羥考酮通過TLR4/p38MAPK通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化緩解大鼠骨癌痛①

方 軍 董慶永 劉志東 陶 宏（滕州市中心人民醫(yī)院麻醉科，滕州 277599）

骨癌痛是指部分癌癥發(fā)生骨轉(zhuǎn)移造成的疼痛反應(yīng)，發(fā)病時引發(fā)患者劇烈疼痛，且疼痛效果往往持續(xù)很長時間，對患者的身體健康和生活造成極大困擾［1］。由于其發(fā)病原因多種多樣，難以對癥下藥，目前僅通過緩解疼痛類藥物減緩疾病發(fā)作，但副作用極大，故開發(fā)具有針對性的治療藥物一直是研究的熱點［2-3］。已知有多種信號通路參與調(diào)控骨癌疼痛反應(yīng)，其中發(fā)揮重要作用的是Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）及其下游p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK），TLR4 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性高表達［4］。小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞，在神經(jīng)反應(yīng)初期即被激活引發(fā)疼痛反應(yīng)。在神經(jīng)病理性疼痛中，TLR4 是關(guān)鍵受體，調(diào)控疼痛反應(yīng)［5］。TLR4高表達可參與激活p38MAPK，兩者共同作用激活小膠質(zhì)細(xì)胞，加速神經(jīng)疼痛傳遞，加重病情［6］。

羥考酮作為一種生物堿的半合成蒂巴因衍生物，可緩解神經(jīng)傳遞，因此已被應(yīng)用于神經(jīng)麻醉［7］。臨床試驗證實其可參與緩解神經(jīng)病理性疼痛，且具有給藥途徑廣泛、成本低廉的優(yōu)點［8］。但其作用機制尚未明確，推測其可通過調(diào)控TLR4 阻礙神經(jīng)傳遞，緩解骨癌疼痛反應(yīng)，但還需進一步實驗加以說明。本研究通過構(gòu)建骨癌痛大鼠模型，探究羥考酮是否通過TLR4/p38MAPK 通路調(diào)控骨癌引起的神經(jīng)疼痛。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD 雄性健康大鼠72 只，體質(zhì)量（230±20）g，許可證號：SCXK（豫）2020-0004，購于河南環(huán)宇康禾生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 羥考酮（國藥準(zhǔn)字：J20171086）購于國藥集團工業(yè)有限公司；Walker256乳腺癌細(xì)胞液（貨號：AC340389）購于美國ATCC 公司；鹽酸曲馬多緩釋片（國藥準(zhǔn)字：H20100175）購于康德樂大藥房；TNF-α ELISA檢測試劑盒（貨號：XGS64726）購于上海西格生物科技有限公司；IL-1β ELISA 檢測試劑盒（貨號：AZ0646）購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；TLR4 激活劑Kdo2-Lipid A ammonium（貨號：HY-N8277）購于MCE 公司；TLR4抗體（貨號：ab13556）、p38MAPK 抗體（貨號：ab170099）、p-p38MAPK 抗體（貨號：ab284564）購于Abcam 公司；熱測痛儀（Bioserve，北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司）；纖維絲刺激針（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）；熒光定量PCR 儀（7500，ABI公司）；凝膠成像系統(tǒng)（H-120，上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的構(gòu)建 將72只大鼠隨機分為假手術(shù)組、骨癌痛組、陽性藥物組、羥考酮高濃度組、羥考酮低濃度組、羥考酮+TLR4 激活組，每組12只。麻醉各組大鼠，固定于操作臺上，各組大鼠左后肢消毒處理，手術(shù)刀切開表面組織，剝離筋膜暴露脛骨，假手術(shù)組立即縫合傷口并消毒處理。除假手術(shù)組外，其余大鼠于骨髓腔內(nèi)注射Walker256 乳腺癌細(xì)胞液10 μl，骨蠟封合針孔后縫合傷口，消毒處理。5 d后，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠切開枕部皮膚，進行鞘內(nèi)置管，采用無菌注射器刺破寰枕膜，觀察到腦脊液流出后置入PE-10導(dǎo)管，固定后縫合皮膚，消毒處理，假手術(shù)組不做處理。各組術(shù)后肌內(nèi)注射少量青霉素防止感染。術(shù)后陽性藥物組大鼠腹腔注射曲馬多10 mg/kg，羥考酮高濃度組大鼠腹腔注射羥考酮25 μg/kg，羥考酮低濃度組大鼠腹腔注射羥考酮5 μg/kg，羥考酮+TLR4 激活組大鼠腹腔注射羥考酮25 μg/kg和TLR4激活劑Kdo2-Lipid A ammonium 10 mg/kg，假手術(shù)組、骨癌痛組大鼠注射等劑量生理鹽水，1 次/d，連續(xù)注射10 d。該研究得到滕州市中心人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，符合動物實驗3R原則。

1.2.2 動物行為學(xué)檢測

1.2.2.1 后足熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）檢測 依據(jù)文獻［9］方法，分別于術(shù)前1 h、術(shù)后3 d、5 d、7 d、10 d進行TWL檢測，將各組大鼠分別置于玻璃箱中，設(shè)定測痛儀器指數(shù)，使輻射熱控制為定值（基礎(chǔ)值15 s 左右），照射持續(xù)時間18 s，待玻璃箱中大鼠逐漸適應(yīng)環(huán)境后，將輻射熱光源對準(zhǔn)大鼠足部中心位置，若大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng)則關(guān)閉輻射熱光源，記錄該反應(yīng)出現(xiàn)的時間。如無反應(yīng)則繼續(xù)照射直至18 s。相同實驗重復(fù)測量3次。每次測量間隔3 min以上。

1.2.2.2 機械縮足反射閾值（mechanical withdraw threshold，MWT）檢測 每次TWL 檢測后，將各組大鼠置于底部由鐵絲網(wǎng)構(gòu)成的透明玻璃箱中，采用特制的纖維絲構(gòu)造的刺激針，待大鼠充分適應(yīng)環(huán)境后，透過下層鐵絲網(wǎng)，將纖維絲以垂直方式刺激大鼠后肢足底中心位置，先是緩慢接觸，而后逐漸用力。直至大鼠回縮，記錄大鼠回縮時的最小刺激力度，取平均值，連續(xù)測量5次，每次測量間隔1 min。

1.2.3 大鼠脊髓神經(jīng)炎癥相關(guān)因子檢測 末次注射24 h 后，處死各組大鼠，手術(shù)刀切開背部皮膚，充分暴露背部組織，取脊神經(jīng)中的脊髓（L4-L6 脊髓段），部分置于4%多聚甲醛中固定備用。剩余部分液氮處理研磨至粉，取部分凍存?zhèn)溆?，剩余粉末制成勻漿，充分振蕩后離心獲取上層清液，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測脊髓中TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4 免疫熒光染色法檢測OX-42 蛋白水平 部分脊髓固定24 h 后，脫水包埋處理，冷凍切片機切片（厚度20 μm），H2O2室溫孵育后，山羊血清封閉，滴加OX-42 抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜。滴加熒光二抗（1∶1 000），常溫孵育50 min，置于熒光顯微鏡下觀察，軟件計算熒光積分光密度（integrated optical density，IOD）。

1.2.5 脊髓TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK、OX-42蛋白檢測 取出凍存?zhèn)溆玫募顾璺勰尤氲鞍琢呀庖? ml，充分裂解細(xì)胞后提取蛋白與上樣緩沖液混合振蕩，加熱變性后加入凝膠孔道中，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（GAPDH、TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK、OX-42，1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST 反復(fù)清洗3 次，2 min/次。加入二抗（1∶1 000），常溫孵育45 min，TBST 反復(fù)清洗3 次，2 min/次。混合發(fā)光液后倒于膜上，充分浸泡30 s，吸去多余液體，置于光密度掃描系統(tǒng)下檢測各組條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)均通過表示，通過SPSS22.0 軟件進行分析，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羥考酮對骨癌痛大鼠TWL、MWT 的影響 術(shù)前1 h 檢測，各組間TWL、MWT 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后3 d、5 d、7 d、10 d，與假手術(shù)組相比，骨癌痛組TWL、MWT 值顯著降低（P<0.05）；與骨癌痛組相比，陽性藥物組、羥考酮高濃度組、羥考酮低濃度組TWL、MWT 值顯著升高（P<0.05）；與羥考酮高濃度組相比，羥考酮低濃度組、羥考酮+TLR4 激活組TWL、MWT 值顯著降低（P<0.05）；陽性藥物組與羥考酮高濃度組相比，TWL、MWT 值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1、表2。

表1 各組大鼠TWL比較（，n=12，s）Tab.1 Comparison of TWL of rats in each group（，n=12，s）

表1 各組大鼠TWL比較（，n=12，s）Tab.1 Comparison of TWL of rats in each group（，n=12，s）

Note：Compared with sham operation group，1）P<0.05；compared with bone cancer pain group，2）P<0.05；compared with oxycodone high dose group，3）P<0.05.

表2 各組大鼠MWT比較（，n=12，g）Tab.2 Comparison of MWT of rats in each group（，n=12，g）

表2 各組大鼠MWT比較（，n=12，g）Tab.2 Comparison of MWT of rats in each group（，n=12，g）

Note：Compared with sham operation group，1）P<0.05；compared with bone cancer pain group，2）P<0.05；compared with oxycodone high dose group，3）P<0.05.

2.2 羥考酮對骨癌痛大鼠神經(jīng)炎癥的影響 與假手術(shù)組相比，骨癌痛組大鼠脊髓TNF-α、IL-1β 含量顯著升高（P<0.05）；與骨癌痛組相比，陽性藥物組、羥考酮高濃度組、羥考酮低濃度組大鼠脊髓TNF-α、IL-1β 含量顯著降低（P<0.05）；與羥考酮高濃度組相比，羥考酮低濃度組、羥考酮+TLR4 激活組大鼠脊髓TNF-α、IL-1β 含量顯著升高（P<0.05），陽性藥物組與羥考酮高濃度組相比，脊髓各炎癥因子含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓TNF-α、IL-1β含量比較Fig.1 Comparison of TNF-α and IL-1β contents in spinal cord of rats in each group

2.3 羥考酮對骨癌痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 與假手術(shù)組相比，骨癌痛組大鼠脊髓OX-42 IOD 水平顯著升高（P<0.05）；與骨癌痛組相比，陽性藥物組、羥考酮高濃度組、羥考酮低濃度組大鼠脊髓OX-42 IOD 水平顯著降低（P<0.05）；與羥考酮高濃度組相比，羥考酮低濃度組、羥考酮+TLR4 激活組大鼠脊髓OX-42 IOD 水平顯著升高（P<0.05），陽性藥物組與羥考酮高濃度組相比，脊髓OX-42 IOD水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2、表3。

圖2 各組大鼠脊髓OX-42蛋白表達（×200）Fig.2 Expression of OX-42 protein in spinal cord of rats in each group（×200）

表3 各組大鼠脊髓OX-42蛋白表達比較（，n=12）Tab.3 Comparison of OX-42 protein expression in spinal cord of rats in each group（，n=12）

表3 各組大鼠脊髓OX-42蛋白表達比較（，n=12）Tab.3 Comparison of OX-42 protein expression in spinal cord of rats in each group（，n=12）

Note：Compared with sham operation group，1）P<0.05；compared with bone cancer pain group，2）P<0.05；compared with oxycodone high dose group，3）P<0.05.

2.4 羥考酮對骨癌痛大鼠脊髓TLR4、p38MAPK、pp38MAPK 蛋白表達的影響 與假手術(shù)組相比，骨癌痛組大鼠脊髓TLR4 蛋白表達量、p-p38MAPK/p38MAPK 顯著升高（P<0.05）；與骨癌痛組相比，陽性藥物組、羥考酮高濃度組、羥考酮低濃度組大鼠脊髓TLR4 蛋白表達量、p-p38MAPK/p38MAPK 顯著降低（P<0.05）；與羥考酮高濃度組相比，羥考酮低濃度組、羥考酮+TLR4 激活組大鼠脊髓TLR4 蛋白表達量、p-p38MAPK/p38MAPK 顯著升高（P<0.05）；陽性藥物組與羥考酮高濃度組相比，脊髓TLR4 蛋白表達量、p-p38MAPK/p38MAPK 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠脊髓TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK 蛋白表達比較Fig.3 Comparison of TLR4，p38MAPK and p-p38MAPK protein expressions in spinal cord of rats in each group

3 討論

骨癌是一種骨惡性腫瘤，發(fā)病速度較快且發(fā)病原因多種多樣，因此難以防范和有效治療［10］。隨著腫瘤的生長，往往會引發(fā)炎癥和強烈的疼痛反應(yīng)，嚴(yán)重時會形成局部腫塊并引發(fā)功能障礙［11］。因此檢測炎癥相關(guān)因子含量變化和疼痛反應(yīng)是檢測骨癌損傷程度的重要指標(biāo)。本研究通過構(gòu)建骨癌痛大鼠模型，發(fā)現(xiàn)術(shù)后3 d、5 d、7 d、10 d，與假手術(shù)組相比，骨癌痛組TWL、MWT 值顯著降低，且大鼠脊髓TNF-α、IL-1β 含量顯著升高，表明骨癌痛大鼠疼痛明顯，存在炎癥反應(yīng)，驗證模型構(gòu)建成功，具有明顯骨癌疼痛癥狀。

羥考酮具有緩解神經(jīng)傳遞作用，因此被應(yīng)用于神經(jīng)麻醉。近年來被證實對于癌癥癌痛具有治療效果，羥考酮可以和嗎啡混合使用共同緩解肝功能受損患者癌癥癌痛［12-13］。羥考酮也可應(yīng)用于多種術(shù)后治療，緩解骨骼治療后引發(fā)的疼痛反應(yīng)［14］。因而推測羥考酮對于骨癌疼痛同樣具有治療效果。本實驗選用與羥考酮具有類似功效，且被應(yīng)用于臨床治療骨癌的鹽酸曲馬多緩釋片作為陽性對照，用于評估羥考酮的作用［15］，發(fā)現(xiàn)陽性藥物和不同濃度羥考酮處理后TWL、MWT 值顯著升高，且大鼠脊髓TNF-α、IL-1β 含量顯著降低，表明羥考酮可緩解炎癥反應(yīng)，消除疼痛，緩解骨癌病情，但其具體作用機制有待探索。近年的研究指出，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)疼痛中發(fā)揮重要作用，小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的重要組成部分，在神經(jīng)反應(yīng)早期激活，其表面抗原OX-42 特異性高表達［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，骨癌痛大鼠中OX-42 水平顯著升高，與JIN 等［18］描述一致。陽性藥物和不同濃度羥考酮處理后，OX-42 水平顯著降低，表明羥考酮通過抑制OX-42 表達，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而發(fā)揮作用。

有研究指出，TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞活化過程中高表達，參與調(diào)控神經(jīng)疼痛［19］。TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可促進脛骨癌痛的疼痛表達，加劇炎癥反應(yīng)［20］。TLR4高表達可激活下游p38MAPK 蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)性陣痛［21］。因而推測羥考酮可能通過調(diào)控TLR4/p38MAPK 通路產(chǎn)生作用。本研究發(fā)現(xiàn)，骨癌痛組大鼠脊髓TLR4蛋白表達量和p38MAPK磷酸化程度顯著升高，陽性藥物和不同濃度羥考酮處理后TLR4蛋白表達量和p38MAPK磷酸化程度顯著降低，證實了羥考酮很可能通過調(diào)控TLR4/p38MAPK 通路參與影響骨癌痛。本實驗在羥考酮作用的同時激活TLR4，發(fā)現(xiàn)激活TLR4 后，大鼠脊髓TLR4 蛋白表達量和p38MAPK 磷酸化程度顯著升高，同時TWL、MWT值顯著降低，脊髓TNF-α、IL-1β含量、OX-42水平顯著升高，進一步證實相關(guān)推測。

綜上所述，羥考酮通過調(diào)控TLR4/p38MAPK 通路，促進相關(guān)蛋白表達和激活，減輕炎癥反應(yīng)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而阻礙神經(jīng)傳遞，緩解骨癌疼痛。羥考酮是否還通過其他通路間接參與調(diào)控骨癌疼痛，有待進一步實驗加以說明。