五匹風(fēng)高效液相色譜指紋圖譜及多指標(biāo)成分定量分析*

陳 冰，孫 緒，金倩倩，張 寶，李勇軍，李 悅△

（1.貴州省貴陽(yáng)市婦幼保健院·貴州省貴陽(yáng)市兒童醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003； 2.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院·貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004）

五匹風(fēng)為薔薇科委陵菜屬植物蛇含委陵菜Potentilla kleinianaWight.et Arn 的新鮮或干燥全草，別名蛇含、五爪龍、五匹風(fēng)、五皮草，主要分布于我國(guó)貴州、湖南、江西、遼寧、黑龍江等地［1-2］。五匹風(fēng)在貴州蘊(yùn)藏豐富，因其具有良好的清熱解毒、祛風(fēng)止咳等功效，貴州少數(shù)民族地區(qū)常用其治療咳嗽、乳腺炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病［3-5］，現(xiàn)收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003版）［1］。五匹風(fēng)具有抗炎、抗氧化、抗菌、降血糖功效，其藥理作用與其含有的大量鞣質(zhì)、黃酮、萜類成分有關(guān)［6-11］。目前，關(guān)于五匹風(fēng)藥材分離鑒定化合物的研究報(bào)道較少，其成分主要包括黃酮類、鞣質(zhì)類、酚類、萜類等［12-16］。國(guó)內(nèi)外對(duì)其質(zhì)量控制的研究報(bào)道亦較少，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以五匹風(fēng)藥材的性狀及顯微鑒別作為質(zhì)量控制指標(biāo)，質(zhì)量控制項(xiàng)目單一，不能有效、全面地控制藥材的質(zhì)量。因此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法建立貴州不同產(chǎn)地和批次五匹風(fēng)藥材的指紋圖譜，并對(duì)5種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，以期為提升五匹風(fēng)藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；AE240 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O- β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚- 3，7 - 二- O - α - L -吡喃鼠李糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸對(duì)照品（貴陽(yáng)市兒童醫(yī)院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)室自制，含量分別為98.82%，99.42%，97.66%，98.40%，99.42%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。五匹風(fēng)藥材（樣品信息見表1），經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)劉春花副教授鑒定為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立及分析

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～12 min 時(shí)10%A →18%A，12～30 min 時(shí)18%A →40%A，30～35 min 時(shí)40%A →30%A，35～50 min 時(shí)30%A →90%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.1.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別稱取3，3'- 二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸對(duì)照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為1 118.605，851.035，654.300，505.759，1 073.380μg/mL 的單一對(duì)照品貯備液；分別精密量取2.0，0.8，0.8，0.8，1.6 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為223.72，68.08，52.34，40.46，171.74μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取藥材樣品粉末（過(guò)3 號(hào)篩）1.0 g，精密稱定，置50 mL 具塞三角瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率400 W，頻率40 kHz）處理60 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上層液置離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取供試品溶液（編號(hào)S3）適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。以3號(hào)峰（山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷）為參照峰（下同）計(jì)算，結(jié)果6個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（編號(hào)S3）適量，在室溫下分別于0，2，4，8，24，48 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果6 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)S3）適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果6 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 HPLC 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取15 批藥材樣品適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得15 批藥材樣品的HPLC 疊加指紋圖譜（見圖1），將圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 年A 版）進(jìn)行分析，利用中位數(shù)法進(jìn)行多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配生成對(duì)照指紋圖譜（見圖2）。將15批藥材樣品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜匹配，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。

圖1 15批五匹風(fēng)藥材樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 Superimposed HPLC fingerprints of 15 batches of Potentilla kleiniana

2.3，3' - 二甲氧基鞣花酸- 4' - O - β - D - 吡喃葡萄糖苷 3.山柰酚- 3，7 - 二- O - α - L - 吡喃鼠李糖苷4.3，3' - 二甲氧基鞣花酸- 4' - O - β - D - 吡喃木糖苷5.3，3' - 二甲氧基鞣花酸 6.3，3'，4' - 三甲氧基鞣花酸圖2 五匹風(fēng)藥材樣品高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜2.3，3' - di - O - methylellagic acid - 4' - O - β - D - glucopyranoside 3.Kaempferol - 3，7 - di - O - α - L - rhamnopyranoside 4.3，3' - di - O - methylellagic acid - 4' - O - β - D - xylopyranoside 5.3，3' - di - O - methylellagic acid 6.3，3'，4 '- tri -O - methylellagic acidFig.2 Reference HPLC fingerprints of Potentilla kleiniana

表2 15批五匹風(fēng)藥材樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.2 Results of similarity evaluation of 15 batches of Potentilla kleiniana

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中，在與混合對(duì)照品溶液色譜圖相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，分離度均大于1.5，理論板數(shù)以待測(cè)成分峰計(jì)均高于27 000，表明方法適用性良好。詳見圖3。

1.3，3' - 二甲氧基鞣花酸- 4' - O - β - D - 吡喃葡萄糖苷 2.山柰酚- 3，7 - 二- O - α - L - 吡喃鼠李糖苷3.3，3' - 二甲氧基鞣花酸- 4' - O - β - D - 吡喃木糖苷4.3，3' - 二甲氧基鞣花酸 5.3，3'，4' - 三甲氧基鞣花酸A.混合對(duì)照品溶液 B.供試品溶液圖3 高效液相色譜圖1.3，3' - di - O - methylellagic acid - 4' - O - β - D - glucopyranoside 2.Kaempferol - 3，7 - di - O - α - L - rhamnopyranoside 3.3，3' - di - O - methylellagic acid - 4' - O - β - D - xylopyranoside 4.3，3' - di - O - methylellagic acid 5.3，3'，4 '- tri -O - methylellagic acidA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.3 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋，制備成系列混合對(duì)照品溶液，分別按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果表明，5 種待測(cè)成分在各自的線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系及定量限、檢測(cè)限考察結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the linear relation test，limit of quantification and limit of detection（n=6）

檢測(cè)限與定量限：精密量取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以信噪比（S/N）為10 和3 時(shí)對(duì)應(yīng)待測(cè)成分的質(zhì)量濃度分別為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果見表3。

精密度試驗(yàn)：取供試品溶液（編號(hào)S3）適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果5 種成分的RSD均小于3.0%（n= 6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（編號(hào)S3）適量，分別于室溫下在0，2，4，8，24，48 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果5 種成分峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)S3）適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果5 種成分峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批樣品（編號(hào)S3）粉末約0.5 g，共6 份，精密稱定，按要求分別加入已知含量的3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚- 3，7 - 二-O-α-L- 吡喃鼠李糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸的對(duì)照品111.860，34.041，26.041，26.172，20.230，85.870μg，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

2.2.2 樣品含量測(cè)定

取15 批藥材樣品粉末各適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品中5 種待測(cè)成分的含量。結(jié)果見表5?？梢姡?5 批樣品中，3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸的含量范圍分別為0.162%～0.879%、0.011%～0.253%、0.019%～0.047%、0.019%～0.209%、0.037%～0.107%，平均含量分別為0.366%，0.100%，0.032%，0.049%，0.065%。

3 討論

3.1 提取方法選擇

預(yù)試驗(yàn)中分別考察了不同提取溶劑（30%甲醇、60%甲醇、甲醇、30%乙醇、60%乙醇、乙醇、水），提取時(shí)間（15，30，60 min），提取方式（超聲法、回流法）對(duì)樣品中有效成分的提取效果，在考慮供試品制備方法的高效、簡(jiǎn)單、方便操作等因素前提下，在選擇提取溶劑為60%乙醇，超聲60 min 時(shí)，供試品溶液色譜圖中色譜峰數(shù)量較多，且分離效果較好，共有峰面積較大，故選擇此條件制備供試品溶液。

3.2 色譜條件優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中對(duì)不同檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)15 批藥材樣品在327 nm 波長(zhǎng)處出峰較多，共有峰較多，基線分離效果好，比較后最終選擇327 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)；比較了不同色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)Eclipse XDB - C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）具有較高柱效，能較好地分離待測(cè)成分與雜質(zhì)峰；比較了不同流動(dòng)相（乙腈-0.5%磷酸水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液、甲醇-水、乙腈-水）的試驗(yàn)效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸水溶液時(shí)，各色譜峰的峰形及分離度均較好；還考察了不同柱溫（20，30，35 ℃）及流速（0.8，1.0，1.2 mL/ min），發(fā)現(xiàn)30 ℃為分析的最佳柱溫，流速采用1.0 mL/min時(shí)色譜峰分離效果優(yōu)于0.8，1.2 mL/min，故確定本試驗(yàn)中的試驗(yàn)條件為最佳色譜條件。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中指紋圖譜結(jié)果表明，15 批五匹風(fēng)藥材樣品共有峰有6 個(gè)，相似度均大于0.885，說(shuō)明貴州省內(nèi)各產(chǎn)地的藥材質(zhì)量具有較高的均一性。含量測(cè)定結(jié)果顯示，五匹風(fēng)藥材中平均含量由高到低分別為3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸、3，3'-二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷，3，3'-二甲氧基鞣花酸- 4'-O-β- D - 吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3，7 - 二-O-α-L- 吡喃鼠李糖苷及3，3'- 二甲氧基鞣花酸-4'-O-β-D-吡喃木糖苷在各批次間的含量差異較小；山柰酚-3，7-二-O-α-L-吡喃鼠李糖苷和3，3'，4'-三甲氧基鞣花酸各批次間的含量差異較大，含量差異可能由產(chǎn)地、采收期等多種原因?qū)е拢唧w原因還需進(jìn)一步深入研究。

本研究中所建立的指紋圖譜及含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，可為五匹風(fēng)藥材的全面質(zhì)量控制提供參考。