硅膠柱層析法分離純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯

于春剛，李小平，劉黎莎，盧曉東，李榮運，韓志武△

（1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266555； 2.山東省青島市婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266034）

兒茶素又稱茶單寧，是從茶葉中分離獲得的一類以2-苯基苯并吡喃為基本結(jié)構(gòu)的類黃酮化合物［1］，可分為表兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）4種主要類型［2］，以EGCG 含量最高。流行病學(xué)調(diào)查和實驗室研究均表明，EGCG 具有抗腫瘤、抗氧化及清除自由基等功效［3-5］。目前，EGCG 分離純化方法主要包括高效液相色譜法、高速逆流色譜（HSCCC）法、超臨界流體萃取法、柱層析分離法等［6-8］。但這些方法使用中存在設(shè)備一次性投入資金大、分離工藝周期長及最后制備所得成品數(shù)量少等問題，致使產(chǎn)品價格昂貴，從而給大規(guī)模分離制備兒茶素單體帶來較大困難。傳統(tǒng)的柱層析方法具有操作簡便、價格經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點，是一條較合理可行的制備途徑。本研究中采用硅膠柱層析法分離和純化兒茶素的單體成分EGCG，考察吸脫附條件對分離的影響，并采用高效液相色譜（HPLC）法測定其含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；SENCO R-201 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；SHZ - D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（天津華鑫儀器廠）；LXJ2X 型離心沉淀機（上海醫(yī)用分析儀器廠）；BT125D 型電子分析天平（梅特勒- 托利多儀器＜上海＞有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海凱朗儀器設(shè)備廠）；玻璃層析柱（100～200 目，上海儀容玻璃有限公司）；柱層析硅膠（100～200 目，青島海洋化工廠）；KQ500DE 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

兒茶素提取物（青島大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供）；兒茶素對照品（批號為20100107s，含量＞95%）、EGCG對照品（含量＞98%，批號為060104），均購自杭州和田生物技術(shù)有限公司；環(huán)己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇均為色譜純，無水乙醇、氯仿、冰乙酸、濃鹽酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Pronaos C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈-冰乙酸-水（9∶1.5∶89.5，V/V/V），B 為乙腈- 冰乙酸- 水（80∶1.5∶18.5，V/V/V），梯度洗 脫（0～10 min 時100%A，10～25 min 時100%A →70%A，25～36 min 時70%A，36～50 min 時70%A →100%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL［9］。

2.1.2 硅膠預(yù)處理及裝柱

先將硅膠于110 ℃烘箱中活化2 h。放至室溫后，過200 目篩；取適量，用洗脫劑充分浸泡［10］。濕法裝柱。預(yù)先在層析柱底部放置大小、厚度合適的脫脂棉，將浸泡好的硅膠邊攪拌邊緩慢倒入層析柱，使硅膠自然下沉，輕敲擊柱壁，使硅膠沉積壓實，再用其7～10 倍柱床體積的洗脫劑繼續(xù)淋洗，調(diào)節(jié)至柱平衡。

2.1.3 溶液制備

對照品溶液：取EGCG 對照品50 mg，精密稱定，用雙蒸水溶解并定容至25 mL，搖勻，超聲（功率450 W、頻率45 kHz，下同）處理10 min，即得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液：取兒茶素提取物適量，加水溶解后倒入分液漏斗，再加入等量氯仿，振搖、靜置，分層后取上層（水層），重復(fù)萃取2 次；合并水層后加入等量乙酸乙酯，振搖、靜置，分層后取上層（脂層），重復(fù)萃取2次，合并脂層，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)濃縮，取濃縮物放入40 ℃真空干燥箱中減壓干燥，得兒茶素富集物；取適量，精密稱定，溶于少量洗脫劑中，超聲除氣泡，緩慢將樣品溶液用滴管均勻地滴加于柱床表面，待樣品溶液完全滲入硅膠后泵入洗脫劑進(jìn)行層析，分段收集洗脫液。將上述EGCG 含量高的餾分合并濃縮后，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

取2.1.3項下對照品溶液及供試品溶液，按相應(yīng)要求進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗結(jié)果的RSD均小于2.0%，表明方法精密度、重復(fù)性良好，供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2 工藝參數(shù)優(yōu)化

洗脫劑：其他條件保持不變，對不同洗脫劑進(jìn)行考察。結(jié)果50%乙醇為洗脫劑時洗脫效果最好。詳見表1［其中EGCG 得率（%）=兒茶素富集物層析后的EGCG的質(zhì)量/兒茶素富集物中EGCG 的質(zhì)量×100%；EGCG純度（%）=EGCG峰面積/總峰面積×100%］。

乙醇體積分?jǐn)?shù)：其他條件保持不變，考察乙醇不同體積分?jǐn)?shù)時對EGCG 分離純化效果的影響。結(jié)果以無水乙醇效果最好但80%乙醇效果與之基本相當(dāng)，出于經(jīng)濟(jì)因素考慮選擇80%乙醇為洗脫劑。詳見表2。

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對分離純化效果的影響（%，n=3）Tab.2 Effect of ethanol volume fraction on the separation and purification（%，n=3）

洗脫劑pH：其他條件保持不變，考察層析時不同pH 對EGCG 分離純化效果的影響。結(jié)果最佳pH 為4.0。詳見表3。

表3 洗脫劑pH對分離純化效果的影響（%，n=3）Tab.3 Effect of eluent pH on the separation and purification（%，n=3）

洗脫劑流速：其他條件保持不變，考察層析時不同的流速對EGCG 分離純化效果的影響。結(jié)果當(dāng)流速為3.0 mL/min 時，EGCG 的純度和得率均較高，且分離時間較短。詳見表4。

表4 洗脫劑流速對分離純化效果的影響（%，n=3）Tab.4 Effect of eluent flow rate on the separation and purification（%，n=3）

上樣量：其他條件保持不變，考察不同上樣量對EGCG 分離純化效果的影響。結(jié)果上樣量為0.4 g 時EGCG的純度及得率均較好。詳見表5。

表5 上樣量對分離純化效果的影響（%，n=3）Tab.5 Effect of sample amount on the separation and purification（%，n=3）

2.3 優(yōu)化條件下EGCG 分離純化效果

取兒茶素富集物0.4 g，精密稱定，用適量乙醇溶解，經(jīng)硅膠柱層析分離純化，以80%乙醇（鹽酸調(diào)pH 至4.0）洗脫液，流速為3 mL/min，收集洗脫液，將洗脫液旋轉(zhuǎn)濃縮后，用水定容，按2.1.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)色譜峰。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量計算，所得EGCG 純度為91.14%，得率為81.79%。

1.表沒食子兒茶素沒食子酸酯A.對照品溶液 B.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Epigallocatechin gallateA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

3 討論

3.1 分離方法選擇

目前，分離制備兒茶素單體的方法主要有柱色譜法［11］、HPLC 法［12］、HSCCC 法［13］、吸附分離法［14］等。由于酯型兒茶素類單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)很相近，要得到高純度的兒茶素單體EGCG，采用一般的化學(xué)分離富集方法很難實現(xiàn)其單體的分離。現(xiàn)在所采用的分離方法基本是在較高純度茶多酚的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

趙敏等［15］以毛尖茶葉為原料，用加速溶劑萃取法提取茶多酚粗品，取得較高的粗提率。包箐箐等［16］采用HPLC 法測定4 種溫州早茶樣品中EGCG、EGC 的含量，結(jié)果顯示被測組分的含量與其峰面積線性關(guān)系良好。劉少靜等［17］采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法定量分析了安吉白茶中主要兒茶素類有效成分，結(jié)果EGC，EGCG，ECG 的 平 均 回 收 率 分 別 為98.80%，97.83%，99.38%。王尉等［13］采用HSCCC 法對綠茶化學(xué)成分進(jìn)行分離，通過對綠茶有效部位的分段萃取和多種溶劑系統(tǒng)的篩選，建立了分離綠茶化學(xué)成分的HSCCC 法，分離得到的EGC，EGCG，ECG 單體化合物純度分別為97.2%，98.8%，99.2%。從國內(nèi)外已有的文獻(xiàn)報道及專利來看，茶多酚分離純化技術(shù)仍存在缺點。溶劑萃取法由于很多物質(zhì)的極性都相似或相近，導(dǎo)致提取液中不僅有茶多酚，還會有其他物質(zhì)，雜質(zhì)較多，故要得到較純的茶多酚就需用大量的有機溶劑進(jìn)行反復(fù)精制，易造成環(huán)境污染，不符合綠色化學(xué)理念。HPLC 法制備兒茶素分離效率高，條件易控制，單體純度高，在保持EGCG 原藥效性能的前提下，產(chǎn)品穩(wěn)定性大幅增強。但該方法設(shè)備投資大、制備量較小，生產(chǎn)成本較高，難以工業(yè)化推廣。HSCCC 法可實現(xiàn)兒茶素單體的分離，但同樣存在生產(chǎn)成本高，一次性設(shè)備投入高，制備量小的缺點，難以實現(xiàn)工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)。而傳統(tǒng)的柱層析方法具有操作簡便、價格經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點，為較合理可行的制備途徑。

3.2 試驗條件優(yōu)化

EGCG 屬黃烷醇類物質(zhì)，極性較強，洗脫劑的極性越大，對EGCG 的分離純化效果影響越明顯，但若極性過大，所有組分可能均被帶至溶劑前沿，無法分離［18］。本試驗中考察了不同洗脫劑，確定乙醇的洗脫效果最優(yōu)。但不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對洗脫效果仍存在顯著影響［18］，綜合考慮選用80%乙醇。由于兒茶素與硅醇基氫鍵作用的強弱與環(huán)境的酸堿度密切相關(guān)［19-20］，故也考察了洗脫劑的pH。當(dāng)pH 為2.0 或3.0 時，EGCG 的純度和得率均較pH 為4.0 時降低，這可能是由于酸度過高導(dǎo)致其分子基團(tuán)破壞，致使洗脫下來的餾分中EGCG 含量下降，表明EGCG 分離純化效果受酸堿度影響較大；當(dāng)pH ＞4.0時EGCG 的純度和得率呈逐漸降低趨勢，這可能是因為兒茶素在中性或堿性條件下不穩(wěn)定，易被氧化降解，致使EGCG 含量降低［21］。當(dāng)洗脫劑流速＞3.0 mL/min 時，EGCG 純度及得率均較低，且洗脫劑的耗量大，色帶也拖長；當(dāng)洗脫劑流速＜3.0 mL/min 時，EGCG 不僅純度和得率均較低，且分離時間長。這是由于流速過大時，兩相間濃度很難均衡分配，使分離效果變差；而流速過低時，軸向擴(kuò)散的影響變大，使層析效果變差［22-23］。本試驗結(jié)果顯示，當(dāng)洗脫劑流速為3.0 mL/ min 時，EGCG 純度及得率均為最高。平均流速為4 mL/min時，純度及得率與平均流速為3 mL/min時基本相當(dāng)，但洗脫劑的耗量增大，色帶也拖長，綜合考慮選擇流速為3.0 mL/min為優(yōu)化流速條件。隨著上樣量逐漸增加，由于各組分的峰形在色譜圖上呈部分重疊現(xiàn)象，致使EGCG純度及得率下降；上樣量過大時，硅膠柱吸附飽和，EGCG純度及得率均顯著降低，達(dá)不到要求，故以一次上樣量為0.4 g為佳。

經(jīng)氯仿和乙酸乙酯萃取后的兒茶素富集物，再經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)一步分離純化可得到高純度的EGCG 單體。試驗通過優(yōu)化EGCG 硅膠柱層析分離純化過程中的參數(shù)進(jìn)行，得到最佳工藝參數(shù)為：兒茶素富集物上樣量為0.4 g，洗脫劑乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為80%，pH 為4.0，流速為3 mL/ min。在上述條件下分離得到的EGCG 經(jīng)HPLC檢測，其純度超過90%，得率超過80%。

3.3 方法評價

硅膠柱層析法具有方便、快速、生產(chǎn)周期短、純化分離效果好等優(yōu)點，可經(jīng)濟(jì)、有效地分離出高純度EGCG單體成分。