錳/鋯-雙金屬有機(jī)骨架納米酶比色法檢測水中痕量氟

牟芝梅，鄧治臣，趙靜鑾，柳敬魚，丁芯茹，彭文洪，賀錦燦

（廣東藥科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310）

氟是人體必需的微量元素之一，人體內(nèi)的氟主要來源于飲水［1］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，適量的氟有促進(jìn)生長發(fā)育、預(yù)防齲齒等作用［2］，但過量攝入則可導(dǎo)致氟斑牙、氟骨癥［3］，還會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、心血管系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)。因此需對存在于飲用水中的氟含量進(jìn)行嚴(yán)格限制。采用地表水或地下水為生活飲用水水源時(shí)，氟離子（F-）的最大允許濃度為1.0 mg/L［4］。中國是地方性飲用水氟中毒流行最廣、危害最嚴(yán)重的國家之一，地方性氟中毒危及我國超過30個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國有此病的縣總數(shù)已超過一千個(gè)，受影響群眾達(dá)上億人［5］。因此，檢測和監(jiān)管飲用水中氟離子含量，是保障人民飲用水安全的重要前提。

目前F-的檢測方法主要有離子選擇電極法、離子色譜法、熒光法、氣相色譜法等［6-7］。其中，比色法是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。與其他分析方法相比，比色法不需要復(fù)雜的儀器，待測物預(yù)處理簡便、檢測成本低、方便快捷、操作簡單、不依賴專業(yè)人員，符合現(xiàn)場快速檢測的要求［8］。

金屬有機(jī)框架（Metal-organic frameworks，MOF）是一類由金屬中心和有機(jī)配體組裝而成的納米材料，具有比表面積與孔隙率高及孔隙結(jié)構(gòu)可控的特點(diǎn)［9］，在儲氣、分離、傳感器、催化等方面［10-12］具有重要的應(yīng)用。某些MOF 中含有的順磁性金屬，如鐵、銅、鈷、錳、鋯等，賦予了MOF 類過氧化物酶（納米酶）活性，與天然酶相比，MOF納米酶具有性質(zhì)穩(wěn)定、易于保存、成本低等優(yōu)點(diǎn)。MOF納米酶可催化氧化無色的顯色底物（如3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺等）顯色，在比色檢測應(yīng)用方面日益受到關(guān)注。例如，筆者所在課題組［13］設(shè)計(jì)了一種能選擇性識別磷酸根離子的鈷基MOF納米酶，并將其成功用于食品中磷酸鹽的比色檢測。Wu 等［14］發(fā)現(xiàn)鋯-氨基酸MOF 具有類過氧化物酶活性，但鋯基MOF 的類過氧化物酶活性較弱，通常需與其他金屬如鐵［15］、銅［16］、鈰［17］等協(xié)同以提高其納米酶活性。鋯基MOF除具有類過氧化物酶活性外，還具有選擇性吸附氟的能力。Zhao 等［18］發(fā)現(xiàn)，相較于MIL-53（Fe，Cr，Al）、MIL-68（Al）、CAU-1、CAU-6，UiO-66（Zr）展現(xiàn)出更強(qiáng)的氟離子吸附能力 ；Zhu 等［19］發(fā)現(xiàn)MOF-801（Zr）對水中的氟化物具有較強(qiáng)的選擇吸附作用。目前，鋯基MOF 大多用于氟化物的吸附研究，在氟的比色定量檢測方面鮮見報(bào)道。在各種過渡金屬中，錳因其低毒性、多用性、多價(jià)性而備受關(guān)注［20］。有研究者發(fā)現(xiàn)，通過摻雜金屬錳制備雙金屬催化劑，可以提高材料的催化活性［21］。因此，以鋯鹽和錳鹽為金屬前驅(qū)體，有望制備出一種對氟離子同時(shí)具有識別功能和比色檢測功能的雙金屬M(fèi)OF。

基于以上考慮，本研究通過共沉淀法合成了新型Mn/Zr-MOF 材料，同時(shí)基于錳離子、鋯離子賦予該材料的類過氧化物酶活性及鋯離子對F-的選擇性識別作用，建立了一種靈敏、快速、高選擇性檢測F-的比色法，并應(yīng)用于實(shí)際水樣中F-的測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

xMark 酶標(biāo)儀（美國 Bio-Rad 公司）；Hitachi S4800 掃描電子顯微鏡（SEM，日本 Hitachi 公司）；EscaLab 250Xi X 射線衍射儀（XRD，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Axis Ultra DLD Kratos AXIS SUPRA X 射線光電子能譜儀（XPS，日本島津公司）；Nicolet iS10 傅里葉紅外光譜儀（FTIR，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Bruker E580 順磁共振波譜儀（ESR，德國Bruker 公司）；UV-3010 紫外-可見分光光度計(jì)（日本日立公司）；FA 1204 B 電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；H3-18K 高速離心機(jī)（湖南可成儀器有限公司）；DF-101S磁力攪拌器（河南鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；YC-S30恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；LGJ-10C冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）。

1.2 試劑與耗材

3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、鄰苯二胺（OPD）、均苯三甲酸、氟化鈉、氯化鋯、無水乙醇均購自阿拉丁試劑有限公司；一水合硫酸錳、醋酸和無水醋酸鈉購自廣州化學(xué)試劑廠；過氧化氫（H2O2）購自江西健寶醫(yī)藥科技有限公司。所有化學(xué)試劑至少為分析純，使用時(shí)無需進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（＞18.2 MΩ?cm）。醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（HAc-NaAc，pH 4.8）由醋酸和無水醋酸鈉按照一定比例配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Mn/Zr-MOF的制備與表征 采用一鍋共沉淀法制備Mn/Zr-MOF：配制20 mmol/L 均苯三甲酸溶液、系列不同濃度的氯化鋯溶液（15、20、30、40、45、50 mmol/L）和一水合硫酸錳溶液（10、15、20、30、40、45 mmol/L）。向500 mL 三頸燒瓶中分別加入100 mL 的20 mmol/L 均苯三甲酸、100 mL 氯化鋯溶液、100 mL一水合硫酸錳溶液（控制金屬鹽溶液總濃度為60 mmol/L，依次調(diào)整鋯鹽/錳鹽的加入濃度比為1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1、5∶1）。將混合溶液于25 ℃下磁力攪拌反應(yīng)1 h，待溶液顏色由澄清轉(zhuǎn)變成乳白色，將所獲得的乳白色濁液于8 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用超純水洗滌兩次，冷凍干燥12 h，得到6種不同錳、鋯摻雜比的白色Mn/Zr-MOF材料。

通過 SEM、XPS、FTIR、XRD 等技術(shù)對Mn/Zr-MOF的形貌、元素、官能團(tuán)、晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.3.2 分析方法將1 mL pH 4.8的HAc-NaAc緩沖溶液、1 mL 1.3 mg/L的Mn/Zr-MOF材料、一系列濃度梯度的氟化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.8 mL 2.0 mmol/L的TMB溶液和0.04 mL 0.997 mol/L的H2O2溶液依次加入5 mL 比色管中，使用HAc-NaAc 緩沖溶液定容至刻度，30 ℃孵育15 min。用紫外-可見分光光度計(jì)采集體系的吸收光譜圖，并記錄652 nm處的吸光度值。以不加Mn/Zr-MOF材料的體系作為對照組，實(shí)驗(yàn)組和對照組均平行測定3次，其吸光度平均值分別作為A和A0，計(jì)算二者差值ΔA（A0-A）。

1.3.3 樣品處理取廣州市龍?zhí)队亢恿魉彤?dāng)?shù)爻兴徺I的純凈水各15 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾及陽離子交換樹脂后按照“1.3.2”進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2022進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析原理

方法的分析原理如圖1 所示，Mn/Zr-MOF 具有類過氧化物酶活性，能夠促進(jìn)H2O2的降解反應(yīng)并產(chǎn)生高活性的羥基自由基（?OH），這些具有強(qiáng)氧化性的?OH 能進(jìn)一步氧化TMB 生成oxTMB，使體系呈藍(lán)綠色。當(dāng)反應(yīng)體系中存在F-時(shí)，Mn/Zr-MOF 與F-特異性結(jié)合，占據(jù)了Mn/Zr-MOF 部分活性位點(diǎn)，使得Mn/Zr-MOF 的催化活性受到抑制，體系產(chǎn)生的?OH 較少，顏色變淺。顏色的深淺與F-的濃度相關(guān)，基于此原理可建立檢測氟的Mn/Zr-MOF 納米酶比色分析方法。

圖1 錳/鋯-雙金屬有機(jī)骨架納米酶比色法檢測氟的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram for the principle of colorimetric detection of fluoride based on Mn/Zr-MOF nanoenzyme

2.2 Mn/Zr-MOF的制備與表征

通過一鍋共沉淀法制備了6 種不同鋯鹽/錳鹽摻雜濃度比（1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1、5∶1）的Mn/Zr-MOF 材料，比較這些材料催化過氧化氫氧化TMB 的效果，結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果顯示，鋯鹽和錳鹽摻雜比為3∶1 的Mn/Zr-MOF 材料催化活性最強(qiáng)，因此采用鋯鹽/錳鹽摻雜濃度比為3∶1合成的Mn/Zr-MOF 材料進(jìn)行后續(xù)表征和分析應(yīng)用。

圖2 不同鋯鹽/錳鹽摻雜比合成的Mn/Zr-MOF材料用于催化H2O2-TMB反應(yīng)所獲得的652 nm處的吸光度Fig.2 The absorbance at 652 nm obtained from the system of H2O2-TMB catalyzed by Mn/Zr-MOF with different doping ratios of zirconium/manganese salts

SEM 圖（圖3A）顯示Mn/Zr-MOF 為不規(guī)則的塊狀結(jié)構(gòu)。用XPS 驗(yàn)證Mn/Zr-MOF 的組成，結(jié)果如圖3B 所示。Mn/Zr-MOF 中存在 Zr 3d、C 1s、N 1s、O 1s、Mn 2p 的峰，插圖顯示，材料中同時(shí)存在 Mn2+、Mn3+。通過FITR 分析材料的官能團(tuán)（圖3C），3 472、1 652 、1 367、471 cm-1處分別歸屬于—OH、C＝O、C—O—C、Ar—H 的伸縮振動(dòng)；660 cm-1處的峰可歸屬為Zr—O、Mn—O 的伸縮振動(dòng)［22］。采用XRD 表征Mn/Zr-MOF 的晶型結(jié)構(gòu)（圖3D），發(fā)現(xiàn)Mn/Zr-MOF 的結(jié)晶度較差，在40.46°、45.1°和51.4°處的衍射峰分別與模擬Mn-MOF 的（200）、（202）和（108）晶面對應(yīng)；在8.3°和8.6°處的衍射峰分別與模擬MOF-808（Zr）的（311）和（222）晶面一致。上述結(jié)果表明，Mn-Zr/MOF成功合成。

圖3 Mn/Zr-MOF的SEM圖（A），XPS圖（B），F(xiàn)TIR圖（C）以及Mn/Zr-MOF的XRD譜圖與Mn-MOF、MOF-808（Zr）的XRD模擬譜圖（D）Fig.3 SEM image（A），XPS curve（B），F(xiàn)TIR spectrum（C） of Mn/Zr-MOF，and XRD spectrum of Mn/Zr-MOF，and simulation spectra of Mn-MOF and MOF-808（Zr）（D）

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

酶的活性受pH 值和溫度的影響最大，因此考察了pH 值（3.5、4.0、4.5、4.8、5.0、5.3）和溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）對吸光度的影響。結(jié)果顯示，隨著pH 值的升高，Mn/Zr-MOF 的催化活性先升高后降低，在pH 4.8時(shí)催化活性達(dá)到最高；而隨著反應(yīng)溫度的升高，Mn/Zr-MOF 的催化活性先增加后降低，在30 ℃時(shí)達(dá)到峰值，過高或過低的溫度均會影響Mn/Zr-MOF活性進(jìn)而影響催化活性。此外，為了發(fā)揮反應(yīng)體系的最大檢測效能，本研究還對MOF 材料濃度、TMB 濃度、過氧化氫濃度、孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。

最終確定的最優(yōu)反應(yīng)條件為：1 mL 1.3 mg/L的MOF 材料、0.8 mL 2.0 mmol/L 的TMB、0.04 mL 0.997 mol/L 的過氧化氫、pH 4.8、溫度30 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min。

2.4 Mn/Zr-MOF的類過氧化物酶活性研究

以TMB、ABTS、OPD 為底物，研究Mn/Zr-MOF 的類過氧化物酶活性。如圖4 所示，TMB、ABTS、OPD 溶液均無明顯特征吸收峰，而在含有TMB和H2O2的NaAc-HAc緩沖溶液中加Mn/Zr-MOF，溶液由無色變成藍(lán)色，且TMB-H2O2-Mn/Zr-MOF 體系在652 nm 處有較強(qiáng)的吸收峰。此外，Mn/Zr-MOF 也能催化ABTS 和OPD 顯色。該結(jié)果說明Mn/Zr-MOF具有類過氧化物酶活性。

圖4 3種底物（TMB、ABTS、OPD）被Mn/Zr-MOF催化氧化前后的吸收光譜圖Fig.4 The absorption spectra of three substrates（TMB，ABTS，OPD） before and after catalytic oxidation by Mn/Zr-MOF insert：the chart of color change

以TMB和H2O2為底物，進(jìn)一步研究Mn/Zr-MOF的類過氧化物酶活性，進(jìn)行穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)評價(jià)：在反應(yīng)體系最適的pH 值和溫度下，改變其中一種底物濃度，在652 nm 波長下進(jìn)行40 min穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)掃描，得到典型的Michaelis-Menten 曲線（圖5），根據(jù)Michaelis 方程計(jì)算出米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vmax）。Mn/Zr-MOF以TMB和H2O2為底物的Km分別為0.75、4.23 mmol/L，Vmax分別為186.92×10-8、85×10-8mol/（L?s）；在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，測得辣根過氧化物酶（HRP）以TMB 和H2O2為底物的Km分別為0.74、0.65 mmol/L，Vmax分別為10.60×10-8、3.40×10-8mol/（L?s）。Mn/Zr-MOF 以H2O2為底物的Km值大約是HRP的6倍，說明Mn/Zr-MOF需要較高的H2O2濃度才能獲得最大活性。以TMB為底物時(shí)，Mn/Zr-MOF 具有與HRP 相當(dāng)?shù)腡MB 親和力。此外，Mn/Zr-MOF 的Vmax大于HRP。Mn/Zr-MOF 以TMB 為底物的Km值稍低于MoS2@MgFe2O4［23］和Fe-Ag2S［24］，Vmax是MoS2@MgFe2O4的2倍，F(xiàn)e-Ag2S的12倍。上述數(shù)據(jù)表明，與其他納米酶相比，Mn/Zr-MOF的反應(yīng)速率較快，表現(xiàn)出較好的催化活性。

圖5 底物TMB濃度（A）和H2O2 濃度（B）對Mn/Zr-MOF催化反應(yīng)速率的影響Fig.5 Effect of TMB concentrations（A） and H2O2 concentrations（B） on the rate of catalytic reaction of Mn/Zr-MOF insert：double reciprocal plot

2.5 氟離子對Mn/Zr-MOF類過氧化物酶活性的影響

通過比較Mn/Zr-MOF 在F-存在/不存在以及不同存在濃度時(shí)反應(yīng)體系光譜的變化，考察F-對Mn/Zr-MOF 類過氧化物酶活性的影響。如圖6A 所示，TMB 溶液無特征吸收峰；TMB-H2O2-Mn/Zr-MOF 體系在652 nm 處有較強(qiáng)吸收峰，說明Mn/Zr-MOF 具有類過氧化物酶活性；當(dāng)加入F-后，反應(yīng)體系的吸光度明顯降低；隨著F-質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)體系的吸光度逐漸降低，說明F-抑制了Mn/Zr-MOF的類過氧化物酶活性。以5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）為?OH 的捕獲劑，通過ESR 表征考察F-對Mn/Zr-MOF 催化活性的影響（圖6B）。當(dāng)體系中不存在F-時(shí)，可以觀察到顯著的?OH 特征信號，表明Mn/Zr-MOF 能夠催化H2O2，并產(chǎn)生高活性的?OH；當(dāng)體系中存在F-時(shí)，ESR 峰值顯著降低，說明生成的?OH減少。這一結(jié)果證明F-的吸附引起?OH的生成量減少，導(dǎo)致Mn/Zr-MOF的類過氧化物酶活性降低。通過對比加入F-前后O 1s（圖6C）和Zr 3d（圖6D）的XPS 圖，發(fā)現(xiàn)F-存在時(shí)，Zr-OH 峰面積所占的百分比降低，Zr 3d 向較低結(jié)合能區(qū)域輕微移動(dòng)。表明F-吸附在Mn/Zr-MOF 上時(shí)，與Zr-OH 發(fā)生離子交換，說明Zr與F-存在特異性識別作用。

圖6 不同體系的吸收光譜圖（A），F(xiàn)- 加入Mn/Zr-MOF催化體系前后的ESR圖譜（B）及Mn/Zr-MOF的O 1s（C）、Zr 3d（D）XPS光譜圖Fig.6 The absorption spectra of different systems（A），the ESR curves of Mn/Zr-MOF-involved catalytic system before and after the addition of fluoride ions（B），the XPS spectra of O 1s（C） and Zr 3d（D） of Mn/Zr-MOF

2.6 方法建立

在上述優(yōu)化的催化反應(yīng)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著F-濃度的增大體系的顏色逐漸變淺，652 nm 處的吸光度逐漸降低，以F-質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，ΔA為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合。結(jié)果顯示，在0.40～5.0 mg/L范圍內(nèi)，F(xiàn)-質(zhì)量濃度與ΔA線性相關(guān)，線性方程為ΔA=0.065 12ρ+0.751 17，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 6，以信噪比（S/N）為3計(jì)算得到檢出限（LOD）為0.16 mg/L，低于國標(biāo)飲用水中F-的準(zhǔn)則值（1.0 mg/L）。與NH2-UiO-66 熒光法［25］、鎳-吡咯苯并咪唑絡(luò)合物比色法［26］和季胺型熒光探針法［27］相比（表1），本方法的檢出限更低；盡管Ni-POCOP 探針比色法［28］比本方法的檢出限更具優(yōu)勢，但Ni-POCOP 探針合成需要8 h，且使用有毒有機(jī)溶劑乙腈，而本方法中Mn/Zr-MOF 材料的合成只需1 h，溶劑為水，避免了有毒有害有機(jī)溶劑的使用。

表1 不同F(xiàn)- 檢測方法的比較Table 1 Comparison of different methods for detection of F-

2.7 選擇性分析

考察了18種水樣中可能存在的陰、陽離子對體系檢測2.0 mg/L F-的影響，結(jié)果如表2所示。大多數(shù)無機(jī)陰離子、無機(jī)陽離子對F-檢測的影響較小，相對誤差小于±7.0%。部分金屬離子（如Tb3+、Ag+）的耐受倍數(shù)低，說明可能存在一定的干擾，可在樣品檢測前通過陽離子交換樹脂去除?？傮w來說，該方法對F-具有較好的選擇性。

表2 不同共存離子對檢測體系的影響（n= 3）Table 2 The effect of different coexisting ions on detection system（n=3）

2.8 實(shí)際樣品分析

將所建立的方法應(yīng)用于河流水、純凈水實(shí)際樣品中F-的測定，結(jié)果在河流水中檢出0.86 mg/L 的F-，純凈水中未檢出。將本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法（氟離子選擇電極法）［29］進(jìn)行比對，T檢驗(yàn)顯示兩種方法的檢測結(jié)果無顯著性差異（P＞ 0.05）。對樣品進(jìn)行3 個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到加標(biāo)回收率為97.6%～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.27%～5.2%（n=3），見表3。上述結(jié)果說明本方法具有較好的準(zhǔn)確性及精密度，滿足實(shí)際水樣中氟的檢測要求。

表3 實(shí)際水樣中氟離子的測定（n=3）Table 3 Determination of fluoride ions in different water samples（n=3）

3 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)合成了一種新型Mn/Zr-MOF 納米材料，并基于其類過氧化物酶活性及對F-的選擇性識別作用，建立了一種檢測F-的催化比色法。方法的線性范圍為0.40～5.0 mg/L，檢出限為0.16 mg/L。將該方法應(yīng)用于實(shí)際水樣中F-測定，加標(biāo)回收率為97.6%～106%，RSD 為0.27%～5.2%，檢測結(jié)果與國標(biāo)法一致。本方法檢測速度較快、特異性好、靈敏度高，在實(shí)際樣品檢測中有較好的適用性，有望進(jìn)一步制成試劑盒、試紙條，與手機(jī)拍照識色功能結(jié)合進(jìn)行定量分析，以更好地滿足現(xiàn)場檢測需求。此外，還可通過Mn/Zr-MOF 上金屬離子的變更及官能團(tuán)的修飾，實(shí)現(xiàn)不同待測物的特異性結(jié)合，開發(fā)其他分析物的比色檢測方法或進(jìn)一步拓展不同的檢測模式。