可原位釋放一氧化氮的聚多巴胺納米復(fù)合物的制備及其應(yīng)用

任 蓉，王 穎，王 通，修夢(mèng)婷，朱利民

(東華大學(xué) a.生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, b.上海納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)工程研究中心, 上海 201620)

氣體治療作為一種新興的治療手段,可為攻克癌癥提供新思路。氣體治療常用的內(nèi)源性活性分子主要有CO、H2S和NO等[1-5],其中NO是自然界中最小、最簡(jiǎn)單的生物活性分子之一。研究證實(shí),除參與調(diào)解多細(xì)胞活動(dòng)[6-8]以外,NO與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9-10],且高濃度的NO對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[11]。然而,由于NO在體內(nèi)自由擴(kuò)散迅速,半衰期短[12],常常在腫瘤部位缺乏有效積累,致使治療效果不佳。L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)作為天然的NO供體,可在誘導(dǎo)型NO合成酶(inducible nitric oxide synthase, INOS)存在的情況下持續(xù)釋放NO。此外,L-Arg還可被活性氧(reactive oxygen species, ROS),如H2O2、單線態(tài)氧(1O2)等氧化生成NO[13-15],這為NO氣體的原位釋放提供了新思路。

由于獨(dú)特的理化性質(zhì),聚多巴胺(polydopamine, PDA)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[16-18]。在弱堿性環(huán)境下,多巴胺可以自聚合,并在眾多材料表面形成PDA層。PDA的制備方法也在不斷發(fā)展和改進(jìn),這使得PDA被塑造成各種形態(tài)[19-21]。Lee等[22]開(kāi)發(fā)了一種含有兒茶酚胺官能團(tuán)的多巴胺表面改性技術(shù),研究指出PDA作為外殼幾乎可以包裹在任何固體材料表面。事實(shí)上,PDA除了包覆納米顆粒(nanoparticles, NPs)以外,還可以制成納米載體。

本研究利用PDA結(jié)構(gòu)與富π電子的三甲基苯(1,3,5-trimethylbenzene, TMB)分子之間的π-π堆積作用合成介孔聚多巴胺(mesoporous polydopamine, MPDA)納米顆粒,并以其為載體負(fù)載L-Arg和光敏劑IR780,制備可原位釋放NO的納米復(fù)合物。在波長(zhǎng)為808 nm的近紅外激光(NIR)照射下,IR780可以產(chǎn)生1O2,1O2進(jìn)而將L-Arg氧化生成NO,最終實(shí)現(xiàn)NO的原位釋放。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

鹽酸多巴胺(DA·HCl)、Pluronic F127、羥甲基氨基甲烷(Tris)和TMB,阿拉丁生化科技股份有限公司;IR780,北京百靈威科技有限公司;無(wú)水乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、氨水、戊二醛和丙酮,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF),上海麥克林公司;維生素C(Vc),上海源葉生物科技有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素溶液,美國(guó)賽默飛世爾科技公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT),美國(guó)Sigma公司;活性氧探針(DCFH),一氧化氮熒光探針(DAF-FM DA),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),南京凱基生物技術(shù)公司;人骨肉瘤細(xì)胞(143B),中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。所用藥品均為分析純,所用水均為超純水。

GL124-1SCN型分析天平,德國(guó)Sartorius公司;C-MAGHS10型磁力攪拌器,德國(guó)IKA公司;SCQ-5201C1型超聲波清洗機(jī),上海聲彥超聲波儀器有限公司;FD-1 D-50型冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;JEM-2100型透射電子顯微鏡,日本JEOL公司;Tristar 3000型全自動(dòng)快速比表面積與孔隙度分析儀,美國(guó)麥克儀器公司;ZS90型馬爾文納米粒度電勢(shì)分析儀,英國(guó)馬爾文公司;UV3600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司;CLARUSSQ8-STA8000型熱重分析儀,美國(guó)珀金埃爾默公司;ADR-1860型激光器,上海熙隆光電科技有限公司;FV1000型共聚焦激光掃描顯微鏡,日本奧林巴斯公司;DMi8型倒置熒光顯微鏡,德國(guó)Leica公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MPDA的制備

將0.2 g Pluronic F127和0.2 g TMB加至50 mL含超純水和無(wú)水乙醇的混合溶液中,攪拌30 min。然后,將10 mg Tris溶解于10 mL超純水中,再加至上述混合液中。加入60 mg DA·HCl,攪拌反應(yīng)24 h后,以13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min(離心半徑為6.79 cm),用體積比為2∶1的乙醇和丙酮洗滌3次,得到MPDA。最終產(chǎn)品于-45 ℃冷凍干燥48 h以供進(jìn)一步使用。

1.2.2 精氨酸-聚多巴胺(A-MPDA)的制備

將L-Arg粉末溶于50 mmol pH=8.5的Tris緩沖液中,質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。然后與適量的MPDA粉末混合,得到MPDA質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的混合溶液。以300 r/min轉(zhuǎn)速攪拌溶液24 h,再經(jīng)13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心(離心半徑為6.79 cm)獲得A-MPDA,并將其超聲分散于PBS溶液中。

1.2.3 精氨酸-IR780-聚多巴胺(AI-MPDA)和IR780-聚多巴胺(I-MPDA)的制備

將30 mg IR780溶解于100 μL DMSO中,再滴加到棕黑色A-MPDA懸浮液中,避光條件下攪拌(轉(zhuǎn)速為300 r/min)過(guò)夜。以13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心(離心半徑為6.79 cm)去除下層游離的IR780,收集洗滌后的AI-MPDA,于-45 ℃冷凍干燥48 h備用。AI-MPDA的合成示意圖如圖1所示。同時(shí),將30 mg IR780溶解于100 μL DMSO中,再滴加到MPDA懸浮液中,避光條件下攪拌(轉(zhuǎn)速為300 r/min)過(guò)夜。以13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心(離心半徑為6.79 cm)去除下層游離的IR780,收集洗滌后的I-MPDA,于-45 ℃冷凍干燥48 h備用。

圖1 AI-MPDA NPs的制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation of AI-MPDA NPs

1.2.4 IR780負(fù)載量的測(cè)定

用PBS分別配制質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 μg/mL的IR780溶液,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在λ=780 nm處測(cè)定溶液的吸光值,并繪制IR780溶液吸光度-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mL未純化的AI-MPDA溶液,以13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min(離心半徑為6.79 cm),吸取上清液,并稀釋至合適的質(zhì)量濃度,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度值,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算復(fù)合物中IR780的含量。根據(jù)式(1)和(2)計(jì)算材料的載藥率L和包封率E。

(1)

(2)

式中:m0為IR780的投藥量,g;m1為上清液中IR780的質(zhì)量,g;m為A-MPDA的質(zhì)量,g。

1.3 材料表征

1.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)分析

分別吸取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的MPDA和質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的AI-MPDA乙醇溶液,滴加到銅網(wǎng)上,自然干燥至液滴消失后繼續(xù)烘干,然后通過(guò)透射電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行形貌分析。

1.3.2 穩(wěn)定性分析

取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MPDA和AI-MPDA水溶液,室溫下靜置24 h,觀察納米顆粒在水溶液中的聚集情況。

1.3.3 比表面積與孔隙度(BET)分析

取200 mg冷凍干燥得到的MPDA粉末,通過(guò)全自動(dòng)快速比表面積與孔隙度分析儀測(cè)定樣品的比表面積與孔徑。

1.3.4 納米粒度和電勢(shì)分析

分別取經(jīng)PBS溶解的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MPDA、AI-MPDA溶液各2 mL,超聲處理5 min,然后分別轉(zhuǎn)移到比色皿中,用馬爾文納米粒度電勢(shì)分析儀檢測(cè)不同樣品的粒徑。

同時(shí),利用納米粒度電勢(shì)分析儀對(duì)MPDA及其修飾物的表面電勢(shì)進(jìn)行表征。分別取800 μL PBS溶解的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MPDA、A-MPDA和AI-MPDA樣品置于Zeta電位樣品池,分析不同樣品的Zeta電位。

1.3.5 熱重分析

在氮?dú)鈿夥障率褂脽嶂胤治鰞x,將1～5 mg樣品以10 ℃/min的速率從50 ℃加熱到600 ℃進(jìn)行熱重分析。

1.3.6 UV-Vis分析

分別取PBS溶解的質(zhì)量濃度為50 mg/L的L-Arg、MPDA NPs、IR780、AI-MPDA NPs溶液各800 μL,超聲5 min使其充分溶解,然后分別轉(zhuǎn)移到比色皿中,通過(guò)UV-3600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于200～1 000 nm波長(zhǎng)區(qū)間檢測(cè)樣品的紫外吸收值。

1.4 AI-MPDA的體外細(xì)胞攝取

將143B細(xì)胞接種于35 mm共聚焦培養(yǎng)皿中,并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。設(shè)置4組試驗(yàn),即對(duì)照組PBS、IR780、AI-MPDA NPs、AI-MPDA NPs+NIR(近紅外激光照射)。用未添加FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h(其中AI-MPDA NPs+NIR組在培養(yǎng)2 h后,用808 nm近紅外光照射5 min,然后再培養(yǎng)2 h),然后去掉培養(yǎng)基,用PBS溶液洗滌兩次。用戊二醛溶液在4 ℃下固定細(xì)胞,15 min后吸棄戊二醛溶液,用PBS溶液洗滌兩次,在黑暗中用DAPI染色液染色5 min,再用PBS溶液洗滌3次,通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)記錄圖像。

1.5 AI-MPDA的體外ROS生成

將143B細(xì)胞接種于6孔板,并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。設(shè)置4組試驗(yàn),即對(duì)照組PBS、IR780+NIR、I-MPDA+NIR和AI-MPDA+NIR。將PBS溶液及其溶解的藥物添加到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中,持續(xù)孵育4 h。吸去藥物溶液后,每孔加入1 mL配置好的DCFH染液。于37 ℃溫育20 min(其中NIR組在溫育10 min后,用808 nm近紅外光照射5 min,然后再溫育5 min),然后吸去染色液,采用PBS溶液洗滌3次,通過(guò)倒置熒光顯微鏡記錄圖像。

1.6 AI-MPDA的體外NO生成

將143B細(xì)胞接種于6孔板,并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。設(shè)置4組試驗(yàn),即對(duì)照組PBS、A-MPDA NPs+NIR、AI-MPDA NPs+NIR和AI-MPDA NPs+Vc+NIR。將PBS溶液及其溶解的藥物添加到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中,持續(xù)孵育4 h。吸去藥物溶液后,每孔加入1 mL配置好的DAF-FM DA染液。然后于37 ℃溫育20 min(其中NIR組在溫育10 min后,用808 nm近紅外光照射5 min,然后再溫育5 min),然后吸去染色液,使用PBS溶液洗滌3次,通過(guò)倒置熒光顯微鏡記錄圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的制備及性質(zhì)

2.1.1 MPDA和AI-MPDA的TEM分析和穩(wěn)定性分析

MPDA和AI-MPDA的TEM圖如圖2所示。由圖2(a)可以看出,MPDA具有較為均勻的球形形貌和不規(guī)則的介孔結(jié)構(gòu),肉眼觀察到其粒徑約為180 nm;由圖2(b)可以看出,AI-MPDA的介孔結(jié)構(gòu)逐漸變得模糊,粒徑略微增大,約為200 nm,說(shuō)明成功合成納米顆粒。此外,將MPDA和AI-MPDA的水溶液靜置24 h后,均沒(méi)有觀察到明顯的聚集現(xiàn)象(見(jiàn)圖3),說(shuō)明制備的納米顆粒具有良好的分散性和穩(wěn)定性。

圖2 MPDA和AI-MPDA的TEM圖像Fig.2 TEM images of MPDA and AI-MPDA

圖3 MPDA和AI-MPDA在水中的數(shù)碼照片F(xiàn)ig.3 Digital photos of the MPDA and AI-MPDA in water

2.1.2 MPDA的BET分析

MPDA的氮?dú)馕?脫附曲線和孔徑分布曲線如圖4所示,其中,圖4(b)縱軸標(biāo)題中的r=dV/dD。由圖4(a)可知,MPDA的氮?dú)馕?脫附曲線為典型的Ⅳ型等溫線,表明存在介孔。此外,由圖4(b)可知,MPDA在9～80 nm內(nèi)存在較寬的孔徑分布。這是因?yàn)榧{米顆粒的孔徑分布不規(guī)則,且在合成的過(guò)程中產(chǎn)生了大小不規(guī)則的空腔。制備的MPDA納米顆粒的比表面積為40.80 m2/g,總孔容為0.44 cm3/g。

圖4 MPDA的氮?dú)馕?脫附等溫曲線和孔徑分布Fig.4 Nitrogen adsorption and desorption isothermal curve and pore size distribution of MPDA

2.1.3 MPDA和AI-MPDA的粒徑和電勢(shì)分析

MPDA和AI-MPDA的粒徑分布如圖5所示。由圖5可知,制備的MPDA納米載體的粒徑約為180 nm。經(jīng)過(guò)一系列修飾后,AI-MPDA的粒徑略大于MPDA,約為200 nm,能通過(guò)腫瘤的高滲透強(qiáng)滯留(enhanced permeability and retention,EPR)效應(yīng),促使AI-MPDA在腫瘤部位聚集。

圖5 MPDA和AI-MPDA的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of MPDA and AI-MPDA

通過(guò)Zeta電勢(shì)的變化來(lái)驗(yàn)證納米顆粒的制備結(jié)果。MPDA、A-MPDA和AI-MPDA的表面電勢(shì)如圖6所示。由圖6可知,MPDA的電勢(shì)約為-24.6 mV,加入L-Arg后,A-MPDA的電勢(shì)變?yōu)?10.6 mV,負(fù)載IR780后的電勢(shì)較A-MPDA升高了約3 mV。電勢(shì)的變化表明成功制備出AI-MPDA納米顆粒。

圖6 MPDA、A-MPDA和AI-MPDA的表面電勢(shì)Fig.6 Zeta potential of MPDA, A-MPDA and AI-MPDA

2.1.4 IR780、L-Arg的負(fù)載和UV-Vis分析

證實(shí)成功合成MPDA后,利用納米載體進(jìn)行載藥。將載藥試驗(yàn)得到的上清液中的IR780的吸光值代入到IR780標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.040 3x+0.155 1,R2=0.999 3)中求IR780的負(fù)載量,再將IR780負(fù)載量代入式(1)和式(2),計(jì)算得出載藥率為19.88%、包封率為99.00%。

MPDA和A-MPDA的熱重分析曲線如圖7所示。MPDA加熱到600 ℃時(shí)失重率為45.7%,而A-MPDA加熱到600 ℃時(shí)的失重率為53.2%。這主要?dú)w功于L-Arg發(fā)生的熱解反應(yīng)。證實(shí)L-Arg成功負(fù)載在MPDA上。計(jì)算得出L-Arg的負(fù)載率約為7.5%。

圖7 MPDA和A-MPDA的熱重分析曲線Fig.7 TGA curves of MPDA and A-MPDA

MPDA、L-Arg、IR780和AI-MPDA的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜如圖8所示。由圖8可知,在600～800 nm處出現(xiàn)游離IR780的特征吸收峰,相應(yīng)地,AI-MPDA在700～900 nm處有較寬的吸收峰。IR780的典型吸收峰位于740和810 nm處,這可歸因于IR780聚集體形成的紅移現(xiàn)象[23],說(shuō)明成功制備得到AI-MPDA納米顆粒。

圖8 MPDA、L-Arg、IR780和AI-MPDA的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜Fig.8 UV-Vis absorption spectra of MPDA, L-Arg, IR780 and AI-MPDA

2.2 AI-MPDA NPs的體外細(xì)胞攝取

為了評(píng)估143B細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取情況,通過(guò)CLSM記錄細(xì)胞內(nèi)的IR780熒光強(qiáng)度,結(jié)果如圖9所示。由圖9可知,與游離IR780治療時(shí)的微弱紅色熒光相比,經(jīng)AI-MPDA孵育后,143B細(xì)胞的IR780紅色熒光顯著增強(qiáng),說(shuō)明IR780標(biāo)記的納米顆粒很多被143B細(xì)胞內(nèi)化。這可能是因?yàn)镸PDA的兒茶酚基團(tuán)會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取[24]。此外,AI-MPDA+NIR組的紅色熒光最明顯,說(shuō)明近紅外激光照射增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)AI-MPDA的攝取。這可能是由于激光照射下MPDA產(chǎn)生的高溫對(duì)細(xì)胞膜造成了輕微損傷,增強(qiáng)了細(xì)胞攝取效應(yīng)[25]。

圖9 143B細(xì)胞的倒置熒光顯微圖像Fig.9 Inverted fluorescence microscopic image of 143B cell

2.3 ROS的體外生成

以DCFH為探針,通過(guò)倒置熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS含量,以評(píng)估AI-MPDA在細(xì)胞內(nèi)的ROS生成情況,結(jié)果如圖10所示。由圖10可知,與游離IR780共孵育4 h后,在143B細(xì)胞中只觀察到微弱的熒光,與細(xì)胞攝取的結(jié)果一致。這是因?yàn)榧?xì)胞對(duì)游離IR780的攝取較少。I-MPDA在激光照射下的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于AI-MPDA,這是由于在L-Arg參與的NO生成反應(yīng)中消耗了ROS。

圖10 143B細(xì)胞的DCFH熒光顯微圖像Fig.10 DCFH fluorescence microscopic image of 143B cell

2.4 NO氣體的體外生成

以DAF-FM DA為熒光探針,通過(guò)倒置熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的NO含量,評(píng)估AI-MPDA在細(xì)胞內(nèi)的NO生成情況,結(jié)果如圖11所示。由圖11可知,經(jīng)AI-MPDA+NIR治療后,細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度最強(qiáng),表明AI-MPDA在細(xì)胞內(nèi)的NO釋放效率最高。值得注意的是,用還原劑Vc清除PDT效應(yīng)產(chǎn)生的ROS后,細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度明顯減弱。這表明細(xì)胞中的NO是通過(guò)轉(zhuǎn)化ROS產(chǎn)生的。該結(jié)論與AI-MPDA組的ROS結(jié)果相一致。

圖11 143B的DAF-FM DA熒光顯微圖像Fig.11 DAF-FM DA fluorescence microscopic image of 143B

3 結(jié) 語(yǔ)

采用模板法制備介孔聚多巴胺納米載體顆粒,并負(fù)載L-Arg和IR780,構(gòu)建了精氨酸-IR780-聚多巴胺納米顆粒。透射電子顯微圖像和比表面積分析表明,該納米復(fù)合物具有較規(guī)則的形貌和較大的比表面積。體外細(xì)胞試驗(yàn)表明,介孔聚多巴胺納米載體可以被143B腫瘤細(xì)胞攝取,并能通過(guò)將活性氧轉(zhuǎn)化為NO實(shí)現(xiàn)NO氣體的腫瘤原位釋放,是一種具有潛力的納米遞送系統(tǒng)。