純水培養(yǎng)對重金屬污染地區(qū)紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌群落多樣性及潛在功能的影響

馬微微, 徐海軒, 曹 威, 閆春財(cái), 孫澤陽

(天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 天津市動(dòng)物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300387)

搖蚊隸屬于雙翅目(Diptera)搖蚊科(Chironomidae),分布廣泛,種類繁多,是水生大型無脊椎動(dòng)物中豐度和多樣性極高的類群之一。其生活史為完全變態(tài)發(fā)育,經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)生命周期(李志宇等, 2010),其中90%的時(shí)期以幼蟲形式生活在水體底泥中,種群密度較大,能夠適應(yīng)不同種類的淡水水體,是魚類和鳥類的重要食物(Yuetal., 2020)。搖蚊可作為水體生態(tài)環(huán)境的重要生物指示物,廣泛應(yīng)用于生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估(丁煌英等, 2017; 周東等, 2018; 王麗媛等, 2019)。一方面,水體富營養(yǎng)化使得搖蚊在水庫、湖泊類水源中大量繁殖;另一方面,特定種類搖蚊對于污染源(如重金屬、殺蟲劑、抗生素等)呈現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性(Surber, 1959; Lydy and Austin, 2005)。因此,搖蚊幼蟲作為水生生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)生物開展個(gè)體解毒耐受機(jī)制的相關(guān)研究也在持續(xù)進(jìn)行(Caoetal., 2016; Martínez-Paz, 2018)。目前,針對搖蚊個(gè)體抗性機(jī)制的研究多局限于從解毒代謝體系中特定基因的表達(dá)變化等方面出發(fā),而從其他角度切入的機(jī)制性研究較為匱乏。

在長期的進(jìn)化過程中,昆蟲及其腸道菌群共同生存,協(xié)同進(jìn)化,形成了不可分割的共生關(guān)系,在促進(jìn)個(gè)體營養(yǎng)代謝、消化和解毒、參與發(fā)育生長、抵抗外來病原入侵、提高宿主抗脅迫能力及免疫活性等方面表現(xiàn)出無可替代的作用(Ceja-Navarro, 2015; 王四寶和曲爽, 2017; Muhammadetal., 2019; Chenetal., 2020; Liuetal., 2020; Wuetal., 2020; 胡紫媛和夏嬙, 2021)。由于周邊工業(yè)密集,天津渤海灣一直是一個(gè)污染嚴(yán)重的海岸線(Fuetal., 2020)。本研究在渤海灣淡水區(qū)域重金屬污染較嚴(yán)重點(diǎn)位開展了搖蚊幼蟲群落調(diào)查,發(fā)現(xiàn)紅裸須搖蚊Propsilocerusakamusi屬于優(yōu)勢種,能夠在具有較高含量重金屬、有機(jī)物等污染源的環(huán)境下生存并大量繁殖。因此,本研究選用從渤海灣淡水區(qū)重金屬污染較嚴(yán)重點(diǎn)位采集的紅裸須搖蚊作為供試對象,將其置于實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)7 d后,采用基于16S rRNA基因的高通量測序技術(shù),系統(tǒng)地分析了在污染環(huán)境中耐受生存的紅裸須搖蚊幼蟲經(jīng)實(shí)驗(yàn)室純水培養(yǎng)后其腸道細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)的變化情況,分析其培養(yǎng)前后的差異性和預(yù)測其潛在功能,以掌握不同生境下?lián)u蚊腸道內(nèi)細(xì)菌的資源變化狀況,為進(jìn)一步探索搖蚊幼蟲腸道共生菌幫助宿主克服環(huán)境污染的潛在功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲體采集、鑒定與培養(yǎng)

2022年4-8月,野外采集地點(diǎn)為重金屬污染嚴(yán)重的天津市渤海灣淡水區(qū)(Fuetal., 2020)4個(gè)不同位置(117°20′32″N, 38°49′38″E; 117°24′46″N, 38°48′31″E; 117°22′55″N, 38°45′44″E和117°25′24″N, 38°44′41″E),在采樣點(diǎn)約5～10 cm深度隨機(jī)采集搖蚊幼蟲,本次野外采集實(shí)驗(yàn)由天津市北大港濕地自然保護(hù)區(qū)管理中心批準(zhǔn)(編號:202032522)。在4個(gè)采樣點(diǎn)同時(shí)采集沉積物和水樣,水樣以無菌2級水沖洗過的PVC瓶進(jìn)行收集,記錄并分析地表水質(zhì)參數(shù),包括水深度、pH值、溶解氧、總氮濃度、總磷濃度、總汞濃度、總鉛濃度、總鋅濃度、總砷濃度和總鎘濃度。沉積物保存在聚乙烯袋中并預(yù)先風(fēng)干,送至中國農(nóng)業(yè)部天津漁業(yè)環(huán)境與水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心測定水體和沉積物中重金屬含量。

將采集的搖蚊幼蟲活體樣品直接運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,先用蒸餾水沖洗2～3次,然后冰上麻醉處理3～5 min,在體式顯微鏡(OLYMPUS,SZX16)下對幼蟲個(gè)體形態(tài)進(jìn)行初步鑒定。從初步鑒定的搖蚊中隨機(jī)挑出3個(gè)樣本參照天根生化科技有限公司的基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行總DNA提取,樣品合格后以LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT CA-3′)為引物(Folmeretal., 1994)擴(kuò)增樣本的COⅠ基因序列,PCR反應(yīng)體系(25 μL): 10×PCR緩沖液2.5 μL, dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, Taq酶0.3 μL, DNA模板2 μL, 加ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR程序: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 40 s, 56 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 min, 共32個(gè)循環(huán); 最后72 ℃保溫5 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和純度,樣品合格后送至北京華大基因研究中心測序。測序結(jié)果使用軟件DNAMAN對序列進(jìn)行拼接和整理,待鑒定樣本COⅠ基因序列均在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blastn,下載序列相似性高的裸須搖蚊屬和搖蚊外群的COⅠ基因序列,利用軟件MEGA11.0中的Clustal W進(jìn)行序列比對,基于鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行Bootstrap值(1 000次)檢驗(yàn),計(jì)算遺傳距離。

參照Gong等(2008)對紅裸須搖蚊幼蟲蟲期的研究,從污染嚴(yán)重的117°20′32″N, 38°49′38″E采樣點(diǎn)鑒定到的紅裸須搖蚊中挑選出4齡幼蟲,分為兩組,1組作為野外采集組,另1組置于盛有蒸餾水的恒溫通氧透明塑料盒中[(24±1) ℃,光周期16L∶8D]培養(yǎng)7 d后作為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組。

1.2 腸道內(nèi)容物獲取

挑選健康狀況較好、重量差異在10 μg以內(nèi)的1.1節(jié)兩組實(shí)驗(yàn)4齡幼蟲各60頭,每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10頭。依次將供試蟲體置于冰上麻醉3～5 min,75%乙醇擦拭去除體表細(xì)菌,放入0.25% NaClO液體中浸泡1 min,用無菌PBS溶液沖洗3次以去除幼蟲體表殘留物。在無菌環(huán)境中解剖出幼蟲的整條腸道,無菌水沖洗后轉(zhuǎn)移至裝有0.5 mL無菌PBS溶液的1.5 mL離心管中,液氮速凍后,置于-80 ℃下保存待用。野外采集組編號為W1-W6,實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組編號L1-L6。

1.3 腸道細(xì)菌群落16S rRNA基因片段擴(kuò)增、基因文庫構(gòu)建以及高通量測序

本實(shí)驗(yàn)使用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒(B518251)提取紅裸須搖蚊幼蟲腸道組織基因組DNA,使用超微量分光光度計(jì)(Denovix DS-11,美國)測定所提DNA的濃度和純度,測得濃度為4.0～8.0 ng/μL之間,OD260/OD280的比值均在1.8～2.0之間,為合格樣品。以提取的DNA為模板,使用16S rRNA基因序列的通用引物(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,806R:5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′)對其16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增(Fadroshetal., 2014)。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 5×Pfu-Fast緩沖液4 μL, dNTPs (2.5 mmol/L) 2 μL, 正反向引物(5 μmol/L)各0.8 μL, Pfu-Fast聚合酶0.4 μL, BSA 0.2 μL, 基因組DNA模板10 ng, 加ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR程序: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 共15個(gè)循環(huán); 最后72 ℃ 保溫10 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和純度,依托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq PE300平臺完成高通量序列測定。將產(chǎn)生的基因組DNA原始數(shù)據(jù)上傳至美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI),項(xiàng)目編號為PRJNA741285。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Trimmomatic v 0.33軟件對腸道細(xì)菌群落16S rRNA基因原始序列進(jìn)行質(zhì)控、對比和過濾,得到優(yōu)化序列。以Uparse算法(版本7.0.1090, http:∥www.drive5.com/uparse)根據(jù)97%的相似度(Edgar, 2013)將高質(zhì)量的修剪數(shù)據(jù)聚類為一組可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)。參照Silva數(shù)據(jù)庫(www.arb-silva.de)結(jié)合Naive Bayes Classifiers對特征序列進(jìn)行物種注釋(Wangetal., 2007),并在各分類水平下(門、綱、目、科、屬、種以及OTU)進(jìn)行物種類群統(tǒng)計(jì),使用R語言繪制門和屬兩個(gè)分類水平的相對豐度柱狀圖。利用物種累計(jì)曲線對物種多樣性的增長進(jìn)行度量,預(yù)測樣本數(shù)量是否接近飽和,在此基礎(chǔ)上,使用Mothur軟件對腸道細(xì)菌群落進(jìn)行Alpha多樣性分析,包括Shannon, Simpson, ACE, Chao 1和Coverage等指數(shù),ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù)能夠反映群落豐富度,Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)能夠反映群落多樣性,而Coverage指數(shù)則反映了樣品文庫的覆蓋度。使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組的紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌的多樣性指數(shù)進(jìn)行Student氏t檢驗(yàn)。用Mothur軟件進(jìn)行Beta多樣性分析,基于bray-curtis距離矩陣主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA)比較野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌物種的相關(guān)性和差異性,Anoism分析兩組幼蟲腸道細(xì)菌群落的Beta多樣性是否具有顯著差異,從而分析野外采集的紅裸須搖蚊幼蟲經(jīng)實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)7 d后腸道細(xì)菌群落在物種多樣性方面的變化程度。利用軟件Picrust2對野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌群落潛在功能進(jìn)行預(yù)測,選取相對豐度>0.1%的腸道細(xì)菌物種的功能信息生成功能相對豐度柱狀堆積圖,對細(xì)菌基因功能進(jìn)行預(yù)測。使用LEfSe[line discriminant analysis (LDA) effect size]軟件尋找野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組紅裸須搖蚊幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌群落間在豐度上具有顯著差異的物種,其中LDA score篩選值設(shè)定為4。用軟件Picrust2對兩組幼蟲腸道菌群的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行菌群基因功能豐度預(yù)測,使基于SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的OTU物種分類與KEGG數(shù)據(jù)庫中原核生物代謝功能有效結(jié)合,從而分析環(huán)境變化在紅裸須搖蚊幼蟲代謝過程中發(fā)揮的潛在作用。

2 結(jié)果

2.1 采樣點(diǎn)水質(zhì)監(jiān)測情況

根據(jù)我國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB388-2002),對照4個(gè)采樣點(diǎn)的14個(gè)地表水和沉積物的環(huán)境參數(shù)(表1)可知,采樣點(diǎn)(117°20′32″N, 38°49′38″E; 117°24′46″N, 38°48′31″E)總氮和總磷嚴(yán)重超標(biāo),水體富營養(yǎng)化程度高,采樣點(diǎn)(117°22′55″N, 38°45′44″E; 117°25′24″N, 38°44′41″E)的水體富營養(yǎng)化程度低。同時(shí),相較于采樣點(diǎn)(117°20′32″N, 38°49′38″E; 117°24′46″N, 38°48′31″E),采樣點(diǎn)(117°22′55″N, 38°45′44″E和117°25′24″N, 38°44′41″E)中汞、鉛、鋅、砷和鎘5種重金屬的濃度明顯較低,且地表水中沒有檢測到金屬鎘和金屬汞。

表1 天津市渤海灣淡水區(qū)域4個(gè)采樣點(diǎn)地表水和沉積物的環(huán)境參數(shù)平均值Table 1 Average values of environmental parameters of surface water and sediment from four sampling sitesin the freshwater area of Bohai Bay, Tianjin City

2.2 紅裸須搖蚊物種鑒定和分布

參照前人對搖蚊的形態(tài)學(xué)分類研究(S?ther, 1980; 唐紅渠, 2006),挑選出頦側(cè)齒9～10個(gè)以及前上顎和頦板呈黑褐色的幼蟲初步鑒定為紅裸須搖蚊(圖1)。經(jīng)Blastn比對,3個(gè)待鑒定搖蚊的COⅠ基因序列與紅裸須搖蚊高度同源,遺傳距離為0.003～0.018,與其他種的遺傳距離在0.127～0.177之間。且系統(tǒng)發(fā)育樹上待鑒定搖蚊與紅裸須搖蚊以98%的置信度聚在同一分支(圖2)。綜合形態(tài)學(xué)鑒定以及DNA條形碼鑒定結(jié)果,進(jìn)一步確定待鑒定搖蚊為紅裸須搖蚊。

圖1 待鑒定搖蚊幼蟲的上顎和頦Fig. 1 Mandible and mentum of the chironomid larva to be identified

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于COⅠ基因序列的待鑒定搖蚊與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of chironomides to be identified and other species by neighbor-joining method based on COⅠ gene sequences (1 000 repeats)標(biāo)尺長度表示遺傳距離,系統(tǒng)進(jìn)化樹分支點(diǎn)處的數(shù)值表示自展值。The length of the scale bar represents the genetic distance, and the value at the branch point of the phylogenetic tree represents the bootstrap value.

相較于污染嚴(yán)重的采樣點(diǎn)(117°20′32″N, 38°49′38″E; 117°24′46″N, 38°48′31″E, 鑒定到的紅裸須搖蚊幼蟲數(shù)量分別為279和179頭/m3), 采樣點(diǎn)(117°22′55″N, 38°45′44″E; 117°25′24″N, 38°44′41″E)鑒定到的紅裸須搖蚊幼蟲數(shù)量(分別為28和32頭/m3)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于前兩個(gè)采樣點(diǎn),表明紅裸須搖蚊幼蟲能夠在污染嚴(yán)重的水域生存并繁衍,具有很強(qiáng)的耐污性。因此,本研究所用樣本也從污染較嚴(yán)重的兩個(gè)采樣點(diǎn)中挑選。

2.3 紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rRNA測序數(shù)據(jù)組裝和拼接

對野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組紅裸須搖蚊4齡幼蟲12個(gè)幼蟲腸道樣本進(jìn)行16S rRNA基因高通量測序,共獲得853 401條原始序列讀段,經(jīng)雙端質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生259 406條高質(zhì)量讀段,每個(gè)樣品至少產(chǎn)生10 737條高質(zhì)量讀段,其平均長度在400～440 bp之間。按照最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平,在97%相似度下將其聚類,總共注釋到11個(gè)門、13個(gè)綱、33個(gè)目、54個(gè)科、71個(gè)屬、90個(gè)種以及105個(gè)OTUs(表2)。

表2 紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道細(xì)菌16S rRNA基因高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)控信息Table 2 Quality control information of high-throughput sequencing data of 16S rRNA gene of the gut bacteriain the 4th instar larvae of Propsilocerus akamusi

利用物種累積曲線對細(xì)菌物種多樣性的增長進(jìn)行了度量和預(yù)測,各樣本累積量及豐度曲線均隨樣本數(shù)目增加而變得平緩,表明樣本中檢測到的新物種及共有物種接近飽和,樣本數(shù)量足夠大可進(jìn)一步用于分析多樣性及豐度變化(圖3)。所有樣本的Coverage指數(shù)都為0.99(表3),說明本研究樣本中序列未檢出可能性小,測序結(jié)果可以準(zhǔn)確且真實(shí)地反映細(xì)菌群落的實(shí)際狀況,測序數(shù)據(jù)量合理,數(shù)據(jù)可信。

表3 紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of the gut bacteria in the 4th instar larvae of Propsilocerus akamusi

2.4 紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌群落多樣性以及豐度

由表3可知,與野外采集組相比較,實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌群落的ACE, Chao 1, Simpson以及Shannon指數(shù)均呈顯著下降趨勢(P<0.01),說明在實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)7 d時(shí),紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌群落多樣性以及相對豐度顯著降低。

Beta多樣性反映不同樣本間群落結(jié)構(gòu)的相似性以及差異性?；赽ray-curtis距離矩陣的PCoA主坐標(biāo)分析表明,主坐標(biāo)軸PC1和PC2的解釋度分別為44.81%和19.32%(圖4)。Anoism分析結(jié)果表明,野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組組內(nèi)各樣本點(diǎn)聚在一起,但兩組距離較遠(yuǎn),說明實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)7 d時(shí)紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變 (R=0.92,P=0.003)。

圖4 紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道細(xì)菌β多樣性主坐標(biāo)分析(PCoA)Fig. 4 β diversity principal coordinate analysis (PCoA) of the gut bacteria in the 4th instar larvae of Propsilocerus akamusiPC: 主成分Principal component; Wild: 野外采集組Wild-captured groups; Lab: 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組Laboratory-cultured groups.圖6-7同。The same for Figs. 6-7.

2.5 紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌物種注釋

野外采集組中豐度排名前10的門如圖5(A)所示,變形菌門(Proteobacteria)為絕對優(yōu)勢菌門,其平均相對豐度達(dá)到55.26%,其次為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota),其平均相對豐度分別為21.61%和13.10%。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組中厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門,其平均相對豐度分別為46.91%和28.81%,其余為脫硫弧菌門(Desulfobacterota)、脫鐵桿菌門(Deferribacterota)和變形菌門,其平均相對豐度分別為7.77%, 6.50%和6.29%。

圖5 紅裸須搖蚊4齡幼蟲Top 10腸道細(xì)菌在門(A)和屬(B)水平上的相對豐度Fig. 5 Relative abundance of the top 10 bacteria at the phylum level (A) and genus level (B) in the 4th instar larval gut of Propsilocerus akamusi

在屬水平上,選取豐度排名前10的屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖5: B),實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組幾種優(yōu)勢菌屬的平均相對豐度較野外采集組呈現(xiàn)下降趨勢,例如,氣單胞菌屬Aeromonas(相對豐度由20.20%下降至0.2%)、希瓦氏菌屬Shewanella(由8.8%下降至0.1%)、 沙雷氏菌屬Serratia(由7.6%下降至0)和耶爾森氏菌屬Yersinia(由4.8%下降0.7%);與此同時(shí), 理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae RC9 gut group)、泰澤雷拉菌屬Tyzzerella、厭氧弧菌屬Anaerovorax以及脫硫弧菌屬Desulfovibrio的豐度分別為28.8%, 26.4%, 18.5%和7.8%,在一定程度上有所上升,為優(yōu)勢菌屬。

2.6 紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌組成差異

線性判別分析LEfSe結(jié)果顯示,在LDA值(log10)≥4下, 鑒定兩組具有豐度差異顯著的細(xì)菌物種。在屬水平上,氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬Pseudomonas以及耶爾森氏菌屬可作為野外采集紅裸須搖蚊幼蟲腸道群落中的生物標(biāo)記物,同時(shí),脫鐵桿菌屬M(fèi)ucispirillum、脫硫弧菌屬、厭氧弧菌屬、理研菌科RC9腸道群以及泰澤雷拉菌屬可作為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后紅裸須搖蚊的生物標(biāo)記物(圖6)。

2.7 紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌基因組基因功能注釋及預(yù)測

在Level 1水平上,紅裸須搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌基因注釋到6種在野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組均具有顯著性差異的代謝通路(圖7: A),實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組4齡幼蟲腸道細(xì)菌群落與環(huán)境信息處理(environmental information processing)、生物體系統(tǒng)(organismal systems)和細(xì)胞進(jìn)程(cellular processes)有關(guān)的基因豐度較野外采集組顯著下降(P<0.05),表明搖蚊幼蟲更適應(yīng)生存于野外環(huán)境;另外,注釋到有關(guān)新陳代謝(metabolism)的基因的相對豐度在兩組中均占有極大的比例。

圖7 紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道細(xì)菌基因在KEGG的level 1(A)和level 2(B)水平上的通路注釋Fig. 7 Pathway annotation of gut bacterial genes at the KEGG level 1 (A) and level 2 (B) in the 4th instar larva of Propsilocerus akamusi

在level 2水平上,野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組中紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道細(xì)菌基因功能與15種代謝通路相關(guān)并在組間具有顯著性差異(P<0.05)(圖7: B);野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組注釋到有關(guān)全局與概述圖譜(global and overview maps)的基因平均豐度分別為42.52%和40.92%,實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組中,有關(guān)氨基酸代謝(amino acid metabolism)、折疊、分類和降解(folding, sorting and degradation)、輔因子和維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)與核苷酸代謝(nucleotide metabolism)的基因豐度較野外采集組顯著上升(P<0.05),而有關(guān)碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)及外源性物質(zhì)生物降解和代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism)的基因豐度較野外采集組顯著下調(diào)(P<0.05),分別由8.56%和1.18%下降到8.34%和0.85%,推測野外采集組蟲體對于環(huán)境中的不利因子如化學(xué)污染物、尤其是有毒物質(zhì)(殺蟲劑、農(nóng)藥等)的代謝高于實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)組,此特性在一定程度上增加了宿主的環(huán)境適應(yīng)能力。

3 討論

本研究對重金屬污染的天津渤海灣淡水區(qū)域的4個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行了水質(zhì)監(jiān)測,結(jié)果表明(表1),在水質(zhì)較差且人類活動(dòng)頻繁的采樣點(diǎn)中,重金屬平均濃度較高,溶解氧含量低、總氮和總磷濃度較高。東亞地區(qū)富營養(yǎng)化和嚴(yán)重污染的水體中,紅裸須搖蚊數(shù)量眾多,分布密集(Hirabayashietal., 2003; Caoetal., 2020),與本研究在天津渤海灣地區(qū)調(diào)查的結(jié)果一致。由此推測紅裸須搖蚊幼蟲在一定程度上能夠應(yīng)對水體富營養(yǎng)化以及重金屬污染等環(huán)境壓力,此特性可讓其作為水體污染的指示生物,也引導(dǎo)我們進(jìn)一步思考蟲體產(chǎn)生這種環(huán)境適應(yīng)性的具體機(jī)制。

本研究利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對野外采集的和實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)7 d的紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行檢測,系統(tǒng)地分析了在污染環(huán)境中耐受生存的紅裸須搖蚊幼蟲經(jīng)實(shí)驗(yàn)室純水培養(yǎng)后其腸道細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)的變化情況,基于注釋結(jié)果,共鑒定了11個(gè)門、13個(gè)綱、33個(gè)目、54個(gè)科、71個(gè)屬、90個(gè)種(表2)。Alpha多樣性指數(shù)(表3)和Beta多樣性主坐標(biāo)分析(圖4)表明,實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌多樣性及豐富度較野外采集組的普遍顯著下降,究其原因可能是由于更為復(fù)雜的野外生態(tài)環(huán)境以及蟲體攝食過程導(dǎo)致。此外,同樣作為底棲動(dòng)物的螺螄在重金屬污染、水體有機(jī)物污染等環(huán)境下也有具一定的耐受性 (孟順龍等, 2011),鄭健(2023)等分別對野生的和人工飼養(yǎng)的牟氏螺螄Margaryamonodi腸道細(xì)菌群落的16S rRNA進(jìn)行了高通量測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型的牟氏螺螄腸道細(xì)菌群落多樣性指數(shù)均高于人工飼養(yǎng)組,這與本研究結(jié)果具有相似性。

在門水平上,野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組幼蟲腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌門相似但比例不同,均包含厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門及脫硫弧菌門(圖5: A)。這項(xiàng)結(jié)果與幾種蚱蜢(Muratoreetal., 2020)、西方蜜蜂Apismellifera(Kakumanuetal., 2016)、褐飛虱Nilaparvatalugens(王天召等, 2019)和家蠅Muscadomestica(Xueetal., 2019)等昆蟲腸道中鑒定出的細(xì)菌門類一致。在屬水平上,實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬、沙雷氏菌屬以及耶爾森菌屬的平均相對豐度都較野外采集組的呈顯著下降趨勢 (圖5: B)。研究表明氣單胞菌屬對抗生素和重金屬都具有抗性(Wickramanayakeetal., 2020),這些特性可用于污染地區(qū)重金屬的生物修復(fù)。從長期生存在污染環(huán)境中的搖蚊幼蟲體內(nèi)可分離出脫色希瓦式菌Shewanelladecolorationis,實(shí)驗(yàn)證明該菌株可以降低環(huán)境中的鉛離子和6價(jià)鉻濃度,幫助提高個(gè)體在污染環(huán)境中的存活率(Senderovich and Halpern, 2013)。Laviad-Shitrit等(2021)用不同濃度銅離子和6價(jià)鉻離子處理搖蚊,發(fā)現(xiàn)銅和6價(jià)鉻離子存在時(shí),耶爾森氏菌屬的豐度高于不含金屬處理組,此結(jié)果證明耶爾森氏菌屬可以在耐受較高濃度重金屬并進(jìn)行繁殖,從而在不穩(wěn)定的環(huán)境條件下保護(hù)昆蟲。這些研究也側(cè)向證實(shí)了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組中這幾種菌屬平均相對豐度下降的結(jié)果,推測紅裸須搖蚊幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌可能與宿主協(xié)同進(jìn)化,幫助蟲體適應(yīng)并穩(wěn)定地生存在不同環(huán)境中。此外,本研究對搖蚊幼蟲腸道細(xì)菌群落組成進(jìn)行LEfSe差異分析,找到了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后出現(xiàn)顯著變化的菌落(圖6),在屬水平上,野外采集的紅裸須搖蚊4齡幼蟲腸道細(xì)菌群落中的生物標(biāo)記物由氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬以及耶爾森氏菌屬經(jīng)實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)7 d變?yōu)榱嗣撹F桿菌屬、脫硫弧菌屬、厭氧弧菌屬、理研菌科RC9腸道群以及泰澤雷拉菌屬,這些結(jié)論可能對不同生境下?lián)u蚊幼蟲腸道菌群的研究提供重要的參考價(jià)值。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對野外采集組和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組的紅裸須搖蚊幼蟲腸道菌群進(jìn)行基因功能預(yù)測,結(jié)果表明(圖7),有關(guān)新陳代謝的基因在兩組幼蟲腸道中占比最高,這反映了腸道菌群與搖蚊宿主緊密的共生關(guān)系。與碳水化合物代謝和外源性物質(zhì)代謝相關(guān)的基因豐度在實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)后顯著下調(diào),證實(shí)了搖蚊幼蟲腸道對不良環(huán)境耐受性強(qiáng)的特點(diǎn)。此外,野外采集組中與人類疾病(human diseases)相關(guān)的基因豐度大于實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)組,說明在實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)前紅裸須搖蚊幼蟲腸道很可能還存在耐藥性和致病性菌株。但是在實(shí)際應(yīng)用中,本研究只能對已知微生物的已知功能進(jìn)行預(yù)測,如何確認(rèn)是否存在耐藥性和致病性菌株,還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

綜上,本研究主要對野外采集的紅裸須搖蚊4齡幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng),并對培養(yǎng)前后其腸道微生物物種組成和變化進(jìn)行了分析。野外采集的搖蚊幼蟲內(nèi)腸道內(nèi)共生菌種類繁多、數(shù)量豐富,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室蒸餾水培養(yǎng)一周后,幼蟲腸道內(nèi)共生菌在種類以及豐度上均有所減少,初步驗(yàn)證搖蚊腸道內(nèi)共生菌在不同環(huán)境中具有不同的適應(yīng)性。這些研究結(jié)果一方面有利于進(jìn)一步從腸道微生物角度探索搖蚊的環(huán)境適應(yīng)性以及“蟲-菌”協(xié)同進(jìn)化機(jī)制,另一方面為昆蟲在不良環(huán)境條件下的耐受機(jī)制與調(diào)控其腸道菌群穩(wěn)態(tài)機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。但是在實(shí)際情況下,紅裸須搖蚊幼蟲在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過程中的溫度、光照以及攝食等條件有可能會(huì)成為影響其腸道微生物多樣性和基因功能的原因。下一步將繼續(xù)深入研究,嘗試在多種環(huán)境下探索其腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能,并結(jié)合代謝組學(xué)與宏基因組的手段探索腸道內(nèi)共生物對重金屬的降解能力,為昆蟲腸道內(nèi)共生物應(yīng)對環(huán)境脅迫機(jī)制的進(jìn)一步研究提供新思路。