三維多孔絲素蛋白羥基磷灰石支架細(xì)胞相容性的實驗研究△

陳仲春 苗變梁 謝幸巧 姚晉榮 趙霞

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 上海 200040；2.復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系 上海 200438)

耳、鼻、咽喉和氣管具有較多軟骨，當(dāng)因腫瘤、外傷等原因造成軟骨缺損時，軟骨重建對于維持器官功能和外形至關(guān)重要。由于軟骨組織損傷后，自身再生修復(fù)能力非常有限，目前主要依靠自體軟骨移植。但是用于軟骨修復(fù)的自體移植物存在供區(qū)損傷、來源有限以及移植物力學(xué)強度不足等問題，因此尋找合適的替代物非常重要。組織工程化軟骨是當(dāng)前研究的方向。理想的組織工程化軟骨支架應(yīng)具備以下特征[1-2]：①優(yōu)異的細(xì)胞相容性，即適宜的生長環(huán)境可以加速細(xì)胞增殖和分化；②適宜的機械性能，即組織形態(tài)的維持、細(xì)胞黏附和生長需要足夠的機械支持；③無毒降解產(chǎn)物和可控生物降解性，生物材料降解留下的空間對再生組織的生長至關(guān)重要；④理想的可加工性。

近幾十年來，各種新型支架材料不斷涌現(xiàn)，但都存在不足，如以膠原、明膠、殼聚糖等為代表的天然可降解生物材料的生物相容性好但機械強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠；以聚乳酸為代表的高分子可降解合成材料因其降解時產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物會導(dǎo)致局部非感染性炎癥而影響組織修復(fù)[3]。

絲素蛋白(silk fibroin，SF)是一種天然生物材料，具有良好的生物相容性、機械性能和可控的降解速率[4]。SF 支架的三維多孔結(jié)構(gòu)模擬了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞黏附、生長和遷移提供機械支撐和具有營養(yǎng)的環(huán)境[5]。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)作為天然骨組織的成分，具有優(yōu)異的機械性能和生物相容性，能夠?qū)Χ喾N基本材料進行表面功能化，從而促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的增殖和軟骨的形成[6-8],SF 可以誘導(dǎo)HA 在表面沉積，并通過強有力的化學(xué)交聯(lián)形成復(fù)合物[9]。有機物與無機物有序結(jié)合，礦物質(zhì)含量的增加加強了絲素支架的機械性能。絲素HA 材料雖然已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)，但在耳、鼻、咽喉和氣管軟骨替代物方面的潛力仍未明了。

因此，本研究通過制作具有三維多孔結(jié)構(gòu)的絲素HA 支架，觀察軟骨細(xì)胞在支架上粘附、生長和增殖的情況，探討多孔 3D 絲素HA 支架與軟骨細(xì)胞的相容性，為組織工程軟骨材料的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 絲素HA 支架的制作

將桑蠶繭放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%碳酸鈉的沸水溶液中煮30 min 以脫除絲膠，將脫膠絲置于9.5 mmol/L的溴化鋰水溶液中，60 ℃溶解1 h，然后將所得溶液置于截流分子量為12～14 kDa 的透析袋中，用去離子水透析3 d 以除去鹽。將透析好的絲蛋白溶液在8 000 r/min 下離心10 min，過濾，上清液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%的聚乙二醇水溶液透析濃縮，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為14%的再生絲蛋白水溶液。在絲蛋白水溶液中加入氯化鈣溶液，隨后再加入磷酸氫二鈉溶液繼續(xù)混合。之后在37 ℃恒溫水浴中培養(yǎng)24 h，即可得到絲蛋白/HA 復(fù)合懸浮液。逐滴加入正丁醇，室溫下400 轉(zhuǎn)/min 攪拌，形成穩(wěn)定乳液。將正丁醇/絲蛋白/HA 復(fù)合乳液倒入模具中，在-20 ℃冰箱中冷凍24 h。室溫下解凍，用去離子水漂洗除去正丁醇后，即得到SF-HA 復(fù)合多孔支架。

將支架切成小片后冷凍干燥，在液氮中脆斷，噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察多孔支架斷面的形貌。利用圖像處理軟件隨機選擇不少于50 個孔測量支架孔徑，并計算平均值，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用液體置換法測量支架的孔隙率[10]。支架置于體積為V1 的正己烷溶劑中，使正己烷充分填充支架的孔隙后溶劑體積計為V2，將充滿正己烷的支架取出后溶劑體積計為V3，支架的空隙體積為V1-V3，支架的總體積為V2-V3，支架的孔隙率=(V1-V3)/(V2-V3)×100%。共測試5 個樣品，統(tǒng)計求得平均值。

1.2 人原代軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

取人鼻中隔矯正術(shù)后的鼻中隔軟骨，立即浸泡在含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(GEMINI公司)的達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)液(GIBCO 公司)中，用含1×105U/L 青霉素和100 U/L鏈霉素的生理鹽水沖洗3 遍，再用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)沖洗3 遍，浸于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中，用眼科剪剪成約1 mm×1 mm 大小，加入0.3%Ⅱ型膠原酶4 ℃消化過夜。100 目細(xì)胞篩過濾后將培養(yǎng)液離心1 000 r/min，5 min。棄上清，加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，一次性無菌吸管輕輕吹打混勻，置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3 d 更換培養(yǎng)液。Ⅱ型膠原和亞甲藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞。

1.3 絲素HA 支架接種人原代軟骨細(xì)胞

絲素HA 材料在75%乙醇中浸泡消毒，0.5 h 后取出，以PBS 清洗2 次，超凈工作臺內(nèi)風(fēng)干，平鋪于24 孔塑料培養(yǎng)板底部。以1×105/mL 的密度將人軟骨細(xì)胞接種到多孔SF-HA 復(fù)合支架上。加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3 d 更換培養(yǎng)液。

1.4 支架上軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

于軟骨細(xì)胞接種支架第3、7、14 天后吸除培養(yǎng)液，細(xì)胞支架復(fù)合物以PBS 輕柔清洗2 次后，依次經(jīng)過以下過程處理：①2.5%戊二醛4 ℃固定；②PBS 漂洗3 次；③1%鋨酸固定；④PBS 漂洗3 次；⑤梯度乙醇脫水；⑥丙酮置換；⑦100%醋酸異戊酯置換；⑧臨界點干燥，噴金；⑨掃描電鏡(HITACHI SU8010)觀察支架上細(xì)胞生長的情況，并用ImageJ 軟件分析軟骨細(xì)胞在絲素HA 支架上覆蓋的面積。

1.5 支架上軟骨細(xì)胞的活性觀察

于軟骨細(xì)胞接種支架第3、7、14 天后吸除培養(yǎng)液，細(xì)胞支架復(fù)合物以PBS 清洗2 次后，浸泡于20 μmol/L Calcein AM(sigma 公司)工作液中37 ℃孵育20 min。倒置相差熒光顯微鏡下(鈣黃綠素染色)觀察支架上細(xì)胞的生長情況。

1.6 支架上CCK8 軟骨細(xì)胞增殖檢測

培養(yǎng)1、3、7 d，將材料轉(zhuǎn)移到新的48 孔板，在含有50 μL CCK-8溶液的200 μL培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h。之后將上清置于新的96 孔板，用分光光度計讀取在450 nm 波長處的光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，用ImageJ 軟件分析人軟骨細(xì)胞掃描電鏡圖片上細(xì)胞覆蓋的面積，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)；CCK-8 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絲素HA 支架

通過乳液冷凍制備絲素HA 復(fù)合多孔支架，可以定制為如圖1A 所示管狀，以滿足臨床氣管的形狀要求。支架具有多級的三維多孔結(jié)構(gòu)，即除了三維連通的大孔之外，孔壁在微納米尺度上出現(xiàn)纖維狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖1B)。支架的平均孔徑為(54±22)μm，孔隙率為83%±1.6%。

圖1 絲素HA 多孔支架 左圖為外觀；右圖為微納米尺度上顯示顯微網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2.2 人原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

人原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h，可見部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞由圓形逐漸變成梭形或多角形；培養(yǎng)第2～3天，細(xì)胞開始分裂增殖；培養(yǎng)第7～9 天，細(xì)胞增殖加速。細(xì)胞Ⅱ型膠原和亞甲藍(lán)染色陽性，鑒定為軟骨細(xì)胞(圖2)。

圖2 人軟骨細(xì)胞鑒定 A.Ⅱ型膠原染色；B.亞甲藍(lán)染色。

2.3 支架上人原代軟骨細(xì)胞生長的掃描電鏡觀察及統(tǒng)計

人原代軟骨細(xì)胞可以在絲素HA 支架上生長、增殖，掃描電鏡觀察顯示軟骨細(xì)胞與支架黏附良好，細(xì)胞接種支架培養(yǎng)3 d 可見支架上細(xì)胞黏附增殖；7 d 后細(xì)胞在支架上增殖明顯，覆蓋更多支架表面并分泌基質(zhì)；14 d 細(xì)胞鋪滿材料，并顯示出層疊生長(圖3)。統(tǒng)計顯示，隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞數(shù)量增長，支架上細(xì)胞覆蓋率也逐漸增大，3 d 時支架上細(xì)胞覆蓋率約為70%，7、14 d 時支架上細(xì)胞分布面積大于3 d 的細(xì)胞分布面積，達(dá)到了90%以上，其中14 d 和3 d 的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜ 0.01)。詳見圖4。

圖3 人原代軟骨細(xì)胞支架上生長掃描電鏡觀察 A.培養(yǎng)3 d；B.培養(yǎng)7 d；C.培養(yǎng)14 d。

圖4 培養(yǎng)不同時間人原代軟骨細(xì)胞支架上覆蓋面積 **示P ＜ 0.01。

2.4 支架上人原代軟骨細(xì)胞活性觀察

人原代軟骨細(xì)胞可以在絲素HA 支架上生長、增殖，鈣黃綠素活細(xì)胞熒光染色顯示軟骨細(xì)胞具有良好的活性及形態(tài)；接種3 d 細(xì)胞可見增殖，7 d 后細(xì)胞增殖明顯，14 d 細(xì)胞鋪滿材料并保持良好的形態(tài)及活性(圖5)。

圖5 人原代軟骨細(xì)胞在絲素HA 支架材料上生長 A.培養(yǎng)3 d；B.培養(yǎng)7 d；C.培養(yǎng)14 d。

2.5 CCK8 細(xì)胞增殖檢測

通過CCK-8 檢測人軟骨細(xì)胞在絲素HA 支架上的增殖情況發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的第1、3、7 天，細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為隨時間增加細(xì)胞數(shù)目增多，在3 個時間點之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

圖6 培養(yǎng)不同時間人軟骨細(xì)胞在支架上增殖 **示P ＜ 0.01。

3 討論

種子細(xì)胞、基于生物材料支撐細(xì)胞生長和功能的基質(zhì)以及細(xì)胞和組織的刺激誘導(dǎo)系統(tǒng)是組織工程的三大要素[11]。組織工程科學(xué)的研究基礎(chǔ)和熱點之一是選擇合適的材料來構(gòu)筑供細(xì)胞生長的支架，不僅要求支架材料本身具有良好的生物相容性，而且易于加工制作成高孔隙率、多孔結(jié)構(gòu)特征可控的三維多孔結(jié)構(gòu)[11-12]。通過不同的處理方法，絲素可形成多種結(jié)構(gòu)，如纖維、薄膜、水凝膠和三維多孔結(jié)構(gòu)，可促進成纖維細(xì)胞、軟骨、間充質(zhì)干細(xì)胞、上皮細(xì)胞等的生長[13-14]。本研究中通過乳液冷凍制備絲素HA 復(fù)合多孔支架的方法操作簡便，可以通過模具制作成塊狀、管狀等形狀，樣品可塑性高，能滿足臨床上多種形狀要求。通過掃描電鏡可觀察到制作的支架具有相互連通的三維多孔結(jié)構(gòu)和較高的孔隙率(83%±1.6%)。這種類似細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)能夠模擬生物體內(nèi)的理化環(huán)境，可以提供適當(dāng)?shù)目椎篮捅砻娼Y(jié)構(gòu)來引導(dǎo)和支持細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和分化等，以及傳送營養(yǎng)物質(zhì)和輸出代謝產(chǎn)物，從而進一步實現(xiàn)三維結(jié)構(gòu)的組織再生和功能重建[15]。三維多孔結(jié)構(gòu)亦有利于血管及組織的長入，實現(xiàn)支架材料與組織的整合。

SF 是一種可降解的天然高分子纖維蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性，其降解產(chǎn)物主要為游離氨基酸等，可以通過蛋白水解酶反應(yīng)易被人體吸收[16]。SF 因含有細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，利于細(xì)胞連接，能促進多種細(xì)胞的黏附及生長[17]。有研究[18-19]顯示，與桑蠶絲素相比，源自非桑蠶絲(如柞蠶)的絲素蛋白含較多的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)基序，更有利于軟骨細(xì)胞的附著和增殖。然而，由于非桑蠶絲的固有氫鍵和疏水性，非桑蠶絲纖維較難加工[20]。此外，桑蠶絲來源廣泛、最常用[21-22]，加工方法綠色環(huán)保[4]，易于工業(yè)化生產(chǎn)，所以本研究選用桑蠶SF 作為制作支架的成分。

支架材料能否與軟骨細(xì)胞良好相容是選擇人工軟骨修復(fù)支架首先需要明確的問題。本研究選擇原代鼻中隔軟骨作為評價材料相容性的細(xì)胞來源。研究發(fā)現(xiàn)，人原代軟骨細(xì)胞能迅速黏附在絲素HA 支架上，并且較快增殖，鈣黃綠素活細(xì)胞染色顯示細(xì)胞在2 周的觀察期內(nèi)都保持良好的活性。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在軟骨細(xì)胞接種支架7 d 時，細(xì)胞已覆蓋支架大部分表面，細(xì)胞之間連接緊密；到接種14 d，材料表面基本被軟骨細(xì)胞完全覆蓋，且細(xì)胞排列更加緊密并分泌基質(zhì)形成一層細(xì)胞層。CCK-8 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果也顯示：在培養(yǎng)的第1、3、7 天，隨時間增加材料上細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，而且這3 個時間點之間細(xì)胞增殖的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可見，軟骨細(xì)胞與絲素HA 支架在體外表現(xiàn)出良好的組織相容性。

鼻中隔軟骨易于獲得，分離的軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)至第2 代，細(xì)胞數(shù)量即可擴增至4 倍。體外培養(yǎng)4 代以內(nèi)，可以保持細(xì)胞表型不變[23]。鼻中隔軟骨是組織工程化軟骨研究中重要的種子細(xì)胞來源[24]。鼻中隔軟骨細(xì)胞具有較好的增殖能力。但是原代細(xì)胞不可避免地面臨組織來源和擴增能力有限的問題，可誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的干細(xì)胞是有希望的組織工程化軟骨的來源。

綜上所述，SF-HA 支架易于加工，可以形成三維多孔結(jié)構(gòu)，能夠促進原代軟骨細(xì)胞粘附、生長和增殖，可以考慮其作為潛在的組織工程化軟骨支架材料進行進一步研究。目前的研究僅僅是材料體外細(xì)胞相容性的觀察，未來的研究還需要完善相關(guān)的動物實驗以明確材料的機械性能、降解過程以及與組織的整合能力等，以提供進一步的實驗數(shù)據(jù)。