溫肺化纖顆粒通過調節(jié)鐵死亡改善肺纖維化的機制研究

黎強 朱國雙 （江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性、進行性的，并對肺組織具有較強破壞性的纖維化性間質性肺病，臨床上主要表現(xiàn)為進行性呼吸困難并伴有肺功能下降［1］。病理學上肺纖維化主要表現(xiàn)為上皮細胞持續(xù)受損，成纖維細胞激活并分化為肌成纖維細胞，從而導致細胞外基質在肺組織內異常沉積，最終導致肺組織形成纖維性閉塞甚至“蜂窩狀”肺［2］。臨床上以特發(fā)性肺纖維化最為常見，且治療效果最差，平均生存周期為2.5～3.5 年［3］。目前臨床治療均不能延緩肺纖維化患者的疾病進展，因而亟需新的治療思路和方法進行防治。

細胞死亡有多種方式，鐵死亡是一種區(qū)別于細胞壞死、自噬及凋亡的新型細胞死亡方式［4］。通過對細胞線粒體基因庫的分析，發(fā)現(xiàn)鐵死亡由一個獨特的遺傳網(wǎng)絡所調控，敲除該調控網(wǎng)絡中的關鍵基因可以抑制細胞鐵死亡，但對細胞壞死、自噬及凋亡無明顯影響［5］。鐵死亡的發(fā)生，主要是由于鐵質的大量堆積，導致抗氧化系統(tǒng)失衡，出現(xiàn)活性氧（ROS）和脂質過氧化物的累積，進而誘導機體損傷的發(fā)生。

溫肺化纖顆粒是導師劉良徛教授在傳承國醫(yī)大師洪廣祥教授“治肺不遠溫”的學術思想指導下所創(chuàng)立，現(xiàn)已開發(fā)為江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內制劑。溫肺化纖顆粒以治療“陰疽”的“陽和湯”為基礎方，并予以蟲類藥物以達“搜剔竄透”之功。在前期研究中，課題組已證實溫肺化纖顆粒具有抗氧化作用，并能改善博來霉素誘導的肺纖維化小鼠肺臟損傷［6-8］。本研究將觀察溫肺化纖顆粒是否通過抑制鐵死亡達到改善肺纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性KM 小鼠50 只，體質量（27.5±2.5）g，5～6 周齡，購自江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心，生產許可證號：SCXK（贛）2018-0003。飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院實驗中心，所有小鼠均可自由飲水進食。本研究通過江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，批件號：JZLLSC20210031。

1.2 藥物和試劑

博來霉素（浙江瀚暉制藥有限公司，批號：20067411），購于南昌大學第一附屬醫(yī)院高新醫(yī)院，使用時溶于0.9%生理鹽水中，濃度為5 mg/kg。溫肺化纖顆粒（江中制藥股份有限公司，批號：20030003），組成：熟地黃15 g，鹿角霜15 g，炮姜炭9 g，肉桂4 g，麻黃10 g，炙甘草10 g，白芥子10 g，土鱉蟲8 g，桃仁8 g，紅花10 g，川芎10 g，地龍10 g，規(guī)格為15 g/袋，購于江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，使用時溶于0.9%生理鹽水中，濃度分別為0.292 5、0.585、1.17 g/mL。一抗NRF2 Rabbit mAb、NQO1 Rabbit mAb、Heme Oxygenase 1（HO-1/HMOX1）Rabbit mAb，二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），購于武漢愛博泰克（ABclone）生物科技有限公司。MDA、GSH、Fe 比色法測試盒，購于武漢賽維爾生物科技股份有限公司。

1.3 造模、分組及給藥

采用隨機數(shù)字表法將50 只小鼠分為對照組、模型組和溫肺化纖顆粒低劑量（WFHXL）、中劑量（WFHXM）、高劑量（WFHXH）組，造模前對各組小鼠進行禁食禁水12 h，配制4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）對各組小鼠進行腹腔注射麻醉，根據(jù)小鼠體重，進行氣管內一次性滴入博來霉素5 mg/kg 建立肺纖維化模型，對照組小鼠氣管內給予等量的生理鹽水。造模后溫肺化纖顆粒灌胃劑量經(jīng)人與小鼠體表面積比值折算，中劑量為人與小鼠的等效劑量5.85 g/kg，低劑量為2.925 g/kg，高劑量為11.7 g/kg，每日1 次，給予藥物體積為0.1 mL/10 g 灌胃。模型組和對照組給予生理鹽水0.1 mL/10 g 灌胃，各組均連續(xù)灌胃28 d，期間小鼠可自由進食、進水。

1.4 指標檢測

末次給藥24 h 后，腹腔注射4% 水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉后處死小鼠，取各組小鼠左肺上葉固定于4%多聚甲醛中48 h，以備包埋切片，用于相關病理染色；余肺組織于-80 ℃冰箱保存。

1.4.1 病理染色 HE 染色：固定完成的肺臟組織進行不同濃度乙醇梯度脫水、二甲苯透明，浸蠟2 h后，進行石蠟包埋切片，并脫蠟至水，放入蘇木素中浸泡，自來水洗，然后再進行1%鹽酸酒精分化，5 s 后，快速放入自來水中沖洗，然后進行不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，以及中性樹脂封片，最后顯微鏡下鏡檢，并進行圖像采集分析。

Masson 染色：取小鼠肺臟石蠟塊，常規(guī)脫蠟、乙醇梯度脫水，按照Masson 染色試劑盒說明書，不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，最后于顯微鏡下觀察拍照。

1.4.2 Real-time PCR 檢測 -80 ℃冰箱中取出小鼠肺臟組織，稱取20 mg 組織，進行提取RNA，并測定RNA 濃度。測定完成后，依據(jù)逆轉錄說明書進行操作，完成逆轉錄，并進行擴增，共40 個循環(huán)。按2-ΔΔCt 法進行定量分析，此次實驗所需引物均由武漢賽維爾生物科技有限公司進行合成，β-actin 為內參。見表1。

表1 肺組織Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA引物序列

1.4.3 ELISA 檢測 4 ℃冰箱中取出GSH、Fe、MDA 試劑盒，室溫靜置20 min；-80 ℃冰箱中取出小鼠肺臟組織；設定測定孔、標準品孔和空白孔，每孔設定3 次重復。根據(jù)組織稱取重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例，制備10%勻漿液。在低溫高速離心機下，4 ℃ 1 500 r/min 離心10 min，收集上清液。采用比色法檢測上清液中的Fe 含量，并參照GSH、MDA 試劑盒制備標準曲線，得出相應的GSH、Fe、MDA 數(shù)值。

1.4.4 免疫組化法檢測 取小鼠肺臟石蠟塊，進行常規(guī)切片、脫蠟，3%過氧化氫室溫清除過氧化物酶活性，純水沖洗3 次；然后將切片放入固定容器內，加入PBS，置于高溫烤箱中，進行高溫抗原修復，室溫15 min，5%山羊血清封閉，靜置15 min，甩去血清，加入一抗稀釋液，4℃過夜，進行室溫復溫，而后PBS 沖洗3 次，每次5 min。滴加二抗稀釋液，37 ℃恒溫箱靜置30 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min。最后進行DAB 顯色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡拍照，Image J 1.44圖片分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD 法，方差不齊采用Dunnett T3 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠病理染色結果

HE 和Masson 染色提示，對照組小鼠肺臟病理結構清晰完整，肺泡間隔未見增生，未見藍色膠原纖維的沉積。與對照組比較，模型組小鼠肺臟病理結構出現(xiàn)明顯破損，肺泡間隔明顯增厚，炎性細胞浸潤以及纖維組織明顯增生，同時伴有明顯的藍色膠原纖維沉積。與模型組比較，溫肺化纖顆粒各組小鼠肺泡間隔稍增厚，肺泡間隔破損稍輕，纖維組織增生和炎性細胞浸潤減少，同時溫肺化纖顆粒各組小鼠肺臟藍色膠原纖維明顯減少，其中WFHXL組藍色膠原纖維含量最多，其次為WFHXH 組，而WFHXM 組膠原纖維含量最少。見圖1。

圖1 各組小鼠肺臟病理染色（HE和Masson染色，×200）

2.2 各組小鼠肺臟組織中GSH、MDA、Fe 含量檢測結果

與對照組比較，模型組小鼠肺臟組織中MDA和Fe 含量明顯升高（P＜0.01），GSH 含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，溫肺化纖顆粒低、中、高劑量組小鼠肺臟組織中MDA 和Fe 含量明顯降低（P＜0.01），GSH 含量明顯升高（P＜0.01）；與WFHXL 組比較，WFHXM 組和WFHXH 組小鼠肺臟組織中MDA 和Fe 含量明顯降低（P＜0.01），GSH 含量明顯升高（P＜0.01）；且WFHXM 組治療效果要優(yōu)于WFHXH 組（P＜0.01）。見表2。

表2 溫肺化纖顆粒對小鼠肺臟組織GSH、MDA、Fe含量結果（，n=3）

表2 溫肺化纖顆粒對小鼠肺臟組織GSH、MDA、Fe含量結果（，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與WFHXL劑量組比較，▼P＜0.01；與WFHXH量組比較，▲P＜0.01。

?

2.3 各組小鼠肺臟Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA表達結果

與對照組比較，模型組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，溫肺化纖顆粒低、中、高劑量組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01)；與WFHXL 組比較，WFHXM 組和WFHXH 組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 mRNA 水平明顯升高（P＜0.01），且WFHXM 組優(yōu)于WFHXH 組（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組小鼠Real-time PCR檢測結果

2.4 各組小鼠肺臟免疫組化結果

與對照組比較，模型組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達水平明顯減少；與模型組比較，溫肺化纖顆粒低、中、高劑量組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達水平明顯升高；與WFHXL 組比較，WFHXM 組和WFHXH 組小鼠肺臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白水平明顯升高，且WFHXH 組低于WFHXM 組。見圖3。

圖3 各組小鼠肺臟免疫組化染色結果（×200）

3 討論

肺纖維化屬中醫(yī)“肺痿病”，“陽虛”為肺纖維化發(fā)病之源。肺纖維化患者日久，陽氣漸衰，導致血液和水液代謝異常，痰瘀形成。在病機上，則為陽虛寒凝、痰滯血瘀。根據(jù)國醫(yī)大師洪廣祥教授“治肺不遠溫”的學術思想，針對肺纖維化陽虛寒凝、痰滯血瘀之病機，本研究采用具有溫化寒飲、化痰祛瘀功效的溫肺化纖顆粒進行治療。

肺纖維化是以肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞增殖活化以及細胞外基質大量沉積并伴有炎癥細胞浸潤為特征的間質性肺病。鐵死亡是一種以鐵離子沉積、ROS 和脂質過氧化物累積，以及谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）表達受抑制的細胞死亡方式。研究發(fā)現(xiàn)，該死亡形式的發(fā)生可導致成纖維細胞向成肌纖維細胞轉化（FMT），導致肺臟發(fā)生病理損傷，最終形成肺纖維化，并在其機制中發(fā)生關鍵作用［9-10］。

研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化可伴隨鐵和脂質過氧化物代謝失衡現(xiàn)象［11-14］。當細胞內鐵過量時，細胞代謝過程中生成的過氧化氫和超氧自由基陰離子會與胞內過量的鐵發(fā)生Fenton 反應，并轉化為對大分子物質具有高反應性的羥自由基，其中具有抗氧化應激的谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的含量降低，進而誘導細胞內大量的ROS 和脂質過氧化物累積，導致機體細胞保護系統(tǒng)的主要控制器核因子紅細胞系2 相關因子2（Nrf2）含量降低，導致細胞損傷，并最終引發(fā)細胞發(fā)生鐵死亡。

在本研究中，通過小鼠氣管內滴注博來霉素，以模擬人肺纖維化發(fā)生。在HE 和Masson 染色結果中證實，小鼠肺臟組織出現(xiàn)明顯的肺泡結構破損、肺泡壁增厚、纖維組織增生和藍色膠原纖維沉積等肺纖維化表現(xiàn)。在進一步的檢測中發(fā)現(xiàn)，肺纖維化小鼠肺臟中鐵離子含量以及脂質過氧化物MDA 含量增加，抗氧化應激的GSH 含量降低，抑制鐵死亡相關蛋白Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 表達明顯降低，表明博來霉素誘導的小鼠肺纖維化可能是由于鐵死亡發(fā)生所致。給予溫肺化纖顆粒干預后，各組小鼠肺泡壁稍增厚，未見明顯的肺泡結構破損，纖維組織增生和藍色膠原纖維沉積得到明顯改善，表明溫肺化纖顆?？捎行p輕肺臟病理損傷。而在鐵死亡相關檢測中發(fā)現(xiàn)，各組小鼠肺臟中鐵離子含量、脂質過氧化物MDA 含量明顯減少，而抗氧化應激的GSH 含量增加，以及抑制鐵死亡相關蛋白Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4 表達明顯增加，這表明溫肺化纖顆?？赡芡ㄟ^抑制鐵死亡達到改善肺纖維化的作用。

在本實驗中，初步從動物實驗對溫肺化纖顆粒改善PF 的治療做了簡單的論述，對于溫肺化纖顆粒抑制鐵死亡的具體作用機制尚未闡述。今后本課題組將進行細胞實驗，構建肺纖維化模型，探討鐵死亡在肺纖維化中發(fā)生的具體作用機制以及溫肺化纖顆粒的干預作用。