基于DNAzyme的d（GGA）重復序列折疊結(jié)構(gòu)的可視檢測

游 昕，賀榮榮，閆興賀，南銀杏，常天俊*，邴 濤

（1.河南理工大學 資源環(huán)境學院，河南 焦作 454003；2.中國科學院杭州醫(yī)學研究所，浙江 杭州 310022）

G-四鏈體（G4）是由富含鳥嘌呤的核酸形成的特殊高級結(jié)構(gòu)，可形成G4 的核酸序列在生物基因組中大量存在，與很多生理或病理過程密切相關。目前，G4的結(jié)構(gòu)和生物功能研究聚焦于由三重G 串聯(lián)形成的“常規(guī)”G4。然而，越來越多“非常規(guī)”G4，如兩層四分體形成的G4［1］、空穴G4［2-3］等，被證實具有重要生物功能。d（GGA）三核苷酸重復序列是原癌基因c-myb啟動子區(qū)的核心序列，已被證實在其基因轉(zhuǎn)錄中起關鍵調(diào)控作用［4］；該序列也經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)存在于不同物種的其他基因中，被認為具有重要的生物學意義［5］。其中，4 組d（GGA）可形成由一個3’端G-四分體（T）和一個5’端G-A 七分體（H）形成的兩層“非常規(guī)”G4，兩個“非常規(guī)”G4通過5’端的七分體以“頭碰頭”堆疊形成T∶H∶H∶T二聚體（圖1）；8 組d（GGA）重復也能形成類似的分子內(nèi)T∶H∶H∶T 堆積［4-5］。筆者所在研究組在水稻響應逆境脅迫重要基因的啟動子區(qū)也發(fā)現(xiàn)具有d（GGA）三核苷酸重復的序列（OsHC-1 與flo2），但前者在體外生理條件下能形成G4，而后者只在G4 配體或高濃度鹽離子存在下才發(fā)生折疊［6-7］。以上d（GGA）重復雖然具有相同的核心序列，但在不同序列環(huán)境中形成的結(jié)構(gòu)卻差異很大。因此，對實際序列環(huán)境中所形成結(jié)構(gòu)的準確預測與檢測成為研究其生物功能的前提。

圖1 G-四分體（T）、G-A七分體（H）和T∶H∶H∶T型G4二聚體結(jié)構(gòu)示意圖［4-5］Fig.1 Structure diagrams of G-quartet（T），G-A heptad（H） and T∶H∶H∶T G4 dimmer［4-5］

1996年，Li等［8］通過體外篩選技術獲得了N-甲基卟啉二丙酸 Ⅸ（N-Methylmesoporphyrin Ⅸ，NMM）的核酸適體，并發(fā)現(xiàn)該序列可與血紅素（Hemin）形成具有過氧化物酶活性的DNAzyme［9-10］，而形成G4結(jié)構(gòu)是其活性的基礎。G4拓撲結(jié)構(gòu)受其序列特征如四分體層數(shù)、loop 長度以及側(cè)翼序列的影響，也受溶液條件如一價陽離子濃度、溫度等的影響［11-14］。形成分子內(nèi)平行的G4的DNAzyme活性一般要高于反平行、混合平行以及分子間G4［15］，側(cè)翼和loop 中的腺嘌呤（A）和胞嘧啶（C）可顯著增強其DNAzyme 活性以及pH 耐受性［16-18］。對G4 的修飾也可提升其DNAzyme 活性［19-22］。這些研究闡釋了G4 結(jié)構(gòu)與其DNAzyme 活性的關系，目前基于DNAzyme 活性的分析方法已在G4 結(jié)構(gòu)檢測和配體發(fā)現(xiàn)、生物傳感以及分子器件等領域得到應用［7，23-24］。

DNAzyme 活性分析在常規(guī)G4檢測中有較多應用，但能否準確檢測d（GGA）重復序列所形成的“非常規(guī)”G4 尚不清楚。鑒于d（GGA）三核苷酸重復序列形成的結(jié)構(gòu)的特殊性以及其重要生物學意義，結(jié)合DNAzyme 分析的可視化與易操作性［7］，本文嘗試應用DNAzyme 活性分析對不同序列環(huán)境中d（GGA）的折疊結(jié)構(gòu)進行快速可視檢測。首先研究了d（GGA）4和d（GGA）8以及包含側(cè)翼的實際序列在Hemin 存在下的DNAzyme 活性，并通過凝膠電泳及紫外-熔鏈（UV-Melting）分析了這些序列的二級結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性；接著研究了不同側(cè)翼、loop以及不同d（GGA）重復頻次的序列所形成的二級結(jié)構(gòu)，并與凝膠電泳結(jié)果相比較。通過以上研究，系統(tǒng)評估DNAzyme 活性分析用于d（GGA）重復序列所形成的結(jié)構(gòu)的可靠性與適用性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

所有DNA 均由生工（上海）股份有限公司合成純化（序列見表1）。三羥甲基氨基甲烷（Tris）、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺以及甲叉雙丙烯酰胺為分析純，購自北京百靈威公司；氯化高鐵血紅素（Hemin）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）購于Sigma-Aldrich 公司。硝酸銀及其他化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑北京有限公司。Hemin用二甲亞砜（DMSO）溶解配制成10 mmol/L 母液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫籄BTS用超純水配成50 mmol/L的儲存液，4 ℃遮光保存。

表1 本文所研究的核酸序列Table 1 The nucleotide sequences used in this work

UV-2550 紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu），S-1700 溫控設備（日本Shimadzu），垂直凝膠電泳儀（DYCZ-MINI2，北京六一），凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech），J-1500CD 光譜儀（日本JASCO），Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國Merck）。

1.2 DNA樣品準備

DNA 樣品以25 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.65）溶解，通過260 nm 處的吸光度值和摩爾消光系數(shù)計算濃度。為使其形成穩(wěn)定的G4 結(jié)構(gòu)，將DNA 溶液在含150 mmol/L KCl 的Tris-HCl 緩沖液中95 ℃變性10 min，緩慢復性至室溫。

1.3 G4/hemin DNAzyme催化的ABTS氧化反應

G4/hemin DNAzyme 催化H2O2與ABTS 反應生成藍綠色的陰離子自由基ABTS?-，該產(chǎn)物在415 nm 處有最大吸收峰［16］。將新準備的G4 與hemin 室溫下遮光孵育1 h，然后加入2 mmol/L ABTS，最后以0.4 mmol/L H2O2引發(fā)反應。反應體系包含1 μmol/L DNA 與1 μmol/L hemin，0.025%（體積分數(shù)） Triton X-100、0.5%（體積分數(shù)） DMSO 和150 mmol/L KCl。采用紫外-可見分光光度計監(jiān)測反應產(chǎn)物在415 nm 處的吸光度變化。利用吸光度與時間線性相關（最初20 s）的斜率以及ABTS 氧化產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)36 000 L?mol-1?cm-1計算氧化產(chǎn)物隨時間的變化，獲得DNAzyme 催化底物氧化的速率［16］。所有動力學測試至少重復3次。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Denaturing-PAGE）：在1 μmol/L DNA 樣品中加入等體積的去離子甲酰胺（95%），于 95 ℃變性10 min，冰浴冷卻后及時上樣，在含7 mol/L 尿素的20%聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的體積比為19∶1）中于120 V 下恒壓電泳，電泳緩沖液為1×TBE（含89 mmol/L Tris、2 mmol/L Na2EDTA、89 mmol/L硼酸，pH 8.3）。凝膠經(jīng)銀染顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)成像。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）：在DNA 樣品（含有1 μmol/L DNA/hemin、150 mmol/L K+）中加入等體積甘油（30%，體積分數(shù)），于20%聚丙烯酰胺凝膠中室溫（25 ℃）60 V 下恒壓電泳，銀染顯色。為了維持G4的結(jié)構(gòu)，凝膠和電泳緩沖液中均加入20 mmol/L K+［11］。

1.5 Tm值測定

DNA（10 μmol/L）在含150 mmol/L KCl 的緩沖液中形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。取400 μL置于石英比色皿中，在精密控溫設備穩(wěn)定10 min 后，以0.2 ℃/min 的速率降溫或升溫到一定溫度（295 nm 處的吸光度達到穩(wěn)定），溫度每變化1 ℃記錄一次樣品在295 nm 處的吸光度；同時選擇325 nm 處的吸光度作為參比進行校正以扣除基線漂移。采用已發(fā)表的方法計算Tm值［6］，即以G4折疊分數(shù)（θ）對溫度作圖，Tm值為θ=0.5時對應的溫度。θ由下式計算：θT=［A（T）-AU（T）］/［AF（T）-AU（T）］。其中θT為某一溫度下的G4折疊分數(shù)，A（T）為測定溫度下DNA在295 nm處的吸光度，AU（T）和AF（T）分別對應未折疊和完全折疊樣品在295 nm處的吸光度。

受限于溫控條件，對于在最低或最高溫度下吸光度仍未達到穩(wěn)定平臺期的DNA 樣品，以此溫度下的吸光度作為未折疊或折疊基準來估算Tm值，因此實際Tm值低于或高于此估算值。

1.6 圓二色光譜（CD）

DNA 樣品（5 μmol/L，含150 mmol/L KCl）經(jīng)95 ℃變性10 min，室溫緩慢復性處理后，于25 ℃測試其CD 光譜。在1 cm 光程的石英比色皿中加入400 μL樣品，以100 nm/s的速度掃描3次，收集220～320 nm 的CD 信號。實驗時預先扣除緩沖液的背景吸收，CD 光譜數(shù)據(jù)為掃描3 次的平均值，并經(jīng)OriginPro 8.5軟件進行平滑處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNAzyme活性分析

鑒于很多生物基因組中都發(fā)現(xiàn)了d（GGA）三核苷酸重復序列，并認為該序列具有結(jié)構(gòu)相關的生物功能。為了快速檢測該三核苷酸重復序列能否在體外折疊，合成了可形成T∶H∶H∶T型G4的典型序列d（GGA）4和d（GGA）8，以含有2～3個側(cè)翼序列的f-（GGA）4與f-（GGA）8作對比，測試這些序列在血紅素存在下的DNAzyme 活性（圖2A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)d（GGA）4結(jié)合血紅素催化H2O2氧化ABTS 的速率達到200 nmol/L?s-1，但f-（GGA）4的催化反應速率不到20 nmol/L?s-1，接近血紅素自身的活性。d（GGA）8和f-（GGA）8的DNAzyme 活性分別為～300 nmol/L?s-1和400 nmol/L?s-1，是d（GGA）4的1.5～2 倍。反應20 min時，血紅素對照和f-（GGA）4接近無色，d（GGA）4、d（GGA）8和f-（GGA）8樣品為綠色到深綠色，這些樣品裸眼可見的顏色與其反應速率一致。

圖2 d（GGA）三核苷酸重復序列的DNAzyme活性（A）、紫外-熔鏈曲線（B）、CD光譜（C）以及非變性和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖像（D）Fig.2 DNAzyme activity（A），UV-melting curvels（B），CD spectra（C），and the native and denaturing PAGE images（D） of d（GGA） trinucleotide repeats

2.2 結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性分析

通過紫外-熔鏈曲線、CD 光譜、非變性和變性凝膠電泳評估這些序列的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性（圖2B、C、D），發(fā)現(xiàn)d（GGA）4降溫過程的Tm值約為60 ℃，而升溫過程的Tm＞90 ℃；f-（GGA）4升降溫過程中的低溫均未達到平臺，不能準確測定其Tm值，估計的Tm值比d（GGA）4低40～60 ℃，表明常溫下（25 ℃）難以形成G4。d（GGA）8和f-（GGA）8的熱穩(wěn)定性均較高（前者的Tm＞90 ℃；后者的Tm值在降溫過程中約60 ℃，升溫過程約75 ℃），且它們的Tm值差異遠小于d（GGA）4與f-（GGA）4。

CD光譜（圖2C）顯示d（GGA）4和d（GGA）8的正峰位于264 nm和267 nm，但f-（GGA）4和f-（GGA）8的正峰均發(fā)生了紫移，且CD 信號均大幅度下降；相對于其母序列，f-（GGA）4的正峰移動至260 nm，f-（GGA）8的正峰移動至265 nm。非變性凝膠電泳（Native PAGE，圖2D）顯示d（GGA）4（12-nt）、d（GGA）8（24-nt）以及f-（GGA）8（29-nt）的主要條帶位于15～20-nt 或略大于20-nt，f-（GGA）4（17-nt）在非變性凝膠電泳中的遷移條帶在15～20-nt 之間。結(jié)合紫外-熔鏈曲線、CD 光譜、凝膠電泳以及文獻報道［4］，認為d（GGA）4、d（GGA）8以及f-（GGA）8主要形成了T∶H∶H∶T型二聚體，而f-（GGA）4處于未折疊狀態(tài)。變性凝膠電泳（dPAGE，圖2D）還顯示d（GGA）8存在接近15-nt 的快速遷移條帶，提示其在變性條件仍保持部分折疊結(jié)構(gòu)，進一步說明其分子內(nèi)T∶H∶H∶T型二聚體高度穩(wěn)定。

總的來說，d（GGA）三核苷酸重復的DNAzyme 活性與其形成T∶H∶H∶T 型二聚體的能力有關，說明DNAzyme 活性在其結(jié)構(gòu)的可視檢測中有應用潛能。此外，d（GGA）4和d（GGA）8形成的“非常規(guī)”G4二聚體的DNAzyme活性甚至高于形成三層四分體的G4［16］，該結(jié)果擴大了高活性DNAzyme的范圍。

2.3 討 論

d（GGA）4和f-（GGA）8的升降溫曲線存在較大的遲滯現(xiàn)象，與之前報道的可形成多種構(gòu)型的不規(guī)則G4 序列類似［6］。一般來說分子內(nèi)折疊優(yōu)先于分子間的相互作用，因此d（GGA）4在降溫過程中可快速形成分子內(nèi)G4，而分子間G4的形成則相對較慢，從而滯后于溫度的梯度變化；升溫曲線中，d（GGA）4事先經(jīng)歷熱變性/復性過程，已形成了穩(wěn)定的分子間G4，Tm值表現(xiàn)為分子間與分子內(nèi)G4 總體的解聚熱力學，這可能是其升降溫曲線具有較大遲滯現(xiàn)象的原因。而f-（GGA）8旁側(cè)增加的堿基對其形成分子內(nèi)聚集有一定阻礙作用，遲滯了其形成T∶H∶H∶T 聚集體的速度，因此相對于d（GGA）8顯示明顯的升降溫曲線遲滯現(xiàn)象。以上現(xiàn)象也說明形成聚集可顯著提高這些序列折疊的熱穩(wěn)定性，這為其執(zhí)行生物功能提供了基礎。

2.4 不同旁側(cè)及不同重復頻次序列分析

為了進一步評估DNAzyme 活性用于可視檢測d（GGA）重復序列形成結(jié)構(gòu)的適用性，以d（GGA）4為對照，首先研究了14 條具有不同側(cè)翼和不同重復頻次的d（GGA）序列。發(fā)現(xiàn)G2A（5’-GGAGGAGGAGG-3’）的活性接近250 nmol/L?s-1，略高于d（GGA）4；在其5’端增加A堿基，將導致活性明顯下降，如增加3個A導致DNAzyme活性下降80%（圖3A）。在兩側(cè)同時增加A或T，活性降低90%以上。然而，3’端增加A 或在5’端和3’端分別增加T 并未明顯降低其活性。上述序列測得的催化反應速率與其反應20 min的顯色結(jié)果均一一對應。

圖3 含有不同旁側(cè)序列的G2A的DNAzyme活性（A）、CD光譜（B）和非變性和變性聚丙烯酰胺圖像（C）Fig.3 DNAzyme activity of G2A in the presence of different flanking sequences（A），CD spectra（B），and the native and denaturing PAGE images of these sequences（C）

CD 光譜（圖3B）顯示在G2A 的3’端增加A 或者T，其正峰波長均在265 nm 附近，且CD 信號未見明顯降低，表明形成了類似d（GGA）4的聚集結(jié)構(gòu)［6］。但是隨5’端堿基個數(shù)增多，CD 信號下降加劇，表明5’端堿基不利于其形成G4結(jié)構(gòu)。其中，增加A堿基的序列，CD 正峰紫移到略低于260 nm，提示G4結(jié)構(gòu)成分很少；增加T 堿基的序列，CD 正峰移動到262 nm 附近，提示存在部分G4。另外，3A-G2A-3A的CD 正峰移至259 nm，負峰移至約246 nm；3T-G2A-3T 的CD 正峰移至254 nm；二者在相應組內(nèi)的CD峰值最低，表明均難以形成G4。

在變性凝膠電泳中，以上序列均為單一條帶且位置對應其實際序列長度；非變性凝膠電泳中，大部分d（GGA）重復序列存在多個遷移條帶（圖3C）。其中，G2A 的5’端加2～3 個A（2A-G2A 和3A-G2A）或兩側(cè)分別加3 個A 或T 的序列（3A-G2A-3A 和3T-G2A-3T） 的主要電泳條帶在15-nt 附近，與其實際序列長度接近，表明這幾個序列主要以未折疊形式存在；其他d（GGA）重復序列在15-nt附近都存在兩個遷移條帶：高于其實際序列長度的主要條帶，提示為類似d（GGA）4的分子間聚集，另一個與其實際長度相當?shù)暮枯^小的條帶為單分子狀態(tài)。凝膠電泳圖像印證了CD 光譜對G2A 及其衍生序列折疊的判定結(jié)果。

以上數(shù)據(jù)顯示，聚集狀態(tài)占比多的序列的DNAzyme 活性普遍較高，而以未折疊為主的序列活性很低，進一步說明DNAzyme 活性與d（GGA）重復序列的折疊和聚集相關。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)4組d（GGA）重復序列受側(cè)翼的影響復雜：d（GGA）4可形成非常穩(wěn)定的T∶H∶H∶T 型G4 二聚體（Tm＞90oC），但5’端A 強烈抑制其形成G4 及二聚體，5’端T 的影響弱于A，3’端的A 或 T 則很少抑制其結(jié)構(gòu)的形成；另外，3’或5’側(cè)翼同時含有多個A 或T 堿基可強烈抑制其形成G4?？紤]到實際序列一般有長的側(cè)翼序列，4組d（GGA）重復在實際序列環(huán)境中將很難形成G4。

為了探討d（GGA）重復序列受側(cè)翼影響的現(xiàn)象是否具有普遍性，將G2A中的A替換成T（G2T：5’-GGTGGTGGTGG-3’），發(fā)現(xiàn)其DNAzyme 活性與G2A 相當（圖3A），但其側(cè)翼增加A 未導致明顯的活性下降，甚至3’端增加的A 堿基可增強活性（如G2T-3A 的活性相對于G2T 增加了約50%）。CD 光譜（圖3B）和凝膠電泳（圖3C）都提示G2T重復序列以平行G4及平行G4聚集為主。以上結(jié)果表明d（GGA）重復的折疊受側(cè)翼序列的影響具有特殊性，這可能與A堿基插入到G-四分體形成特殊的G-A七分體有關。

接著研究了6 條具有不同側(cè)翼的8 組及12 組d（GGA）重復序列（圖4），與G2A 和d（GGA）8對比，發(fā)現(xiàn)所有序列普遍有高DNAzyme 活性（DNAzyme 催化H2O2氧化ABTS 的初速度在200～400 nmol/L?s-1之間），對應樣品反應后均具有明顯可辨的深綠色（圖4A）。非變性凝膠電泳表明這些序列與d（GGA）8類似，均形成多種聚集結(jié)構(gòu)（圖4B）。具有不同側(cè)翼或連接子的8組d（GGA）重復序列，其CD 信號相對于2G2A 顯著降低，但正峰并未明顯移動。12 組d（GGA）重復序列（3G2A-N）的CD 正峰移動到274 nm 左右，但在265 nm 處仍具有較高的正信號（圖4C）。這些證據(jù)表明所研究的6 條序列均能折疊成G4。然而，3A-2（G2A）6T-3A 與3G2A-N 的d（GGA）重復之間具有較長的連接子，其CD 信號較弱，相應的DNAzyme活性也較低，提示更長的連接子可能對d（GGA）重復序列的折疊或聚集不利。

圖4 8或12組d（GGA）三核苷酸重復序列的DNAzyme活性（A）、非變性和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖像（B）與CD光譜（C）Fig.4 DNAzyme activity（A），native and denaturing PAGE images（B），and CD spectra（C） of 8 or 12 d（GGA） repeats

上述多組d（GGA）重復包含了不同的側(cè)翼序列以及連接子序列，其中3G2A-N 來自于人類c-myb原癌基因啟動子區(qū)的一段具有多組d（GGA）重復的實際序列［4］，因此實際序列環(huán)境中此類高頻率重復的d（GGA）序列將更可能形成T∶H∶H∶T型G4而具有生物功能。結(jié)果表明DNAzyme活性分析對于檢測真實序列環(huán)境中的多組d（GGA）重復所折疊的結(jié)構(gòu)具有很好的適用性。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)T∶H∶H∶T 型“非常規(guī)”G4 的d（GGA）三核苷酸重復序列在血紅素存在下具有高的DNAzyme 活性，其裸眼可視的顏色與形成結(jié)構(gòu)有關。基于DNAzyme 活性可視檢測d（GGA）重復序列的形成結(jié)構(gòu)具有很高的可靠性和通用性，通過酶標儀進行高通量測試，可在20 min 之內(nèi)完成反應，因此該類特殊序列的形成結(jié)構(gòu)在實際序列檢測環(huán)境中具有應用前景。另外，本文還發(fā)現(xiàn)d（GGA）重復序列的形成結(jié)構(gòu)受到重復頻次以及旁側(cè)序列的特殊影響，豐富了對G4結(jié)構(gòu)多態(tài)性的認識，啟示重復頻率高的d（GGA）在實際序列環(huán)境中更有可能形成穩(wěn)定的G4聚集體，從而對基因的表達調(diào)控起作用。