銀藍(lán)調(diào)脂膠囊通過調(diào)節(jié)自噬治療非酒精性脂肪肝的機(jī)制研究

黎敏儀，甘海寧，黃雪君，黃曉丹，盧秀麗，胡子旋，陳玉興［.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50095；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東 廣州 50095；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 50095］

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球最常見的慢性肝病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，NAFLD的全球患病率約為25%[1]。在我國(guó)，有研究報(bào)告[2]顯示2018年NAFLD的患病率約為32.9%，因此，對(duì)NAFLD 的防治愈發(fā)值得我們的重視。NAFLD是一種代謝性疾病，在肝臟中具有明顯的脂質(zhì)沉積，通常與氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化以及胰島素抵抗有關(guān)[3]。

近年來，NAFLD 與自噬的關(guān)系引起了大量研究者的關(guān)注，新出現(xiàn)的證據(jù)[4]支持缺陷自噬在NAFLD及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制中的核心作用。自噬是指某些蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被具有雙層膜的自噬體吞噬，與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，然后降解并循環(huán)內(nèi)容物的過程，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著不可或缺的作用。有研究[5]表明，膳食高果糖可通過刺激肌醇需求蛋白（IRE）上調(diào)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBF-1）、乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）、脂肪酸合成酶（FAS）等的表達(dá)，促進(jìn)脂肪生成，恢復(fù)自噬可以減少肝臟脂質(zhì)的異常增多。因此，自噬不僅可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝減少肝臟脂質(zhì)沉積，還可以保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷和細(xì)胞死亡。

銀藍(lán)調(diào)脂（YLTZ）膠囊是廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）自研調(diào)脂中藥新藥，由化橘紅、銀杏葉、絞股藍(lán)及酒制蜂膠組成，已取得新藥臨床試驗(yàn)批件（批件號(hào)：2012L01011），并于2018年啟動(dòng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)。前期研究證實(shí)銀藍(lán)調(diào)脂膠囊有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的作用[6-8]。本實(shí)驗(yàn)基于調(diào)節(jié)自噬相關(guān)信號(hào)通路探討銀藍(lán)調(diào)脂膠囊治療非酒精性脂肪肝的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物C57BL/6 小鼠，雌雄各半，SPF 級(jí)，8 周齡，體質(zhì)量（18±22）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018—0002。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44007200109999。飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2020—0059。飼養(yǎng)環(huán)境：23～28 ℃，相對(duì)濕度62%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批文號(hào)：049107。

1.2 藥物及試劑非諾貝特膠囊，法國(guó)利博福尼制藥有限公司，批號(hào)：32852。銀藍(lán)調(diào)脂膠囊，廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院制劑室生產(chǎn)，批號(hào)：20220727，組方為化橘紅、銀杏葉、絞股藍(lán)及蜂膠；前三藥加水煎煮2次濃縮至含生藥量0.75 g·mL-1，經(jīng)50%乙醇沉淀，再真空干燥得約15%的干浸膏；取酒制蜂膠和干浸膏，經(jīng)粉碎過篩，再加入藥用淀粉適量，混勻，干壓制粒裝入膠囊，使用時(shí)按照給藥劑量用去離子水配置成所需藥液。

高脂高膽固醇飼料（蔗糖20%，豬油15%，膽固醇1.2%，膽酸鈉0.2%，酪蛋白10%，磷酸氫鈣0.6%，石粉0.4%，預(yù)混料0.4%，基礎(chǔ)飼料52.2%），購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；總膽固醇（Total cholesterol，TC）試劑盒（批號(hào)：20220316）、甘油三酯（Triglyceride，TG）試劑盒（批號(hào)：20221209）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號(hào)：20221114）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒（批號(hào)：20221221）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）測(cè)試盒（批號(hào)：20221002）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）測(cè)試盒（批號(hào)：20221002）、載脂蛋白A1（ApoA1）測(cè)試盒（批號(hào)：20221105）、載脂蛋白B（ApoB）測(cè)試盒（批號(hào)：20221018）、載脂蛋白E（ApoE）測(cè)試盒（批號(hào)：20221006），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；小鼠丙二醛（Malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒（批號(hào)：417220614）、小鼠超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）ELISA 試劑盒（批號(hào)：535220614）、小鼠谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）ELISA 試劑盒（批號(hào)：312220614）、小鼠腫瘤壞死因子alpha（Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α）ELISA 試劑盒（批號(hào)：569220614）、小鼠白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（批號(hào)：385220614），以上試劑均購(gòu)自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司；FAS 抗體（批號(hào)：2）、ACC1 抗體（批號(hào)：8），購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；SREBF-1 抗體（批號(hào)：PAC868Mu01），購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；自噬相關(guān)蛋白5（ATG5）抗體（批號(hào)：GR43598-14），購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；GAPDH 抗體（批號(hào)AC221016006）、Beclin1 抗體（批號(hào)：AC221230028）、自噬相關(guān)蛋白3（ATG3）抗體（批號(hào)：AC221230006）、自噬相關(guān)蛋白7（ATG7）抗體（批號(hào)：AC221230031）、P62抗體（批號(hào)：AC23022 1044），均購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器Varioskan Flash 型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；5418 型小型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；JJ3000 型電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；BSA2245型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；ini-protean Teral Cell垂直電泳槽、PowerPac Basic電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；GenScript eBlot L1快速濕轉(zhuǎn)儀，中國(guó)Make research Easy 公司；Tanon 5200 Multi 多功能成像系統(tǒng)，中國(guó)Tanon公司。

2 方法

2.1 劑量換算銀藍(lán)調(diào)脂膠囊每粒含0.50 g 生藥量，根據(jù)每天3次，每次4粒的服用量，則人臨床用量為6.00 g·d-1，參考《中藥藥理研究方法學(xué)》中劑量換算方法“體表面積比”換算得出小鼠臨床等效劑量為0.78 g·kg-1，作為銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中劑量；銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量、低劑量分別為2 倍、1/2 倍臨床等效劑量，即為1.56、0.39 g·kg-1。非諾貝特膠囊的人臨床劑量為200 mg·d-1，換算得出小鼠臨床等效劑量為26.00 mg·kg-1。

2.2 分組、模型復(fù)制、給藥及取材60只雌雄各半的C57BL/6 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)選取10 只作為正常對(duì)照組，喂食普通飼料；其余50 只喂食高膽固醇鼠飼料12 周。模型復(fù)制成功后，將喂食高脂飼料的小鼠隨機(jī)分成模型組、非諾貝特組（26.00 mg·kg-1）及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高（1.56 g·kg-1）、中（0.78 g·kg-1）、低（0.39 g·kg-1）劑量組，每組10 只。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，正常組、模型組灌胃給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥30 d[9]。末次給藥1 h后，各組小鼠以3%異氟烷吸入麻醉，摘取各組小鼠眼球進(jìn)行取血，以4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min（離心半徑10 cm），吸取上清。取血后各小鼠頸椎脫臼處死，解剖取肝臟組織，拍照、稱質(zhì)量后，摘取肝臟左葉部分置于10%甲醛溶液中保存，剩余肝臟編號(hào)置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 體質(zhì)量、肝臟系數(shù)及形態(tài)觀察 動(dòng)物在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前稱量體質(zhì)量并記錄，取血后迅速分離肝臟，稱質(zhì)量、拍照，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

2.3.2 血清指標(biāo)的檢測(cè) 血清樣品分別按照試劑盒說明書操作要求進(jìn)行血脂（TG、TC、LDL-C、HDL-C）、肝功能（ALT、AST）、抗氧化功能（SOD、MDA、GSH-Px）、抗炎因子（IL-6、TNF-α）的檢測(cè)，采用Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。

2.3.3 肝臟脂質(zhì)代謝的檢測(cè) 每只小鼠稱取肝臟0.10 g 剪碎，加入冷凍PBS 0.90 mL 充分研磨，置冷凍離心機(jī)以4 ℃、5 000 r·min-1離心10 min（離心半徑10 cm）。取上清液按說明書進(jìn)行蛋白濃度及ApoA1、ApoB、ApoE 的檢測(cè)，采用Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。

2.3.4 HE 染色檢測(cè)肝組織病理學(xué) 置于福爾馬林溶液中的肝臟，經(jīng)過修整后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟包埋、切片脫蠟、HE染色后制成的病理切片，圖像采集后用ImageJ 軟件對(duì)比分析，并對(duì)比各組之間的組織病理學(xué)差異。

2.3.5 油紅O 染色檢測(cè)肝組織病理學(xué) 新鮮的肝臟，經(jīng)過修整后冰凍切片，油紅O染色后觀測(cè)制成的病理切片，圖像采集后用ImageJ 軟件對(duì)比分析，并對(duì)比各組之間的組織病理學(xué)差異。

2.3.6 Western Blotting 蛋白免疫印跡法檢測(cè)肝組織中脂肪生成和自噬相關(guān)蛋白 取肝組織充分研磨，加入ripa 裂解液提取總蛋白，BCA 檢測(cè)蛋白濃度并配平。制得SDS-PAGE 凝膠，加入樣品進(jìn)行電泳。將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 上，5%脫脂奶粉室溫封閉結(jié)束后加入相對(duì)應(yīng)的一抗，在4 ℃下過夜孵育，TBST 洗滌3 次，每次10 min。加入二抗在室溫?fù)u床孵育1.5 h，再次洗膜后置ECL 暗室化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。采用ImageJ 軟件檢測(cè)所得蛋白圖像的目標(biāo)條帶以及相應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)。蛋白表達(dá)=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間計(jì)量資料采用單因素方差分析進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果分析圖使用GraphPad Prism 8.0 軟件制作完成。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肝臟大體形態(tài)觀察結(jié)果結(jié)果見圖1。正常對(duì)照組小鼠肝臟呈紅褐色，質(zhì)地柔軟且彈性良好，邊緣清晰；模型組小鼠肝臟接近黃色，質(zhì)感厚重偏硬且無彈性，邊緣鈍；與模型組比較，非諾貝特組和銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組肝臟恢復(fù)偏紅色，質(zhì)地軟恢復(fù)彈性，質(zhì)感偏細(xì)膩。

圖1 各組小鼠肝臟大體形態(tài)觀察結(jié)果Figure 1 Observation of the general morphology of mice livers

3.2 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)NAFLD 小鼠體質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響結(jié)果如表1所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝臟系數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝臟系數(shù)均明顯降低（P＜0.01）。

表1 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝臟系數(shù)的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on body mass，liver mass and liver coefficient of NAFLD mice（±s，n=10）

表1 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝臟系數(shù)的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on body mass，liver mass and liver coefficient of NAFLD mice（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

肝臟系數(shù)/（mg·g-1）40.48±1.07 56.90±2.45**48.78±1.38##46.83±2.79##50.20±1.08##53.04±1.60##組別正常對(duì)照組模型組非諾貝特組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊低劑量組劑量/（g·kg-1）--26.00 mg·kg-1 1.56 0.78 0.39體質(zhì)量/g 20.48±0.56 23.91±0.64**21.34±0.61##21.21±0.65##21.33±0.87##21.88±0.66##肝質(zhì)量/g 0.83±0.04 1.36±0.08**1.04±0.05##0.99±0.04##1.07±0.05##1.16±0.04##

3.3 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)NAFLD 小鼠血脂的影響結(jié)果如表2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的TC、TG、LDL-C含量均明顯升高，HDL-C含量明顯降低（均P＜0.01）；與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組小鼠TC、TG、LDL-C含量均明顯降低（P＜0.01），HDL-C含量均明顯升高（P＜0.01）。

表2 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠血脂的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on blood lipids in mice with NAFLD（±s，n=10）

表2 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠血脂的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on blood lipids in mice with NAFLD（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

HDL-C/（mmol·L-1）4.57±0.30 2.50±0.47**3.79±0.39##3.60±0.70##3.59±1.04##3.15±0.18##組別劑量/（g·kg-1）正常對(duì)照組模型組非諾貝特組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊低劑量組--26.00 mg·kg-1 1.56 0.78 0.39 TC/（mmol·L-1）2.34±0.15 6.11±0.24**3.79±0.23##3.85±0.20##4.09±0.24##4.28±0.30##TG/（mmol·L-1）1.09±0.11 3.29±0.33**1.72±0.17##2.16±0.22##2.34±0.19##2.70±0.15##LDL-C/（mmol·L-1）5.63±0.79 19.64±1.38**9.29±3.20##12.23±3.40##13.02±4.30##14.65±3.34##

3.4 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)NAFLD 小鼠肝功能的影響結(jié)果如表3所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的ALT、AST 含量均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組小鼠ALT、AST含量均明顯降低（P＜0.01）。

表3 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on ALT and AST in NAFLD mice（±s，n=10）

表3 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on ALT and AST in NAFLD mice（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

AST/（mU·mL-1）5.98±0.66 9.98±1.19**6.55±0.44##6.66±0.40##7.12±0.72##7.34±0.53##組別正常對(duì)照組模型組非諾貝特組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊低劑量組劑量/（g·kg-1）--26.00 mg·kg-1 1.56 0.78 0.39 ALT/（mU·mL-1）2.87±0.08 4.03±0.35**2.80±0.01##2.79±0.00##2.80±0.01##2.84±0.04##

3.5 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)NAFLD 小鼠抗氧化功能的影響結(jié)果如表4所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的SOD、GSH-Px 含量明顯降低（P＜0.01），MDA含量明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組小鼠SOD、GSH-Px 含量均明顯升高（P＜0.01），MDA 含量均明顯減少（P＜0.01）。

表4 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠SOD、MDA、GSH-Px 含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on the content of SOD，MDA，GSH-Px in NAFLD mice（±s，n=10）

表4 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠SOD、MDA、GSH-Px 含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on the content of SOD，MDA，GSH-Px in NAFLD mice（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

GSH-Px/（U·L-1）37.74±2.07 27.62±1.63**34.35±2.04##34.92±2.65##34.79±2.47##33.76±2.12##組別劑量/（g·kg-1）正常對(duì)照組模型組非諾貝特組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊低劑量組--26.00 mg·kg-1 1.56 0.78 0.39 SOD/（U·mL-1）11.22±0.44 6.72±0.44**8.41±0.49##8.25±0.75##7.98±0.68##7.99±0.54##MDA/（mmol·mL-1）7.37±0.32 15.31±1.94**9.23±0.75##9.89±0.95##10.19±1.39##10.74±1.14##

3.6 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)NAFLD 小鼠抗炎作用的影響結(jié)果如表5所示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠的IL-6、TNFα 含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組小鼠IL-6、TNF-α含量均明顯降低（P＜0.01）。

表5 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠IL-6、TNF-α 含量的影響（±s，n=10）Table 5 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on the contents of IL-6 and TNF-α in NAFLD mice（±s，n=10）

表5 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠IL-6、TNF-α 含量的影響（±s，n=10）Table 5 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on the contents of IL-6 and TNF-α in NAFLD mice（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

TNF-α/（pg·mL-1）81.22±11.76 180.15±22.36**89.84±12.24##94.36±19.92##97.03±18.88##106.51±14.78##組別正常對(duì)照組模型組非諾貝特組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊低劑量組劑量/（g·kg-1）--26.00 mg·kg-1 1.56 0.78 0.39 IL-6/（ng·mL-1）110.49±15.59 324.59±44.24**189.54±56.79##163.59±10.54##208.52±40.68##250.70±24.58##

3.7 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響結(jié)果如表6所示。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟的ApoA1 含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中劑量組小鼠肝臟ApoA1 含量均明顯升高（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟ApoB、ApoE含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組小鼠肝臟ApoB、ApoE含量均明顯降低（P＜0.01）。

表6 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響（±s，n=10）Table 6 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on liver lipid metabolism in NAFLD mice（±s，n=10）

表6 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響（±s，n=10）Table 6 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on liver lipid metabolism in NAFLD mice（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

ApoE/（ng·mgprot-1）263.09±84.27 515.91±70.78**283.69±66.94##331.77±66.96##359.00±83.61##370.43±90.68##組別正常對(duì)照組模型組非諾貝特組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊低劑量組劑量/（g·kg-1）--26.00 mg·kg-1 1.56 0.78 0.39 ApoA1/（μg·mgprot-1）180.89±39.87 94.41±45.47**163.05±48.69#161.04±56.94#147.48±38.47#123.37±45.98 ApoB/（μg·mgprot-1）93.06±24.39 186.66±30.22**125.75±29.05##131.20±36.06##136.75±39.23##142.54±33.50##

3.8 小鼠肝臟HE 染色、油紅O 染色及脂滴面積定量結(jié)果結(jié)果見圖2。HE 染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝細(xì)胞為類八角形且形態(tài)正常，呈放射狀規(guī)則排列，邊界清晰無圓形空泡樣。模型組肝細(xì)胞排列紊亂疏松，細(xì)胞間有大量空泡樣及邊界模糊，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪樣變。非諾貝特組與銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組肝細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)變清晰，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，脂肪空泡的大小和數(shù)量均有不同程度減少，病變減輕。油紅O染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝臟只有少量零星且呈點(diǎn)狀散在的染紅的脂肪沉積，顏色淺淡。模型組肝臟內(nèi)可見分布密集的脂滴，紅色較重，形狀大而圓且部分脂滴連成片狀。與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組脂肪染色面積、紅色脂滴數(shù)量及紅色深度均有不同程度的減輕。

圖2 各組小鼠肝臟HE 染色和油紅O 染色病理觀察結(jié)果（×200）Figure 2 Pathological observation results of HE staining and oil red O staining in mice liver（×200）

見表7。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟脂滴空泡面積比、油紅O 染色面積比明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組小鼠肝臟脂滴空泡面積比、油紅O染色面積比均明顯降低（P＜0.01）。

表7 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響（±s，n=10）Table 7 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on liver lipid metabolism in NAFLD mice（±s，n=10）

表7 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響（±s，n=10）Table 7 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on liver lipid metabolism in NAFLD mice（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

油紅O 染色面積比/%0.59±0.31 16.17±0.93**2.43±0.47##6.83±3.07##8.49±3.32##9.83±1.76##組別正常對(duì)照組模型組非諾貝特組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中劑量組銀藍(lán)調(diào)脂膠囊低劑量組劑量/（g·kg-1）--26.00 mg·kg-1 1.56 0.78 0.39脂滴空泡面積比/%0.65±0.19 24.37±2.21**2.96±0.58##4.95±1.64##8.25±1.98##16.22±2.06##

3.9 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)NAFLD 小鼠肝臟脂類代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見圖3。與正常對(duì)照組比，模型組小鼠肝臟ACC1、FAS、SREBF-1 蛋白表達(dá)量均升高（P＜0.01）。與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組小鼠肝臟ACC1蛋白表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）；非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中劑量組小鼠肝臟FAS 、SREBF-1蛋白表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）。

圖3 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝臟ACC1、FAS、SREBF-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）Figure 3 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on the protein expressions of ACC1，F(xiàn)AS and SREBF-1 in the liver of NAFLD mice（±s，n=10）

3.10 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)NAFLD 小鼠自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見圖4。與正常對(duì)照組比，模型組小鼠肝臟ATG3、ATG5、Beclin1 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05，P＜0.01）；ATG7 蛋白表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；P62 蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高劑量組小鼠肝臟ATG3、ATG7 蛋白表達(dá)量均升高（P＜0.05，P＜0.01）；銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中、低劑量組小鼠肝臟ATG3蛋白表達(dá)量有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中劑量組小鼠肝臟ATG5蛋白表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；銀藍(lán)調(diào)脂膠囊低劑量組小鼠肝臟ATG5蛋白表達(dá)量有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，非諾貝特組及銀藍(lán)調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組P62蛋白表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊對(duì)非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝臟ATG3、ATG5、ATG7、Beclin1、P62 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）Figure 4 Effects of Yinlan Tiaozhi Capsules on the protein expressions of ATG3，ATG5，ATG7，Beclin1 and P62 in the liver of NAFLD mice（±s，n=10）

4 討論

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指排除酒精以及其他損傷肝臟因素作用下產(chǎn)生的肝臟病變疾病，主要特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積和沉積過多，其與一系列代謝合并癥密切相關(guān)，如肥胖、2型糖尿病、高血壓、心血管疾病和高膽固醇血癥等，代謝合并癥數(shù)量的增加不僅增加了NAFLD 的患病率，而且還使患者患進(jìn)行性肝病的風(fēng)險(xiǎn)更高[10-12]。目前市面上針對(duì)非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制有不同的藥物研究如調(diào)節(jié)代謝藥物、抵抗氧化應(yīng)激和炎癥藥物、針對(duì)腸道藥物、抗肝纖維化藥物等，通過不同的作用靶點(diǎn)對(duì)疾病進(jìn)行治療[13]。本課題組前期研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，銀藍(lán)調(diào)脂膠囊作為調(diào)脂中藥新藥，能明顯降低高脂飼料飲食所致的高脂血癥，且在巨噬細(xì)胞泡沫化中具有抑制作用，可通過激活LXR 信號(hào)通路促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)并抑制炎癥，從而調(diào)節(jié)血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過高脂飲食喂養(yǎng)建立小鼠NAFLD 模型，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清HDL-C 含量降低，TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α、ALT 和AST水平升高；對(duì)肝臟的觀察發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝臟形態(tài)肥大，顏色偏黃，邊緣鈍化，質(zhì)感厚重；HE病理切片觀察到模型組肝細(xì)胞排列紊亂，胞漿疏松，部分細(xì)胞幾乎呈空泡樣，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪樣變，油紅O 結(jié)果亦顯示小鼠肝臟脂質(zhì)增加，這些都提示NAFLD模型建立成功，也證明NAFLD的主要病理特征除了肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性外，還有肝組織的代謝性炎癥。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)小鼠血脂指標(biāo)、肝功能的檢測(cè)并觀察肝臟病理形態(tài)變化，評(píng)估銀藍(lán)調(diào)脂膠囊的藥效，發(fā)現(xiàn)NAFLD 小鼠的血脂水平、肝功能、肝臟組織病理變化、脂肪變性和炎癥水平等都得到了不同程度的改善，表明銀藍(lán)調(diào)脂膠囊能減少NAFLD 肝臟的脂質(zhì)堆積，降低肝臟的脂毒性、減輕肝臟炎癥損傷。

在肝細(xì)胞中脂質(zhì)的過度積累會(huì)使機(jī)體自由基過飽和，發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，進(jìn)而引發(fā)肝細(xì)胞氧化損傷[14]。MDA 是自由基氧化最終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，因此可通過MDA 了解脂質(zhì)過氧化的水平，間接評(píng)估組織受損程度[15]。SOD是人體內(nèi)最重要的、最高效率的自由基清除劑，可維持機(jī)體代謝平衡，防止機(jī)體過氧化損傷[16]。GSH-Px 也是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，同樣是反映機(jī)體抗過氧化能力的重要指標(biāo)之一[17]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，銀藍(lán)調(diào)脂膠囊可降低NAFLD 小鼠血清中MDA 水平，增強(qiáng)SOD 及GSH-Px 活性，具有一定的抗氧化作用，能減輕NAFLD 肝臟的氧化應(yīng)激損傷。

載脂蛋白是一種能夠結(jié)合和運(yùn)輸血脂到機(jī)體各組織進(jìn)行代謝及利用的蛋白質(zhì)，其中ApoA1 主要在肝臟和小腸合成，90%存在于高密度脂蛋白中，是運(yùn)載高密度脂蛋白的一種工具，也是組成HDL-C 的一種成分，與HDL-C呈明顯正相關(guān)；ApoB主要由肝臟合成，是LDL-C 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，二者呈正相關(guān)[18]；ApoE 主要在肝臟和腦組織合成，與脂蛋白代謝有密切相關(guān)性，往往與血漿TG 含量呈正相關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，銀藍(lán)調(diào)脂膠囊可升高NAFLD 小鼠肝臟中ApoA1水平，降低ApoB、ApoE水平，能調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，從而改善血脂水平。

本研究基于膽固醇合成代謝信號(hào)通路采用Western Blot 法檢測(cè)了小鼠肝臟中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。肝臟中SREBF-1 作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控多個(gè)脂質(zhì)合成相關(guān)基因，介導(dǎo)脂肪肝發(fā)生的進(jìn)展，F(xiàn)AS和ACC1作為SREBF-1的下游基因，參與到脂質(zhì)合成的過程中[20]。Western Blot 結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟脂質(zhì)合成因子SREBF-1、FAS、ACC1 表達(dá)增加，促進(jìn)肝臟脂肪酸積聚和TG合成，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)堆積過多而形成脂肪肝。而給予銀藍(lán)調(diào)脂膠囊干預(yù)后，小鼠肝臟中SREBF-1 及其下游因子FAS、ACC1表達(dá)量對(duì)比模型組得到不同程度減少，證明銀藍(lán)調(diào)脂膠囊能夠抑制NAFLD 小鼠肝臟的脂質(zhì)合成，減少肝臟脂肪累積，改善肝損傷與脂質(zhì)代謝。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解途徑，將細(xì)胞質(zhì)組分靶向于溶酶體降解，用于清除細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集體和損傷的細(xì)胞器，并回收材料和產(chǎn)生能量來維持細(xì)胞和組織的穩(wěn)態(tài)，其調(diào)節(jié)失調(diào)已被證明參與了多種人類疾病的發(fā)病機(jī)制[21]。自噬通過調(diào)控肝臟脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞損害，從而保護(hù)肝細(xì)胞：在NAFLD 初期，肝細(xì)胞自噬水平上調(diào)，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡、減輕細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，延緩疾病進(jìn)程；在慢性階段或長(zhǎng)期高脂飲食后，雷帕霉素靶蛋白被過度激活，自噬水平下調(diào)，自噬-溶酶體蛋白水解功能明顯下降，因此脂質(zhì)代謝異常且活性氧聚集從而加速了疾病的進(jìn)行性發(fā)展。因此，誘導(dǎo)自噬可以緩解NAFLD的疾病發(fā)展[22]。Beclin1、ATG3、ATG5、ATG7 等因子是已知重要的的自噬相關(guān)基因，其中Beclin1 參與自噬的啟動(dòng)、自噬體膜的形成和成核階段，而ATG3和ATG5是細(xì)胞自噬通路上的關(guān)鍵因子。在自噬體的形成過程中，ATG12-ATG5系統(tǒng)和LC3兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng)負(fù)責(zé)自噬體膜延伸；同時(shí)，ATG7作為類E1泛素活化酶，對(duì)于激活泛素樣蛋白ATG12與ATG5的結(jié)合也是必不可少的，并調(diào)節(jié)前LC3脂質(zhì)化以增加囊泡膜的伸長(zhǎng)[23]。P62 是一種連接泛素化蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）和自噬途徑的受體蛋白，用作自噬活性的報(bào)告基因，P62 選擇性與泛素化蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬體，之后自身隨泛素化蛋白一起通過自噬途徑降解[24]，因此，P62的蛋白水平與選擇性自噬的活性呈負(fù)相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟中Beclin1、ATG3、ATG5、ATG7 等蛋白的表達(dá)量明顯降低，而P62明顯升高；經(jīng)過銀藍(lán)調(diào)脂膠囊干預(yù)后，Beclin1、ATG3、ATG5、ATG7 等蛋白的表達(dá)量明顯升高，而P62明顯降低，變化趨勢(shì)與非諾貝特組一致。研究結(jié)果提示，自噬在NAFLD 中發(fā)揮重要的作用，銀藍(lán)調(diào)脂膠囊可通過激活自噬進(jìn)一步調(diào)控肝臟脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)，減少肝細(xì)胞損害，從而保護(hù)肝細(xì)胞。

總而言之，本研究表明，銀藍(lán)調(diào)脂膠囊可明顯改善高糖高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD 小鼠的肝損傷和肝脂代謝水平，通過自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè)證實(shí)，銀藍(lán)調(diào)脂膠囊可激活自噬通路改善NAFLD 小鼠模型的脂肪變性。此研究結(jié)果擴(kuò)大了我們對(duì)銀藍(lán)調(diào)脂膠囊在NAFLD 中藥理作用的認(rèn)識(shí)，此為通過激活自噬從而治療NAFLD 提供了理論依據(jù)，但是其確切的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。