球孢白僵菌對管氏腫腿蜂致死和寄生的次代效應(yīng)

韋 云, 李 莉, 張萌萌, 潘書梅

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 貴陽 550025)

松墨天牛Monochamusalternatus,隸屬鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)墨天牛屬Monochamus,不僅是松樹上的蛀干害蟲,還是我國重大生物災(zāi)害——松材線蟲病的重要傳播媒介昆蟲(楊忠岐等, 2012)。在森林保護(hù)中,常采用寄生性天敵昆蟲(腫腿蜂、花絨寄甲)和昆蟲病原真菌(白僵菌)等生物防治方法來防控松墨天牛幼蟲或蛹(劉洪劍, 2007; Lietal., 2017; 郭涵, 2020; 鄧竣丹, 2021),以阻斷松材線蟲傳播途徑,減少對林木的危害(周曉輝等, 2021)。此外,因天牛幼蟲鉆蛀棲息于樹木蛀道內(nèi),較為隱蔽,一般化學(xué)藥劑和生物性病原制劑很難接觸到,有研究還嘗試同時運用多種天敵資源來提高防效,如利用管氏腫腿蜂Sclerodermusguani攜帶球孢白僵菌Beauveriabassiana聯(lián)合防控松墨天牛(劉洪劍, 2007; 楊清碰和李莉, 2017; 郭涵, 2020)。

管氏腫腿蜂屬膜翅目(Hymenoptera)腫腿蜂科(Bethylidae)硬皮腫腿蜂屬Sclerodermus,是鞘翅目多種蛀干害蟲幼蟲和蛹的體外寄生蜂(楊忠岐, 2014)。因具有善爬行搜索、攻擊力強(qiáng),寄主范圍廣,繁殖力強(qiáng),發(fā)育周期短和能規(guī)模繁殖等特點,對天牛等鉆蛀性害蟲有重大的生物防治價值,已被廣泛應(yīng)用于森林防護(hù)中(Li and Sun, 2011; 來燕學(xué)等, 2015; Lietal., 2015)。同時,該寄生蜂在行為學(xué)研究方面也備受關(guān)注,尤其是其雌成蜂具有典型的單親撫育行為,該行為不僅貫穿其子代的整個發(fā)育過程,還維護(hù)和調(diào)節(jié)著它們與共棲巢穴中其他生物之間的關(guān)系,密切影響著子代的存活和發(fā)育,乃至寄生蜂種群的繁衍(黃維亞, 2017; 黃維亞和李莉, 2017; 伍紹龍等, 2017)。由于管氏腫腿蜂親代與子代這種長時間群集共棲于寄主巢穴的密切關(guān)系,也決定了寄生蜂攜菌防控天牛寄主的局限性,因為親代攜菌侵染寄主的同時也會對自身不利(楊清碰和李莉, 2017; 郭涵, 2020),而且病原菌的菌絲或孢子很有可能伴隨著寄生蜂親代撫育行為傳遞至子代群體中,直接危及其子代的存活和發(fā)育。所以,在這一類聯(lián)防技術(shù)中,寄生蜂的攜菌能力或程度至關(guān)重要,摸清病原菌對寄生蜂各世代之間的影響也尤為關(guān)鍵。而篩選出既能攜菌又能保障大部分寄生蜂個體可以存活、繁衍,實現(xiàn)病原菌通過不同世代寄生蜂進(jìn)行遠(yuǎn)距離的傳播和擴(kuò)散,才能發(fā)揮多種寄生性天敵(昆蟲病原菌、寄生蜂)的互補(bǔ)優(yōu)勢,以實現(xiàn)對林木蛀干害蟲這類隱蔽性寄主的可持續(xù)防控(陳學(xué)新等, 2017; 張宇凡和王小藝, 2019; 時敏等, 2021)。

因此,本研究基于自然棲境中球孢白僵菌和管氏腫腿蜂之間存在競爭和寄生的復(fù)雜關(guān)系,以球孢白僵菌-管氏腫腿蜂-松墨天牛三者為研究對象,設(shè)置3個球孢白僵菌孢懸液(簡稱“菌液”)濃度梯度(1×104, 1×105和1×106孢子/mL),擬探究不同濃度球孢白僵菌脅迫下,不同世代雌成蜂的孢子的平均攜帶量(簡稱“攜菌量”)及其對寄生蜂的直接影響(雌成蜂自身的壽命和生殖)和間接影響(子代的存活和發(fā)育);并結(jié)合時間-劑量-死亡率模型(time-dose-mortality model, TDM),綜合評價寄生蜂親代攜菌后對自身及其子代的致死和寄生效應(yīng),以揭示球孢白僵菌脅迫下寄生蜂的適應(yīng)性生殖策略,為闡明寄生蜂-寄主-病原菌的相互關(guān)系提供重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

管氏腫腿蜂由貴州師范大學(xué)有害生物防控及資源化利用實驗室長期用松墨天牛幼蟲續(xù)代飼養(yǎng)(F>47代),獲得穩(wěn)定的實驗種群。松墨天牛購于貴州省凱里市(26.566°N, 107.981°E),單頭單管裝在放有鋸木屑的試管中,于4～5 ℃冰箱冷藏備用。

1.2 供試菌株及球孢白僵菌懸浮液的制備

球孢白僵菌B.bassianaGZUIFR-AS1由貴州大學(xué)真菌資源研究所提供。將球孢白僵菌GZUIFR-AS1接種于PDA(Φ 90 mm)平板上于25 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(張挺峰等, 2020)。在接種并培養(yǎng)14 d后刮取孢子置于裝有無菌0.05%吐溫-80水溶液的50 mL錐形瓶中,在渦流混合器上混勻。取10 μL懸浮液用血球計數(shù)板(XB-K-25)通過直接計數(shù)確定分生孢子的數(shù)量,重復(fù)3次。并用無菌0.05%吐溫-80水溶液稀釋,將最終濃度調(diào)整為1×104, 1×105和1×106孢子/mL。

1.3 菌株的分離純化

參照溫紹海等(2022)方法進(jìn)行改良。將親代(F48代)中接種后死亡的雌成蜂個體浸入75%乙醇中1 min,取出用無菌水漂洗3～5次,用已滅菌的濾紙吸干蟲體表水分,用剪刀剪成小塊,將剪好的蟲體組織置于PDA培養(yǎng)基中,于溫度(25±1) ℃,相對濕度75%±5%的光照培養(yǎng)箱中暗黑培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后,將分生孢子轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。雌成蜂F49代中死亡個體上菌株的分離純化同前;經(jīng)過反復(fù)純化得到純化菌株,并采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)型(Sabouraud dextrose agar with yeast extract, SDAY)斜面培養(yǎng)基保存于4 ℃冰箱備用。

1.4 不同濃度球孢白僵菌孢懸液對雌成蜂的影響

1.4.1雌成蜂的攜菌能力的測定:參照楊春平(2021)對川硬皮腫腿蜂Sclerodermussichuanensis攜菌能力的測定方法,結(jié)合管氏腫腿蜂的生物學(xué)習(xí)性特點,來驗證管氏腫腿蜂雌成蜂的攜菌可能性。將雌成蜂(F48代)置于120 mm培養(yǎng)皿中,每頭雌成蜂滴上0.1 mL不同濃度(1×104, 1×105和1×106孢子/mL)的孢懸液,讓其充分爬行直至身體沾滿菌液后自然風(fēng)干。每個濃度設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)20頭供試蜂,置于恒溫箱[(26±1) ℃,RH 65%,光周期10L∶14D)]培養(yǎng)5 min以及1, 2, 3, 4, 5 和6 d后,分別將不同處理下供試蜂取出,用0.05%吐溫-80水溶液進(jìn)行洗脫,利用血球計數(shù)板計數(shù)雌成蜂的平均初始攜菌量(單位:孢子/雌)。待F48代雌成蜂的子代(F49代)羽化后,同樣方法來測定羽化當(dāng)天雌成蜂(F49代)的平均初始攜菌量,每個濃度設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)20頭供試蜂。不同世代(F48和F49代)雌成蜂的攜菌量評價方法相一致。

1.4.2球孢白僵菌對管氏腫腿蜂的致死率測定:依據(jù)1.2節(jié)中設(shè)置的濃度,取浸滿不同濃度孢懸液的雌成蜂F48代,待用。選取健康的體重在0.35～0.45 g的松墨天牛幼蟲,消毒、風(fēng)干稱重后裝入干凈的玻璃試管(Φ 75 mm),按1頭供試蜂∶0.1 g寄主單位重量的比例接蜂(張衛(wèi)光等, 2005),置于(26±1) ℃ 恒溫箱培養(yǎng)。每個濃度設(shè)置30個重復(fù);以無菌水(未接種球孢白僵菌)為對照(CK)。從接入蜂開始,每隔24 h觀察、記錄F48代雌成蜂的活力、存活情況和感染情況。記錄F48代雌成蜂的死亡蟲數(shù)并挑出死亡個體放在培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng),每24 h觀察蟲體上是否有球孢白僵菌菌絲長出,并作為判斷是否由球孢白僵菌侵染致死的依據(jù),培養(yǎng)條件同1.3節(jié)。連續(xù)觀察30 d。利用所獲數(shù)據(jù)計算雌成蜂的死亡率(mortality)、累計死亡率(cumulative mortality)和校正死亡率(corrected mortality)。累計死亡率(%)=(死亡總蟲數(shù)/總供試蟲數(shù))×100,校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)×100/(1-對照死亡率)。將各濃度處理下存活的F48代所繁育的子代(F49代)雌成蜂進(jìn)行上述相同實驗,以驗證親代(F48代)攜菌后其子代(F49代)的死亡率、累計死亡率和校正死亡率。培養(yǎng)條件同1.4.1節(jié)。

1.4.3球孢白僵菌對管氏腫腿蜂子代蜂適合度的影響:將F48代供試蜂按照1.4.1節(jié)中方法接蜂后,置于(25 ±1) ℃恒溫箱培養(yǎng)。每個濃度設(shè)置30個重復(fù);以無菌水(未接種球孢白僵菌)為對照(CK)。從接入蜂開始,每隔24 h觀察記錄F48代雌成蜂的產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵期總產(chǎn)卵量及單雌產(chǎn)卵量;子代(F49代)的平均發(fā)育歷期、存活率、單雌體重及性比(雄性占比)等生物學(xué)指標(biāo)。F49代及對應(yīng)子代F50代蜂的飼養(yǎng)方法及記錄指標(biāo)與F48代相一致。

1.4.4模型模擬分析:TDM模型同時考慮了時間效應(yīng)和劑量效應(yīng),能夠體現(xiàn)出生物測定數(shù)據(jù)的完整性和客觀性(馮明光和徐均煥, 2002)。通過上述球孢白僵菌孢懸液不同濃度劑量的設(shè)置,檢測接種后不同時間下雌成蜂的死亡情況,建立時間-劑量-死亡率模型分析,驗證孢懸液處理對寄生蜂的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)。

TDM的模型的建立:模型設(shè)定一個生物測定包含I個劑量,處理天數(shù)為J,任意時間τj(j=1, 2,……,J)在任意劑量di(i=1, 2,……,I)引發(fā)的供試蟲累計死亡概率pij可表示為:

Pij=1-exp[-exp(τj+βlg(di))]

(1)

式(1)中,待估參數(shù)β表示劑量效應(yīng)的斜率。由于累計死亡率在時間上是一個連續(xù)的數(shù)據(jù),若直接用式(1)進(jìn)行擬合不滿足模型模擬的獨立性假設(shè)。因此,考慮劑量dj使試蟲在時間區(qū)間[tj-1,tj]內(nèi)可能遭受的死亡率,即條件死亡概率:

qij=1-exp[-exp(τj+βlg(di))]

(2)

式(2)中β與式1同義,γj為描述區(qū)間[tj-1,tj]內(nèi)的時間效應(yīng)參數(shù)。條件死亡概率的計算依賴于完全相互獨立的時間區(qū)間,它是區(qū)間結(jié)束時的實際死亡數(shù)與區(qū)間起始時的存活數(shù)之比;由于滿足時間變量的獨立性假設(shè),式(2)可以進(jìn)行模型擬合,獲得參數(shù)γj后可以估計參數(shù)τj并由此估計出式(1)的所有參數(shù);式(2)的擬合通過二項式變量在時間區(qū)間[tj-1,tj]內(nèi)死亡比例(qij)和存活比例(1-qij)的最大似然函數(shù)逼近而達(dá)成(馮明光, 1998)。整個模擬及運算過程在DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算機(jī)軟件上完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗運用Excel 2021和SPSS.26.0整理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析,百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行了反正弦轉(zhuǎn)換,然后利用K-S方法檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布;如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采用單因素方差分析(ANOVA)及t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析,運用最小顯著差法(least significant difference, LSD)進(jìn)行顯著性分析;試驗數(shù)據(jù)用DPS數(shù)據(jù)處理軟件(v7.05版本)分析處理,用軟件自帶的TDM模型分析功能對生測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到球孢白僵菌對雌成蜂致病力的TDM模型模擬與參數(shù)估計,進(jìn)而分析其時間效應(yīng)和劑量效應(yīng);通過SPSS 22.6軟件中的概率單位(Probit)回歸計算雌成蜂的LT50和LT90方法,采用Origin 2021、Photoshop CS6進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度球孢白僵菌孢懸液對管氏腫腿蜂雌成蜂的影響

2.1.1雌成蜂的攜菌能力:隨攜菌時間延長,雌成蜂對各濃度球孢白僵菌懸浮液中孢子的攜帶量(簡稱為攜菌量)逐漸降低(圖1: A)。而且,F48代攜菌后所繁育的相應(yīng)子代雌成蜂F49代體表也有攜帶病原菌孢子的現(xiàn)象,且因親代接觸的菌液濃度而異(圖1: B)。

圖1 不同濃度球孢白僵菌孢懸液處理下管氏腫腿蜂親代雌成蜂(F48代)(A)及其子代(F49代)(B)的攜菌量Fig. 1 Pathogen load of the female adults of the parent (F48 generation)(A) and the offspring (F49 generation)(B) of Sclerodermus guani under different concentrations of Beauveria bassiana spore suspension將親代(F48代)雌成蜂置于120 mm培養(yǎng)皿中,每頭雌成蜂滴上0.1 mL不同濃度(1×104, 1×105和1×106 孢子/mL)的球孢白僵菌孢懸液,讓其充分爬行直至身體沾滿菌液后自然風(fēng)干。折線上不同字母指示同一代不同濃度間差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析/LSD法)。The female adults of the parent generation (F48 generation) were placed in a 120 mm Petri dish, and each female adult was dripped with 0.1 mL of B. bassiana spore suspension at different concentrations (1×104, 1×105 and 1×106 conidia/mL) and allowed to crawl until the body was covered with B. bassiana spore suspension and then air-dried. Different letters on broken lines indicate significant difference among different concentrations in the same generation (P<0.05, ANOVA/LSD).

不同濃度孢懸液(1×104, 1×105和1×106孢子/mL)處理后,F48代雌成蜂的初始攜菌量分別為0.91×104, 1.73×104和1.95×104孢子/雌(F2,6=17.023,P<0.01);將F49代初羽化雌成蜂所攜菌作為其初始菌量來計量,各濃度下的初始攜菌量為0.78×104, 1.40×104和1.51×104孢子/雌(F2,6=14.112,P<0.05),較F48代雌成蜂的初始攜菌量有所減少,減幅約為14.28%, 19.08%和22.57%。

接菌處理后3 d時,各濃度處理下親代雌成蜂F48代的攜菌量均明顯降低,僅分別為其初始攜菌量的54.82%, 45.04%和36.65%(F2,6=17.319,P<0.01);接菌處理后6 d時,雌成蜂的攜菌量降到最低,僅分別為其初始攜菌量的36.33%, 34.72%和34.34%(F2,6=15.598,P<0.01)。

對比F48和F49代雌成蜂在不同時間間隔下的攜菌量變化發(fā)現(xiàn):F49代雌成蜂羽化后第3天,雌成蜂攜菌量有所降低,分別為0.68×104, 0.72×104和0.80×104孢子/雌(F2,6=13.817,P<0.05),與同期F48代相比,F49代雌成峰的攜菌量較F48代分別下降了10.77%, 7.78%和1.72%。羽化后第6天時,雌成蜂攜菌量分別持續(xù)降至0.41×104, 0.58×104和0.61×104孢子/雌(F2,6=16.229,P<0.01),與同期F48代相比攜菌量分別降低了12.20%, 5.88%和12.86%。

2.1.2不同濃度球孢白僵菌對管氏腫腿蜂雌成蜂的致死效應(yīng):不同濃度(1×104, 1×105和1×106孢子/mL)球孢白僵菌孢懸液處理下,管氏腫腿蜂親代(F48代)雌成蜂的校正死亡率隨施用菌液濃度的增加而升高(F2,87=72.452,P<0.01),相應(yīng)子代(F49代)雌成蜂的校正死亡率也表現(xiàn)相同趨勢(F2,87=63.406,P<0.01)。高濃度(1×106孢子/mL)下,F48和F49代雌成蜂的死亡率分別為67.50%和71.67%,校正死亡率分別為60.20%和62.64%;中等濃度下(1×105孢子/mL)下,F48和F49代雌成蜂的死亡率分別為50.00%和54.17%,校正死亡率分別為38.78%和39.56%;低濃度(1×104孢子/mL)下,F48和F49代雌成蜂的死亡率分別為35.83%和41.67%,校正死亡率分別為21.43%和36.27%(表1)。F48和F49代雌成蜂的累計死亡率和體表菌絲生長的速度隨著菌液濃度的增大和接種時間的延長而增加(圖2)。同一濃度、同一處理時間下,親代雌成蜂 F48代的累計死亡率(圖2: A)高于其對應(yīng)子代雌成蜂F49代的累計死亡率(圖2: B)。親代(F48代)雌成蜂在接種高濃度球孢白僵菌(1×106孢子/mL)孢懸液20 d時死亡率達(dá)到50.83%(圖2: A),其相應(yīng)子代蜂(F49代)在羽化后第18天死亡率達(dá)到50.00%(圖2: B);而同期1×104和1×105孢子/mL濃度處理下,F48和F49代雌成蜂死亡率均低于40.00%(圖2: A, B)。F48(圖3:A-L)和F49(圖3: M-X)代死亡的雌成蜂個體上菌絲的生長狀況見圖3。

圖2 不同濃度球孢白僵菌孢懸液對管氏腫腿蜂親代(F48代)(A)及其子代(F49代)(B)雌成蜂的致病力Fig. 2 Pathogenicity of different concentrations of Beauveria bassiana spore suspension to female adults of the parent (F48 generation)(A) and the offspring (F49 generation)(B) of Sclerodermus guani

圖3 管氏腫腿蜂親代(F48代)雌成蜂攜帶球孢白僵菌后死亡個體及其子代(F49代)死亡雌成蜂上的菌絲生長情況Fig. 3 Hyphal growth on the dead female adults of the parent (F48 generation) of Sclerodermus guani after carrying Beauveria bassiana and the dead female adults of its offspring (F49 generation)A-D: 分別為在1×104孢子/mL球孢白僵菌孢懸液處理下F48代雌成蜂死亡后第1-4天體表菌絲生長Hyphal growth at 1-4 d after the death of female adults of F48 generation treated with B. bassiana spore suspension at the concentration of 1×104 conidia/mL, respectively; E-H: 分別為在1×105孢子/mL球孢白僵菌孢懸液處理下F48代雌成蜂死亡后第1-4天體表菌絲生長Hyphal growth after the death of female adults of F48 generation treated with B. bassiana spore suspension at the concentration of 1×105 conidia/mL, respectively; I-L: 分別為在1×106孢子/mL球孢白僵菌孢懸液處理下F48代雌成蜂死亡后第1-4天體表菌絲生長Hyphal growth at 1-4 d after the death of female adults of F48 generation treated with B. bassiana spore suspension at the concentration of 1×106 conidia/mL, respectively; M-P: 分別為在1×104孢子/mL球孢白僵菌孢懸液處理下F49代雌成蜂死亡后第1-4天體表菌絲生長Hyphal growth after the death of female adults of F49 generation treated with B. bassiana spore suspension at the concentration of 1×104 conidia/mL, respectively; Q-T: 分別為在1×105孢子/mL球孢白僵菌孢懸液處理下F49代雌成蜂死亡后第1-4天體表菌絲生長 Hyphal growth at 1-4 d after the death of female adults of F49 generation treated with B. bassiana spore suspension at the concentration of 1×105 conidia/mL, respectively; U-X: 分別為在1×106孢子/mL球孢白僵菌孢懸液處理下F49代雌成蜂死亡后第1-4天體表菌絲生長Hyphal growth at 1-4 d after the death of female adults of F49 generation treated with B. bassiana spore suspension at the concentration of 1×106 conidia/mL, respectively.

2.1.3球孢白僵菌脅迫下親代雌成蜂的適合度變化:不同濃度球孢白僵菌(1×104, 1×105和1×106孢子/mL)孢懸液處理親代(F48代)雌成蜂后,與對照相比,產(chǎn)卵前期顯著縮短(F2,87=10.350,P<0.01),產(chǎn)卵期顯著延長(F2,87=8.121,P<0.05)(圖4: A);對應(yīng)子代(F49代)雌成蜂也呈現(xiàn)相同的趨勢(F2,87=13.430,P<0.01;F2,87=10.821,P<0.01)(圖4: B)。1×104, 1×105和1×106孢子/mL濃度處理下, F48代雌成蜂的產(chǎn)卵前期分別為4.00, 3.60和3.00 d,較對照(5.03 d)分別縮短了1.03, 1.43和2.03 d;產(chǎn)卵期分別為4.30, 5.00和5.30 d,較對照(4.00 d)分別延長了0.30, 1.00和1.30 d。相應(yīng)子代(F49代)雌成蜂的產(chǎn)卵期分別為3.60, 3.20和3.00 d,較對照(4.00 d)分別縮短了0.30, 0.80和1.00 d;產(chǎn)卵期分別3.73, 3.43和3.00 d,較對照(3.00 d)分別延長了0.43, 0.73和1.43 d。

圖4 管氏腫腿蜂親代(F48代)雌成蜂接種不同濃度球孢白僵菌孢懸液后其自身及子代(F49代)的產(chǎn)卵前期(A)及產(chǎn)卵期(B)Fig. 4 Pre-oviposition period (A) and oviposition period (B) of female adults of the parent (F48 generation) and the offspring (F49 generation) of Sclerodermus guani after inoculation of female adults of the parent with different concentrations of Beauveria bassiana spore suspension柱/折線上不同小寫和大寫字母分別指示F48和F49代不同濃度間差異顯著(P<0.05, 單因素方差分析/LSD法)。圖5同。Different small and capital letters above bars/broken lines indicate significant difference among different concentrations in the F48 generation and F49 generation, respectively (P<0.05, ANOVA/LSD). The same for Fig. 5.

親代(F48代)雌成蜂攜帶1×104和1×106孢子/mL球孢白僵菌后對子代(F49代)的總產(chǎn)卵量無顯著影響 (圖5: A)(P>0.05), 但攜菌后單雌產(chǎn)卵量隨濃度升高而顯著降低(圖5: B)(F48:F2,87=7.530,P<0.01; F49:F2,87=5.132,P<0.05)。在不同濃度(1×104, 1×105和1×106孢子/mL)球孢白僵菌脅迫下,F48代雌成蜂的總產(chǎn)卵量分別為144.77, 157.13和150.30粒,與對照(139.97粒)相比分別增加了4.80, 17.16和10.33粒;對應(yīng)子代雌成蜂F49代的總產(chǎn)卵量分別為149.40, 162.87和146.97粒,與對照(137.83粒)相比分別增加了11.57, 25.04和9.14粒。F48代雌成蜂的單雌產(chǎn)卵量分別為20.18, 17.19和8.27粒,與對照(24.25粒)相比分別減少了4.07, 7.06和15.98粒;而F49代雌成蜂的單雌產(chǎn)卵量分別為16.78, 12.71和1.61粒,與對照(22.08粒)相比分別減少了5.30, 9.37和20.47粒。

圖5 管氏腫腿蜂親代(F48代)雌成蜂接種不同濃度球孢白僵菌孢懸液后其自身及子代(F49代)的繁殖力Fig. 5 Fecundity of the female adults of the parent (F48 generation) and the offspring (F49 generation) of Sclerodermus guani after inoculation of female adults of the parent with different concentrations of Beauveria bassiana spore suspensionA: 總產(chǎn)卵量Total number of eggs laid; B: 單雌產(chǎn)卵量Number of eggs laid per female.

2.2 球孢白僵菌脅迫下子代蜂的適合度變化

親代(F48代)攜菌后,其子代(F49和F50代)各發(fā)育階段存活率(圖6)及羽化率(圖7)降低,F49和F50代雄性占比在1×104和1×106孢子/mL下降低,在1×105孢子/mL下升高,同時F49和F50代單雌體重均增加(圖8)。

圖6 管氏腫腿蜂親代(F48代)雌成蜂接種不同濃度球孢白僵菌孢懸液后F49(A)及F50(B)代各齡期存活率Fig. 6 Survival rates of F49 (A) and F50 (B) generations of Sclerodermus guani at different developmental stages after inoculation of female adults of the parent (F48 generation) with different concentrations of Beauveria bassiana spore suspension

圖7 管氏腫腿蜂親代(F48代)雌成蜂接種不同濃度球孢白僵菌孢懸液后F49(A)及F50(B)代成蜂羽化率及雄性占比Fig. 7 Emergence rates and proportions of males of the adults of F49(A) and F50 (B) generations of Sclerodermus guani after inoculation of the female adults of the parent (F48 generation) with different concentrations of Beauveria bassiana spore suspension

圖8 管氏腫腿蜂親代(F48代)雌成蜂接種不同濃度球孢白僵菌孢懸液后F49和F50代雌成蜂的體重變化Fig. 8 Changes in the body weight of the female adults of F49and F50 generations of Sclerodermus guani after inoculation of the female adults of the parent (F48 generation) with different concentrations of Beauveria bassiana spore suspension

對比分析同一濃度處理下不同世代(F49和F50代)的適合度,F48代攜菌后降低了其F49代(圖6: A)及F50代(圖6: B)各發(fā)育階段(卵、低齡幼蟲、高齡幼蟲、老熟幼蟲、吐絲幼蟲和蛹)的存活率(卵: F49:F2,87=5.457,P<0.01; 低齡幼蟲:F2,87=5.118,P<0.01; 高齡幼蟲:F2,87=6.621,P<0.01; 老熟幼蟲:F2,87=7.709,P<0.01; 吐絲幼蟲:F2,87=11.171,P<0.01; 蛹:F2,87=11.881,P<0.01; F50: 卵:F2,87=7.312,P<0.01; 低齡幼蟲:F2,87=9.514,P<0.01; 高齡幼蟲:F2,87=16.975,P<0.01; 老熟幼蟲:F2,87=8.440,P<0.01; 吐絲幼蟲:F2,87=3.904,P<0.01; 蛹:F2,87=4.598,P<0.01)。與F49代相比,F50代的雄性占比及羽化率(圖7: A, B)分別降低了16.21%和19.40%。親代(F48代)雌成蜂在不同濃度球孢白僵菌脅迫下, F49代(圖7: A)中雄蜂的平均占比約為10.35%(F2,87=9.169,P<0.01),F50代(圖7: B)中雄蜂平均占比為5.18%(F2,87=2.057,P>0.05),與對照相比,F49和F50代的雄性占比分別下降了1.95%和0.22%。F49代(圖8)的單雌體重約為0.68 mg(F2,87=4.011,P<0.05),F50代(圖8)的單雌體重約為1.27 mg(F2,87=4.945,P<0.01),與對照相比,F49和F50代的單雌體重分別增加了0.09和0.94 mg。

在不同濃度處理下,親代(F48代)攜菌后對子代(F49和F50代)的發(fā)育進(jìn)程產(chǎn)生不利影響。106孢子/mL球孢白僵菌處理下,F50代的蛹?xì)v期比F49代的縮短了約1.00 d(t=7.616,df=29,P<0.01)。104孢子/mL球孢白僵菌處理下F50代比F49代的代時縮短了3.00 d(t=10.083,df=29,P<0.01); 105孢子/mL球孢白僵菌處理下F50代比F49代的代量縮短了3.00 d(t=23.470,df=29,P<0.01); 106孢子/mL下F50代比F49代的代時縮短了4.00 d(t=38.744,df=29,P<0.01)(表2)。而同一濃度下,親代(F48代)攜菌后對F49和F50代的平均發(fā)育歷期無影響(P>0.05)(表2)。

2.3 模型模擬分析

通過時間-劑量-死亡率模型對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行建模分析(表3, 4)。模型中γ值反映在接種后第j個時段里雌成蜂的平均死亡率。條件死亡率模型中各處理劑量與時間效應(yīng)參數(shù)的t測驗值均達(dá)到極顯著水平,說明時間、劑量及其二者之間的互作效應(yīng)對雌成蜂的死亡率均有顯著貢獻(xiàn)。

表3 管氏腫腿蜂親代(F48代)雌成蜂攜帶球孢白僵菌后生測的時間-劑量-死亡率(TDM)模型模擬與參數(shù)估計Table 3 Parameters estimated from modeling of the time-dose-mortality (TDM) using bioassay of the female adultsof the parent (F48 generation) of Sclerodermus guani carrying Beauveria bassiana

表4 管氏腫腿蜂子代(F49代)雌成蜂攜帶球孢白僵菌后生測的時間-劑量-死亡率(TDM)模型模擬與參數(shù)估計Table 4 Parameters estimated from modeling of the time-dose-mortality (TDM) using bioassayof the offspring (F49 generation) of Sclerodermus guani carrying Beauveria bassiana

根據(jù)TDM模型估計出球孢白僵菌侵染管氏腫腿蜂雌成蜂F48代(圖9: A)及其子代雌成蜂F49代(圖9: B)的劑量效應(yīng)值。F48代雌成蜂隨菌液處理時間的延長,F48代及對應(yīng)子代F49代的致死時間(LT50和LT90)的對數(shù)值隨之降低,劑量效應(yīng)增強(qiáng);隨著致死劑量對數(shù)值升高,雌成蜂致死時間縮短,時間效應(yīng)增強(qiáng)。即致死時間隨著菌液濃度的增加而縮短,當(dāng)濃度為1×106孢子/mL時,對F48和F49代雌成蜂LT50值分別為22.72 d和24.52 d(圖9: A, B)。

圖9 親代接種不同濃度球孢白僵菌孢懸液的管氏腫腿蜂親代(F48代)(A)及子代(F49代)(B)雌成蜂的致死時間值(LT50和LT90)的對數(shù)值Fig. 9 Logarithms of the medium lethal time values (LT50 and LT90) of the female adults of the parent (F48 generation) and the offspring (F49 generation) of Sclerodermus guani after inoculation of the parent with different concentrations of Beauveria bassiana spore suspension

3 討論

在自然條件下,植食者與其多種天敵棲息于同一環(huán)境,有的廣譜性天敵微生物不僅會以植食者為寄主,還會寄生寄主的寄生蜂,它們之間在相同和不同營養(yǎng)水平上有著密切關(guān)系,這與兼性捕食(intraguild predation, IGP)現(xiàn)象相一致。當(dāng)捕食者、寄生者共同享用(share)或競爭(compete)相同獵物(prey)或寄主(host)資源時,又發(fā)生單向或雙向甚至多層兼性營養(yǎng)關(guān)系,即IGP(Rosenheimetal., 1995)或集團(tuán)內(nèi)捕食。IGP現(xiàn)象中較為常見形式有4種,包括:昆蟲病原真菌均能侵染寄主昆蟲及其寄生蜂;植食性昆蟲被寄生后又發(fā)生重寄生蜂(hyperparasitoid)寄生的情況;捕食者攻擊已被寄生蜂寄生的植食者,以及存在于能相互攻擊的兩種捕食者與其寄主之間(Rosenheimetal., 1995; Perieretal., 2022)。這些多種生物之間的相互制約或互作關(guān)系,影響著群落的動態(tài)變化,所以該理論在農(nóng)林有害生物的生態(tài)防治中應(yīng)用頗為廣泛,尤其是線蟲、節(jié)肢動物的生物防治中,常用于“天敵-寄主”種群動態(tài)的監(jiān)測與防效評價(Xueetal., 2012; Aguirreetal., 2021)。鑒于此,引入或利用天敵防治有害生物時,摸清不同類型天敵和靶標(biāo)害蟲之間的種間關(guān)系是十分必要的。在本研究中,球孢白僵菌均能侵害和寄生松墨天牛及其寄生蜂管氏腫腿蜂,三者之間有典型IGP發(fā)生的可能性,釋放任意一種天敵,都會受到另外一種天敵的不同程度影響;當(dāng)利用寄生蜂攜菌防控天牛時,更不能忽略病原菌對寄主、寄生蜂種群所帶來的影響(黃維亞, 2017; 楊清碰和李莉, 2017)。此外,據(jù)野外調(diào)查發(fā)現(xiàn),松墨天牛的自然天敵種類約97種,包括17種昆蟲病原微生物、27種捕食性天敵、19種寄生性天敵、1種蜘蛛類和33種捕食性鳥類(張翌楠和楊忠岐, 2006)。其中,球孢白僵菌是松墨天牛蛀道和蛹室中最為常見的廣譜性昆蟲病原真菌(徐福元, 1998; 王四寶等, 2003)。因此,該病原菌不僅影響著寄主天牛幼蟲或蛹的存活及生長發(fā)育,同樣也會致死或寄生寄主天牛的其他天敵昆蟲,并在同一棲境中相互作用,構(gòu)成復(fù)雜的營養(yǎng)關(guān)系和非營養(yǎng)關(guān)系,關(guān)聯(lián)著不同寄生者的傳播和繁衍。

實驗結(jié)果表明,球孢白僵菌能通過寄生蜂親代撫育行為傳遞給下一代,甚至多代(如:F49和F50代),并對其后代適合度造成不同程度的影響。同時,我們發(fā)現(xiàn),在1×104和1×105孢子/mL條件下,球孢白僵菌的存在并沒有完全致死寄主天牛或寄生蜂,對寄主天牛的平均寄生率在75.00%以上,而寄生蜂一旦寄生成功必然導(dǎo)致寄主天牛死亡(楊清碰和李莉, 2017)。因為管氏腫腿蜂雌成蜂能主動搜索、定位和利用宿主及其棲息環(huán)境,找到適宜寄主后便會進(jìn)行蜇刺、麻痹,最終導(dǎo)致寄主完全死亡(Liuetal., 2021)。顯然,當(dāng)利用寄生蜂攜菌侵染寄主天牛時,為三者共存于相對穩(wěn)定的半封閉式蛹室中提供了密切互作的環(huán)境和機(jī)會(劉洪劍, 2007; 楊清碰和李莉, 2017)。當(dāng)親代雌成蜂應(yīng)對球孢白僵菌脅迫時, 會采取縮短產(chǎn)卵前期(圖4: A)、 延長產(chǎn)卵期(圖4: B)、增加產(chǎn)卵量(圖5: A, B)、加快子代發(fā)育速率(表2)等一系列生殖策略,以及親代雌成蜂的撫育、合作等亞社會性行為,也有利于寄生蜂抵御病原菌侵染,在兩者競爭賽跑中奪取時間優(yōu)勢;而實驗標(biāo)明,子代蜂羽化后攜帶白僵菌的概率可高達(dá)93.33%。從另一個角度來看,當(dāng)寄主天牛被寄生蜂致死后,意味著病原菌缺失了離開寄主巢穴的傳播者——寄主天牛,而此時寄生蜂所繁育的后代就有可能成為病原菌遠(yuǎn)距離傳播的重要載體。如同“搭便車”理論,“松墨天牛-松材線蟲-藍(lán)變菌(ophiostomatoid fungi)”是搭便車?yán)碚摰牡湫桶咐?藍(lán)變菌借助松材線蟲為載體,又隨之一起被羽化后的松墨天牛成蟲攜帶著離開蛹室,并在松墨天牛取食補(bǔ)充營養(yǎng)時再侵入馬尾松體內(nèi),如此往復(fù),進(jìn)而實現(xiàn)伴生真菌的侵染循環(huán)及其寄主的成功入侵機(jī)制(Zhaoetal., 2014)。

這種寄生物借助媒介生物載體被動傳播的現(xiàn)象有很多。例如,水稻條紋病毒(rice stripe virus, RSV)和水稻黑條矮縮病(rice black streaked dwarf virus, RBSDV)能借助灰飛虱Laodelphaxstriatellus以持續(xù)繁殖的方式在水稻中傳播(Moya Fernándezetal., 2021);黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus, CMV)能借助棉蚜Aphisgossypii的遷飛活動實現(xiàn)傳播(潘敬, 2018)。研究發(fā)現(xiàn),球孢白僵菌也具有借助寄生蜂“搭便車”的可能性。用球孢白僵菌處理親代(F48代)后,其子代(F49代)中雌成蜂體表均有檢測出該病原菌的孢子,平均攜菌量雖然有所降低,但在第3天后每頭蜂的攜菌量穩(wěn)定在0.76×104孢子/雌水平(圖1: A, B)。對比F48代和F49代的初始攜菌量,可以看出不同世代雌成蜂在同一濃度下的初始攜菌量相當(dāng)。這表明,球孢白僵菌脅迫下,管氏腫腿蜂寄生寄主和繁殖后代期間,病原菌沒有消亡而是在緩慢的持續(xù)生長。對比兩者的生活史,寄生蜂完成1代約30～35 d(表2),而病原菌約在13～14 d左右產(chǎn)生新的孢子,與實驗室前期研究相一致(黃維亞, 2017)。由此可見,在寄生蜂子代完成變態(tài)發(fā)育過程中,病原菌亦可同步生長繁殖至少2代,這也是寄生蜂子代(F49代)的初始攜菌量接近于親代(F48代)的初始攜菌量水平的重要原因。而在低濃度、中等濃度的球孢白僵菌孢懸液條件下,大部分雌成蜂仍能正常致死、寄生寄主,取決于它們獨特的處理寄主和繁衍后代的方式。一方面,因該雌成蜂具有抑生型的寄生特性,蜇刺寄主并注入毒液后導(dǎo)致寄主完全死亡;有研究表明,其毒素有助于寄主體內(nèi)血淋巴處于保鮮狀態(tài),不僅滿足子代蜂的取食和營養(yǎng)需求,還能抑制病原菌侵染(李麗芳等, 2021)。另一方面,貫穿整個子代發(fā)育期間的雌成蜂撫育行為在很大程度上減少了病原孢子的初始量,如附肢摩擦、梳理、衛(wèi)生、搬運子代,甚至取食發(fā)育不良或被侵染的后代等行為(黃維亞, 2017; 楊清碰和李莉, 2017),都有可能降低病原菌孢子數(shù)量,從而削弱病原菌和寄生蜂對于同一寄主資源的競爭力。所以,從某種程度而言,“管氏腫腿蜂-球孢白僵菌”在局域環(huán)境條件下,當(dāng)前者在寄生寄主(松墨天牛)上具有競爭優(yōu)勢后,后者可能會潛伏下來,既不消亡也不快速生長,而是在最小資源利用中緩慢生長來契合寄生蜂的生長發(fā)育過程,待寄生蜂子代羽化后,便能巧妙實現(xiàn)搭乘“便車”遠(yuǎn)距離擴(kuò)散、蔓延的目的。

在無病原菌處理的對照組中,親代(F48代)及子代(F49代)雌成蜂的死亡率約在18.33%～24.17%(表1),F49代的死亡率略高,這可能源于寄生蜂在蟄刺時因健康寄主活動力和攻擊性強(qiáng)的原因所致(Mesterton-Gibbons and Hardy, 2021)。與此相比,攜菌對寄生蜂(F48代)帶來的影響因球孢白僵菌孢懸液濃度而異。高濃度時(1×106孢子/mL),雖然雌成蜂死亡率接近70.00%(表1),但總產(chǎn)卵量在150粒左右(圖5: A);而同期,低濃度(1×104孢子/mL)和中等濃度(1×105孢子/mL)下,雌成蜂存活率均在65.00%以上(表1),總產(chǎn)卵量也在154粒左右(圖5: A),說明大部分寄生蜂個體在攜帶一定量病原菌后仍能存活,且對其繁殖力和子代適合度影響不大。這對寄生蜂攜菌聯(lián)防技術(shù)實施是有利的。在寄生蜂攜帶病原微生物防治靶標(biāo)害蟲的應(yīng)用中已有許多成功的案例。例如,利用稻螟赤眼蜂Trichogrammajaponicum攜帶球孢白僵菌對二化螟Chilosuppressalis的生防實例中,稻螟赤眼蜂有的攜菌個體死亡后,白僵菌孢子在其體表大量繁殖,而存活的寄生蜂則會將病原菌攜帶到二化螟卵表面,進(jìn)而實現(xiàn)白僵菌在二化螟種群中傳播、增殖和擴(kuò)散(李美君,2019)。又如,葉斌等(2011)利用寄生性天敵東亞異蚤蠅Megaseliaspiracularis攜帶球孢白僵菌能明顯提高對松墨天牛的防治效果。此外,還有利用黃色梢小蠹Cryphalusfalvus等松林共棲鉆蛀性昆蟲攜帶球孢白僵菌的進(jìn)入樹皮下或天牛蛀道內(nèi),侵染松墨天牛幼蟲達(dá)到防治的目的(Kinuuraetal., 1999)。此外,作為活體生物載體,昆蟲病原菌、寄生蜂、捕食性昆蟲等天敵資源在野外釋放后,其種群在自然條件下的繼續(xù)增殖、二次侵染、繼代侵染等可能性都影響著對靶標(biāo)有害生物的防治效果(趙正萍等, 2015)。據(jù)報道,在林間噴施春尺蠖核型多角體病毒(Apocheimacinerariusnucleopolyhedrovirus, AciNPV)防治春尺蠖,當(dāng)年效果可達(dá)90.00%以上,次年約在70.00%左右,且控害效果可持續(xù)5年(齊躍強(qiáng), 2006)。通過TDM模型分析結(jié)果描述不同濃度球孢白僵菌與雌成蜂間的互作關(guān)系(表3, 4),致死時間隨著孢子懸液濃度的增加而縮短,當(dāng)孢子濃度為1×106孢子/mL時,對F48和F49代雌成蜂LT50的值分別為22.72 d和24.52 d(圖9: A, B)。因此,“寄生蜂-昆蟲病原菌”聯(lián)合應(yīng)用時,寄生蜂最佳攜菌濃度是防控靶標(biāo)寄主的重要前提條件,不僅與寄生蜂自身結(jié)構(gòu)對病原菌的攜帶可能性有關(guān),還取決于病原菌對寄生蜂存活、繁殖的影響程度的綜合評價。而不同濃度球孢白僵菌孢懸液在對兩代雌成蜂進(jìn)行生測時,1×104和1×105孢子/mL球孢白僵菌下雌成蜂在測試時間內(nèi)死亡率均未達(dá)到50.00%;通過TDM模型證實管氏腫腿蜂攜帶1×105孢子/mL的球孢白僵菌懸浮液是最為適合的濃度,即能保證有效攜菌量的同時對雌成峰的致死風(fēng)險較低。在防治時,優(yōu)先選取1×105孢子/mL具有較好的應(yīng)用潛力。

寄生蜂攜菌的同時也會面臨昆蟲病原微生物的脅迫。同大多數(shù)昆蟲一樣,寄生蜂可以通過自身表皮結(jié)構(gòu)物理防御、行為防御、化學(xué)防御和體內(nèi)免疫防御系統(tǒng)來抵御病原微生物的侵害(Souzaetal., 2013; Vogelweithetal., 2017)。首先,表皮是昆蟲的第一道物理防線,昆蟲表皮中主要成分為幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì),能阻擋一定程度的病原真菌入侵,還具有保持體內(nèi)代謝平衡的作用(許維康, 2022)。本研究評估管氏腫腿蜂雌成蜂初始攜菌量時,亦發(fā)現(xiàn)雌成蜂體表和附肢表面較為光滑、不易附著孢子粉,所以在寄生蜂攜菌技術(shù)上,往往是借助了球孢白僵菌孢懸液中載體溶液的內(nèi)聚性和吸附性以保證寄生蜂的體表攜菌量。由此可見,昆蟲的行為活動也是抵御病原微生物侵染的關(guān)鍵。本實驗通過對比F48代和F49代雌成蜂的攜菌量,發(fā)現(xiàn)孢懸液處理后前3 d孢子的脫落量較大,其原因可能與雌成蜂擺尾、拱背、摩擦足、或以后足摩擦腹部表面等一系列行為有關(guān);尤其是在低濃度孢懸液下,雌成蜂的這些行為表現(xiàn)能發(fā)揮重要防御作用。其次,化學(xué)防御也是昆蟲體外免疫防御的重要途徑,除了分泌腺體分泌至體外的化學(xué)防御物質(zhì)以外,表皮自身所包含的脂肪酸類物質(zhì),均能起到化學(xué)防御的作用(Souzaetal., 2013; Huarte-Bonnetetal., 2018)。例如,外寄生蜂扁頭泥蜂Ampulexcompressa的幼蟲體表能分泌抑制病原微生物生長的活性物質(zhì),保障自身在缺失親代照料后亦能應(yīng)對病原微生物的侵害(Herzneretal., 2013)。與之相比,實驗室前期研究中也發(fā)現(xiàn)了管氏腫腿蜂具有相似的化學(xué)防御特征,而且子代蜂在不同發(fā)育階段的體表碳?xì)浠衔?cuticular hydrocarbons, CHCs)種類和數(shù)量上均有明顯差異,我們推測這些變化與該寄生蜂對外來物的化學(xué)防御有著密切關(guān)系(Li and Sun, 2011; Lietal., 2015; 黃維亞, 2017)。這有可能是管氏腫腿蜂未發(fā)育成熟階段通過CHCs抑制或減緩球孢白僵菌生長蔓延的重要防御策略之一。然而,與扁頭泥蜂不同的是,管氏腫腿蜂親代雌成蜂撫育行為貫穿于子代整個發(fā)育過程中,并受到子代CHCs的調(diào)節(jié)和影響,會引起雌成蜂在子代乞求照料中增加其游走、觸碰和搬運等行為的頻率和時間投入,以及子代老熟幼蟲離開寄主殘骸聚集化蛹的空間分布型(Lietal., 2015; 黃維亞, 2017)。除此之外,當(dāng)病原物突破寄主昆蟲的體外防線侵入機(jī)體后,還會面對寄主的細(xì)胞免疫和體液免疫等體內(nèi)免疫反應(yīng),前者主要是通過免疫細(xì)胞對外來入侵病原物的吞噬、結(jié)節(jié)和包囊等活動來抵御;后者則是通過黑化作用等免疫機(jī)制,或借助IMD和TOLL信號通路誘導(dǎo)形成抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)等天然免疫因子來抑制病原微生物的滋生和侵害(王遠(yuǎn)等, 2018)。在寄生蜂中,絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpins)能對胞外絲氨酸蛋白酶激活級聯(lián)起到負(fù)調(diào)控作用,從而負(fù)調(diào)控TOLL信號通路,誘導(dǎo)抗菌肽的表達(dá)(Baoetal., 2018; 周詩敏等, 2021)。但是,目前對管氏腫腿蜂應(yīng)對病原菌的防御反應(yīng)及其機(jī)制的研究報道較少。因此,本研究有助于今后深入研究管氏腫腿蜂應(yīng)對病原菌脅迫的體內(nèi)、外免疫防御機(jī)制,為利用多種寄生性天敵進(jìn)行生物防治的技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。