正交試驗(yàn)法優(yōu)選溫脾降糖顆粒提取工藝*

陳雪婷，徐文杰，馮健英，李智勇，張建軍

（廣東省第二中醫(yī)院·廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院·廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095）

隨著高脂、高糖飲食攝入的迅速增加，糖脂代謝紊亂正嚴(yán)重危害著人們的身體健康。糖脂代謝紊亂屬中醫(yī)“消渴”“痰濁”“瘀血”等范疇［1］，溫脾降糖方主治消渴病脾虛濕熱證，在我院臨床應(yīng)用多年，其由干姜、黨參、肉桂等11 味中藥組方，有溫中健脾、清熱利濕功效［1-12］。雖收效良好，但需煎服，過程煩瑣，無法滿足患者方便用藥的需求。中藥顆粒劑具有產(chǎn)品性狀穩(wěn)定，劑量準(zhǔn)確，運(yùn)輸、貯存及攜帶方便的優(yōu)點(diǎn)，故擬將原湯劑開發(fā)為顆粒劑。在此，以固形物質(zhì)量、黃芪甲苷及6-姜辣素含量為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)化溫脾降糖顆粒提取工藝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），配有2424 型蒸發(fā)光散射檢測器及2998 型PDA 檢測器；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHC-9203A型鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海邦西力辰科技有限公司）；Sartorius BP211D 型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品（批號為110781 - 201515，含量93%），6 - 姜辣素對照品（批號為111833 - 201504，含量98%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。干姜、黨參、肉桂等藥材飲片均由廣東和翔制藥有限公司提供，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院徐文杰副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷與6-姜辣素含量測定

2.1.1 色譜條件

1）黃芪甲苷：色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-水（32∶68，V/V）；檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器；流速為1 mL/ min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為4μL。

2）6-姜辣素：色譜柱、流速同黃芪甲苷；流動相為乙腈-甲醇-水（40∶5∶55，V/V/V）；檢測波長為280 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10μL。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：取黃芪甲苷、6 - 姜辣素對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶液分別制成質(zhì)量濃度為491.97 μg/ mL、54.90 μg/ mL 的單一對照品溶液，分別記為對照品溶液Ⅰ、對照品溶液Ⅱ。

供試品溶液：按處方比例及工藝，稱取11味藥材飲片樣品各224 g，加入8倍量水，煎煮2次，每次2 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮并用水定容至200 mL，即得供試品溶液貯備液。精密吸取10 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入含4%濃氨水的80%甲醇50 mL，超聲（功率300 W、頻率40 kHz，下同）處理30 min，放冷，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加80%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液Ⅰ（用于黃芪甲苷含量測定）；另精密量取貯備液5 mL，置25 mL 容量瓶中，加入75%甲醇適量，超聲處理40 min，放冷，加75%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液Ⅱ（用于6 - 姜辣素含量測定）。

陰性對照品溶液：分別按溫脾降糖方處方比例稱取缺黃芪、干姜的藥材飲片，按供試品溶液制備方法分別制備缺黃芪、缺干姜的陰性對照品溶液Ⅰ、陰性對照品溶液Ⅱ。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取2.1.2 項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，2 種供試品溶液色譜圖在相應(yīng)對照品溶液相同保留時(shí)間處均有色譜峰，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

1.黃芪甲苷 2.6 - 姜辣素A.對照品溶液Ⅰ B.對照品溶液Ⅱ C.供試品溶液Ⅰ D.供試品溶液Ⅱ E.陰性對照品溶液Ⅰ F.陰性對照品溶液Ⅱ圖1 高效液相色譜圖1.Astragaloside Ⅳ 2.6 - GingerolA.Reference solutionⅠ B.Reference solutionⅡ C.Test solutionⅠ D.Test solutionⅡ E.Negative reference solutionⅠ F.Negative reference solution ⅡFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取對照品溶液Ⅰ適量，加甲醇分別制成黃芪甲苷質(zhì)量濃度為98.394，196.788，295.182，393.576，491.97μg/mL 的系列對照品溶液，分別精密量取4μL，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。再以進(jìn)樣量的對數(shù)［取自然對數(shù)（ln），下文同］為橫坐標(biāo)（X）、峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y1=1.634 5X1+1.011 6（r=0.999 7，n=5）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在393.576～1 967.88 ng 范圍內(nèi)的對數(shù)值與峰面積對數(shù)值線性關(guān)系良好。取對照品溶液Ⅱ適量，加甲醇分別制成6-姜辣素質(zhì)量濃度為10.98，21.96，32.94，43.92，54.9 μg/ mL 的系列對照品溶液，分別精密量取10μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y2=5.84×103X2-3.14×104（r=0.999 3，n=5）。結(jié)果表明，6-姜辣素進(jìn)樣量在109.8～549 ng 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：取2 種對照品溶液各適量，倍比稀釋，以信噪比（S/N）為3，10 時(shí)待測成分的質(zhì)量濃度分別記作檢測限和定量限。結(jié)果黃芪甲苷、6 - 姜辣素的定量限分別為7.380 μg/ mL 和1.648 μg/ mL，檢測限分別為2.216μg/mL和0.495μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取黃芪甲苷（質(zhì)量濃度為196.788μg/mL）及6 - 姜辣素（質(zhì)量濃度為21.96 μg/mL）對照品溶液各適量，1 d 內(nèi)分別連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD分別為0.23%和0.26%（n= 6）；再連續(xù)測定6 d，日間精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD分別為0.52%和0.61%（n=6）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2 種供試品溶液各適量，室溫下分別于0，2，4，6，8，12 h 時(shí)按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果黃芪甲苷、6 - 姜辣素峰面積的RSD分別為0.46%和0.33%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2種供試品溶液各6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果黃芪甲苷、6-姜辣素的平均含量分別為69.42μg/mL和158.35μg/mL，RSD分別為1.23%和1.08%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（黃芪甲苷、6-姜辣素質(zhì)量濃度分別為69.42μg/mL 和158.35μg/mL）的供試品貯備液適量，分別加入對照品溶液Ⅰ，Ⅱ各適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備相應(yīng)供試品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2 固形物質(zhì)量測定

精密量取濃縮液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，按2020年版《中國藥典（四部）》通則0831干燥失重測定法測定固形物的質(zhì)量。固形物質(zhì)量（g）=W×V/25。式中，W為25 mL濃縮液中干固形物的質(zhì)量，V為定容體積。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果［13-14］

按處方比例稱取干姜、黃芪等11 味藥材飲片樣品9份，每份224 g。以煎煮次數(shù)（因素A）、煎煮時(shí)間（因素B）、加水量（因素C）為考察因素，以固形物質(zhì)量（a）、黃芪甲苷含量（b）和6-姜辣素含量（c）為評價(jià)指標(biāo)，以綜合加權(quán)評分法計(jì)算綜合評分。綜合評分=a/amax× 40 +b/bmax×30+c/cmax×30。采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選制劑提取工藝。因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4?？梢?，3 個因素對提取效果的影響強(qiáng)度大小為A ＞B ＞C，綜合評分最高的工藝組合為A2B3C3。三因素中僅因素A 對提取工藝的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)因素B、因素C 3 個水平之間極差較小，故考慮到生產(chǎn)成本，包括加熱時(shí)長、用水量等，確定最優(yōu)提取工藝為A2B1C1，即加6 倍量水，煎煮2 次，每次1 h。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of the analysis of variance

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按溫脾降糖方臨床處方比例，稱取各藥材飲片樣品3份，每份224 g，依上述最佳工藝提取，再分別測定樣品中黃芪甲苷、6 - 姜辣素含量和固形物質(zhì)量，計(jì)算固形物得率，結(jié)果見表5，可見，優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of the verification test（n=3）

3 討論

溫脾降糖方中，干姜溫助脾陽、驅(qū)散寒邪，黃芪益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾固腎，二者共為君藥。姜辣素是干姜辣味物質(zhì)的總稱，是該方的主要成分，文獻(xiàn)研究顯示，6-姜辣素通過對脂質(zhì)分布的調(diào)控，調(diào)節(jié)胰島素、瘦素、淀粉酶、脂肪酶的含量，從而減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖［15-19］；皂苷類化合物是黃芪中重要的有效成分，其中黃芪甲苷含量最高，研究顯示，黃芪甲苷可抑制糖異生，調(diào)節(jié)糖脂代謝［20-22］。

為進(jìn)一步提高患者使用溫脾降糖方的便利性及依從性，本研究中采用L9（34）正交試驗(yàn)法對其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇對制劑質(zhì)量影響較大的煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、加水量3個因素進(jìn)行考察。通過建立高效液相色譜聯(lián)用蒸發(fā)光散射器法檢測方中君藥的指標(biāo)性成分黃芪甲苷和6-姜辣素的含量，并測定了對中藥固體制劑成型有重要意義的固形物質(zhì)量，并對3個指標(biāo)按重要性分別賦權(quán)計(jì)算綜合評分，以此綜合評價(jià)各提取工藝參數(shù)組合的優(yōu)劣。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際考慮，最終確定最優(yōu)提取工藝為加6倍量水，煎煮2次，每次1 h，驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)該方法穩(wěn)定可行，可為溫脾降糖顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。但大批量生產(chǎn)的過程較長，有效成分可能會有損失，出現(xiàn)臨床效果不穩(wěn)定的情況，后續(xù)課題組還將繼續(xù)對該品種進(jìn)行監(jiān)測，收集更多批次的化學(xué)數(shù)據(jù)和臨床治療效果反饋數(shù)據(jù)，提高原料藥的入選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步明確溫脾降糖顆粒的提取工藝。