柔弱斑種草石油醚部位化學(xué)成分活性研究*

夏 炎，商 勛，趙小超△，廖承譜，丁美婷，王 勇

（1.江蘇省南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210000； 2.江蘇省宿遷市中醫(yī)院，江蘇 宿遷 223800；3.浙江大學(xué)金華研究院，浙江 金華 321000）

肺癌死亡率居癌癥之首［1］。在治療過程中，多種因素可誘發(fā)肺癌及其他癌癥患者的肺部感染［2-3］，甚至危及生命，而中藥可在肺癌的治療中發(fā)揮重要作用。柔弱斑種草Bothriospermum zeylanicum（J.Jacquin）Druce 歸肺經(jīng)，具有止咳等功效［4-5］，收載于《中藥大辭典》《中華本草》等典籍。本研究中采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC -MS）法初步分析柔弱斑種草石油醚部位（PB）的化學(xué)成分，再通過微量肉湯稀釋法和MTS 法探討其抗菌及抗肺癌活性，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析挖掘其抗肺癌的潛在分子機(jī)制，為其深入開發(fā)與利用提供參考。

1 儀器、試藥與菌株、細(xì)胞

1.1 儀器

8860 - 5977B 型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；UV2550 型紫外可見-分光光度計(jì)（日本Shimadzu 公司）；XS205 型分析天平（意大利Mettler Toledo 公司）；RE-52A A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHB-Ⅲ型真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；CA-1115A型冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；DMI3000B 型倒置顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；370 系列CO2培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 試藥

頭孢他啶（齊魯制藥有限公司，批號(hào)為1H0189A50）；青霉素G鈉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)為F1078101）；順鉑（美侖生物科技有限公司，批號(hào)為N1001A）；MH 肉湯（批號(hào)為1103531）、LB 肉湯（批號(hào)為1096071），均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)為1706126），RMPI - 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)為0023019），DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)為0024719），胰酶（批號(hào)為0023518），雙抗（批號(hào)為1936917），磷酸鹽緩沖液（PBS，批 號(hào) 為0044818），二 甲 基 亞 砜（DMSO，批 號(hào) 為B821BA0018），均購(gòu)自碧艾（上海）生物科技有限公司；MTS 試劑盒（美國(guó)Promega 公司，批號(hào)為0000219904）；95% 乙醇、石油醚（60～90 ℃）、甲醇、無水乙醇等均為分析純，水為超純水。柔弱斑種草藥材樣品，采于江蘇省宿遷市宿豫區(qū)曹集田間，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為正品。

1.3 菌株與細(xì)胞

大腸埃希菌Escherichia coli（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌金黃亞種Staphylococcus aureussubsp.aureus（ATCC29213）、腸沙門氏菌腸亞種Salmonella entericasubsp.enterica（ATCC14028）、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa（ATCC27853）；人白血病細(xì)胞HL-60、肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞SMMC - 7721、乳腺癌細(xì)胞MCF - 7、結(jié)腸癌細(xì)胞SW480。均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

取柔弱斑種草藥材樣品適量，剪段，加10倍量甲醇回流提取3次，減壓回收溶劑，合并濃縮物得總浸膏。采用系統(tǒng)溶劑法萃取，濃縮，得PB；取100 mg，加入100 mL錐形瓶?jī)?nèi)進(jìn)行甲酯化反應(yīng)［6］，加石油醚（60～90 ℃）-苯（1∶1，V/V）18 mL，充分溶解，再加0.4 mol/L 氫氧化鉀- 氫氧化鎂溶液9 mL，50 ℃水浴30 min，加18 mL水，振搖，靜置分層，取上清液，加無水硫酸鈉脫水，濾過，取濾液，即得樣品。

2.2 GC-MS 試驗(yàn)

色譜條件：色譜柱為DB-WAX UI毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；固定相為聚乙二醇（PEG-20M）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；檢測(cè)器溫度為250 ℃；進(jìn)樣量為1μL；分流比為10∶1；載氣為氦氣，恒流模式，流速為3.5 mL/ min；尾吹氣流速為20 mL/ min；空氣流速為450 mL/ min；氫氣流速為40 mL/ min；升溫程序，初始溫度為40 ℃，保持3 min 后以3 ℃/ min 的速率升至250 ℃，保持30 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子（EI）源；電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，質(zhì)量范圍35～500 amu；相對(duì)含量采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算；主要成分的定性鑒定采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜庫（NIST11 譜庫）檢索法。

方法學(xué)考察結(jié)果：按相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

檢測(cè)結(jié)果：取樣品適量，按GC-MS 試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄總離子流圖（見圖1）。PB 的化學(xué)成分鑒定結(jié)果見表1。共鑒定出30 個(gè)化學(xué)成分，即亞油酸（20.13%）、十六酸（19.87%）、α-亞麻酸（13.60%）、反油酸（7.23%）、硬脂酸（4.27%）等，主要包含脂肪酸、脂肪醇、酯類、醚類、烷胺類化學(xué)成分。

圖1 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms

2.3 體外抗菌活性篩選

溶液制備：取樣品適量，以DMSO 和PBS為溶劑，滅菌，用水定容，制成質(zhì)量濃度分別為128.00，100.00，20.00，4.00，0.80，0.16μg/mL 的供試品溶液。取青霉素G 鈉適量，以DMSO 和PBS 溶解制成質(zhì)量濃度分別為5，10μg/mL 的陰性對(duì)照溶液，同法制備頭孢他啶質(zhì)量濃度為2μg/mL的陰性對(duì)照溶液。

抗菌活性篩選：采用微量肉湯稀釋法［7］。以含2%葡萄糖的RMPI-1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，得濃度為1 × 106cfu/mL 的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、腸沙門氏菌腸亞種、銅綠假單胞菌菌懸液。實(shí)驗(yàn)設(shè)PB 組（32，64，128μg/mL）及陽性對(duì)照1，2，3組（青霉素G鈉5μg/mL、青霉素G鈉10μg/mL、頭孢他啶2 μg / mL）；取菌懸液及相應(yīng)藥物各100 μL，96 孔板中37 ℃培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀測(cè)定625 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值。重復(fù)操作3次。結(jié)果質(zhì)量濃度為128μg/mL時(shí)，PB對(duì)4 種菌株均無明顯抑制作用。詳見表2。

表2 抗菌活性篩選結(jié)果（±s，%，n=3）Tab.2 Results of antibacterial activity screening（±s，%，n=3）

表2 抗菌活性篩選結(jié)果（±s，%，n=3）Tab.2 Results of antibacterial activity screening（±s，%，n=3）

組別質(zhì)量濃度（μg/mL）抑制率大腸埃希菌腸沙門氏菌腸亞種銅綠假單胞菌陽性對(duì)照1組陽性對(duì)照2組陽性對(duì)照3組PB組5.00 10.00 2.00 128.00金黃色葡萄球菌金黃亞種100.11±0.00 99.94±0.08 99.29±0.00-34.30±3.65-200.31±0.86-26.30±0.39 100.55±0.21-21.60±3.93

2.4 體外抗腫瘤活性篩選

采 用MTS 法［8］。以 含10% 胎 牛 血 清 的 培 養(yǎng) 液（DMEM 或RMPI- 1640）37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞12～24 h，分別制得HL - 60，A549，SMMC - 7721，MCF - 7，SW480 細(xì)胞懸液。以每孔3 000～15 000 個(gè)細(xì)胞100 μL 接種于96孔板，分別以100.00，20.00，4.00，0.80，0.16μg/mL的樣品（每孔100μL）37 ℃下培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTS 溶液20 μL 和培養(yǎng)液100 μL，37 ℃下繼續(xù)孵育2～4 h。以酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm 波長(zhǎng)處的OD值。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、細(xì)胞存活率（Y）為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性對(duì)照（順鉑，配制方法與同量同樣品）、模型對(duì)照、空白對(duì)照。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［1 -（OD給藥-OD空白對(duì)照）/（OD模型對(duì)照-OD空白對(duì)照）］×100%。結(jié)果顯示，PB 對(duì)A549 和SMMC-7721細(xì)胞增殖具有較明顯的抑制作用（見表3），隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，對(duì)2 種細(xì)胞增殖的抑制作用也逐漸增強(qiáng)（見圖2）。

表3 抗腫瘤活性篩選結(jié)果（±s，μg/mL）Tab.3 Results of antitumor activity screening（±s，μg/mL）

表3 抗腫瘤活性篩選結(jié)果（±s，μg/mL）Tab.3 Results of antitumor activity screening（±s，μg/mL）

處理方式樣品順鉑IC50 HL-60細(xì)胞＞100 6.25±0.14 A549細(xì)胞76.43±11.33 7.47±0.5 SMMC-7721細(xì)胞47.20±7.67 6.06±0.24 MCF-7細(xì)胞＞100 73.95±6.06 SW480細(xì)胞＞100 28.74±1.93

圖2 石油醚部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of PB on the proliferation of tumor cells

2.5 抗肺癌作用分子機(jī)制研究

共有靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：通過中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)TCMSP（https：// old.tcmsp - e.com/ tcmsp.php）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）、Batman - TCM 數(shù)據(jù)庫（http：// bionet.ncpsb.org.cn/batman - tcm/）收集并預(yù)測(cè)PB 的化學(xué)成分靶點(diǎn)，以“l(fā)ung cancer”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫平臺(tái)（https：// db.idrblab.net/ ttd/），獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。利用Venny 2.1.0軟件獲得共有靶點(diǎn)。

共篩選出23 727 個(gè)疾病靶點(diǎn)，513 個(gè)藥物靶點(diǎn)，獲得共有靶點(diǎn)504個(gè)，詳見圖3。

圖3 藥物-疾病靶點(diǎn)維恩圖Fig.3 Venn diagram of drug - disease targets

富集分析：利用Bioconductor 軟件，借助clusterprofiler 包、pathview 包、Dose 包，通過R 4.4.1 軟件進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，以P＜0.01 為篩選閾值，并繪制氣泡圖。GO功能富集分析篩選出343個(gè)條目（P＜0.05），主要包括核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等，詳見圖4。KEGG通路富集分析篩選出163 條信號(hào)通路，主要包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等通路，其中EGFR，PI3K - Akt，VEGF 等通路在抗肺癌過程中有重要作用，且均有文獻(xiàn)證實(shí)［9-11］，詳見圖5。

A.柱狀圖 B.氣泡圖圖4 GO功能富集分析結(jié)果A.Histogram B.Bubble chartFig.4 Results of GO functional enrichment analysis

3 討論

GC-MS 法共鑒定出PB 中脂肪酸、脂肪醇、酯、醚、烷胺類等30個(gè)化學(xué)成分，其中亞油酸、十六酸、α-亞麻酸、反油酸、硬脂酸含量較高；抗菌活性篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柔弱斑種草PB 無明顯抗菌活性；抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)A549細(xì)胞增殖具有抑制作用，依據(jù)其中醫(yī)藥歸肺經(jīng)的藥性理論，實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討了其抗肺癌活性及分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)PB 可能通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性AGE - RAGE 信號(hào)通路、PI3K - Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路等發(fā)揮抗肺癌活性。另有研究表明，肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸等化學(xué)成分具有抗腫瘤活性［12-15］，而肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕櫚酸等化學(xué)成分對(duì)A549細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，與本研究結(jié)果相似，故可為柔弱斑種草PB 具有較強(qiáng)的抗肺癌活性提供依據(jù)，提示其作為一種新的、具有抗肺癌活性的中藥有較大的開發(fā)潛力，需進(jìn)一步挖掘藥效，以更好地服務(wù)于臨床腫瘤疾病的防治。另外，GC-MS分析表明，PB化學(xué)成分中亞油酸相對(duì)含量較高，其除具有抗腫瘤活性外，還有較強(qiáng)的抗氧化活性，是天然抗氧化劑的重要原料之一，可降低膽固醇水平，并通過改善脂質(zhì)代謝和抑制炎性反應(yīng)緩解非酒精性脂肪性肝病，還可通過調(diào)節(jié)TLR4/NF- κB信號(hào)通路發(fā)揮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用，對(duì)慢性頭痛、神經(jīng)和視網(wǎng)膜功能均有一定作用［16-19］。含量排名第3的α-亞麻酸生物活性多樣，主要包括心血管及神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、降糖、抗氧化等作用［15，20-24］。最新研究表明，α- 亞麻酸的足量攝取有助于視網(wǎng)膜DHA 水平提高［25］。表明PB化學(xué)成分具有較高的開發(fā)價(jià)值。

綜上所述，本研究中尚未發(fā)現(xiàn)柔弱斑種草PB對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種、腸沙門氏菌腸亞種、銅綠假單胞菌的抗菌作用，但對(duì)A549細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，而PB抗肺癌的新藥效尚無研究報(bào)道。