周血單核細胞、角質(zhì)形成細胞、滑膜細胞、韌帶細胞等多種體細胞能夠誘導產(chǎn)生iPSCs［24］。盡管不同來源的iPSCs數(shù)量不斷增加，但iPSCs產(chǎn)量有限，iPSCs在制備過程中存在低誘導率的問題，學者們通過降低培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度、添加維生素C、應用生物化學制劑等方法提高iPSCs的誘導率。利用Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc可以將人胚胎腎皮質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為iPSCs，其重編程效率約為成人真皮成纖維細胞的40倍［25］，這可能有助于腎臟疾病的研究，并加速細胞再生療法的發(fā)展。

相比ESCs的制取存在倫理學爭議，iPSCs在應用方面一樣存在倫理學問題。首先是iPSCs有較強的致瘤特性，應用于臨床有潛在風險；其次人iPSCs導入動物胚胎中產(chǎn)生的嵌合體動物存在極大的倫理道德爭議；最后是由iPSCs誘導的原始生殖細胞用于不孕癥患者，其出生的孩子也存在法律和道德爭議。盡管iPSCs在制備和使用中存在很多問題，但其在再生醫(yī)學領(lǐng)域方面依然越來越受關(guān)注，在疾病模型的建立、藥物篩選方面有巨大的應用潛能。iPSCs有ESCs的特性而又能避免部分倫理問題和道德問題，其有望成為干細胞治療腎臟疾病、腎臟器官移植的種子細胞。

5 人工腎祖細胞

有學者通過將6個轉(zhuǎn)錄因子（SIX1、SIX2、OSR1、EYA1、HOXA11和SNAI2）在成人近端腎小管上皮細胞系中表達，導致實質(zhì)腎臟細胞中激活了與腎祖細胞一致的基因網(wǎng)絡［5］，說明完全分化的成人腎細胞可以重新編程獲得腎祖細胞，但是在體外將腎細胞以外的體細胞類型重新編程為腎祖細胞尚待實現(xiàn)。成人腎細胞通過細胞重編程生成腎祖細胞將是胚胎腎祖細胞的潛在來源，盡管相應方法尚未建立，但考慮到從胚胎特別是人類胚胎中獲得足夠數(shù)量的干/祖細胞樣本非常困難，以上策略可能對腎臟祖細胞的臨床應用有重要價值。細胞重編程的領(lǐng)域發(fā)展迅速，這為細胞、組織甚至器官再生提供了的可能，為疾病的臨床治療帶來了新的希望，隨之而來的問題是新的細胞表型如何建立和改變。盡管在腎臟細胞生成iPSCs、iPSCs向腎臟分化及成年細胞向腎元祖細胞的重編程方面已經(jīng)取得了初步進展，但仍然屬于臨床前期工作，存在大量的實際應用問題。

6 間充質(zhì)干細胞（MSCs）

在疾病干細胞治療中，MSCs占有很重要的地位。MSCs源于中胚層，最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，存在于多種組織和器官中，具有干細胞的自我復制和多向分化潛能，現(xiàn)在已經(jīng)可以從胎盤、臍帶基質(zhì)、骨髓、肌肉、心臟、脂肪組織中找到［26］。在這些來源中，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）是最早發(fā)現(xiàn)和提取的，也是目前研究中應用最多的MSCs。另外，脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）和肌肉間充質(zhì)干細胞開展的研究也相對比較多，取材也比較容易［27-28］。最初研究認為MSCs是通過分化為靶細胞和替代損傷組織發(fā)揮其作用，隨后研究表明，移植的MSCs并不能代替受損的實質(zhì)細胞，而是通過旁分泌機制減輕損傷并加速修復［29］。BMMSCs和ADSCs由于獲得相對容易，許多AKI動物模型干細胞治療實驗多選用這兩種干細胞，特別是BMMSCs。有研究證實BMMSCs治療AKI動物模型有效［30］。ADSCs可以從自體脂肪組織中提取獲得，是非免疫原性的，能夠避免論理爭議，并且在各種腎臟疾病動物模型實驗中顯示了其治療腎臟疾病的療效［31-32］。

早期研究表明，BMMSCs可以分化為腎實質(zhì)細胞，而最近證據(jù)表明BMMSCs的分化能力是有限的，BMMSCs不能直接分化為腎實質(zhì)細胞，它對腎功能的有益作用在很大程度上是由其產(chǎn)生的旁分泌因子介導的，這些旁分泌因子具有抗凋亡、促血管生成和免疫調(diào)節(jié)等作用［33］。ADSCs可能主要通過旁分泌作用來修復腎功能，實驗表明，ADSCs可以通過抑制組織趨化因子和細胞因子的表達從而減輕急性腎功能損傷［34］，還可以降低蛋白氧化應激、細胞凋亡與炎癥反應，從而減少缺血再灌注損傷［35］。MSCs能夠分泌血管營養(yǎng)生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子1或肝細胞生長因子，這些因子有助于腎臟修復［36］。

腎臟損傷后，MSCs具有保護作用和損傷后的再生驅(qū)動作用。有研究顯示，移植到小鼠體內(nèi)的人臍帶MSCs有刺激腎小管上皮細胞恢復線粒體質(zhì)量和功能的作用，能在相鄰的腎小管上皮細胞之間起到修復作用［37］。有數(shù)據(jù)顯示，在SIRT3表達缺陷的AKI小鼠中，人臍帶MSCs治療未能發(fā)生腎臟保護作用，強調(diào)了SIRT3在腎小管上皮細胞恢復中的功能。這表明人間充質(zhì)基質(zhì)細胞移植到AKI小鼠體內(nèi)時，可通過SIRT3刺激腎小管細胞生長并增強線粒體功能，通過促進腎臟修復，從而誘導受損腎小管細胞的整體代謝重編程來維持能量供應。

現(xiàn)有醫(yī)學證據(jù)表明，除了腎臟替代治療外，幾乎所有藥物治療均未能顯著改善AKI患者的預后［38］。腎臟作為再生難度最大的器官之一，干細胞在腎臟疾病治療中的應用研究也一直在開展，各種種屬包括人腎臟原位干細胞的研究成果有很多［39-40］，但是一直還沒有特異性的標志物和（或）檢測方法來區(qū)分腎干/祖細胞。目前，干/祖細胞應用于AKI臨床治療存在的問題仍很多：①ESCs/iPSCs定向分化為腎系細胞和已分化成熟腎細胞重編程成腎祖細胞的方法尚未完全建立，大多數(shù)研究主要利用動物ESCs，而誘導人ESCs/iPSCs進入人腎系細胞仍沒有規(guī)范可循的實驗方法。②成熟腎臟的腎祖細胞不等同于胚胎腎臟的腎祖細胞，它們包含多種不同的細胞群，需要通過不同的方法鑒定，目前尚無統(tǒng)一、標準的鑒定和分選方法。③腎干/祖細胞移植在AKI動物模型中的治療效果已在少數(shù)研究中進行報道，但在AKI患者中尚未有評估。④MSCs雖然在動物腎臟疾病模型中有大量研究和獲益，但獲益原因尚待進一步研究?？傊I干/祖細胞移植可能為AKI提供了新的治療策略，但這一策略的臨床應用需要深入研究，如胚胎或成人腎干/祖細胞的特性，以及多種干細胞的體外擴增方法和有效移植方法等。