仿膠原纖維屈曲結構PPDO纖維膜的制備及性能

魏 岑，魏樂倩，李超婧，毛吉富，王 璐

(東華大學 a.紡織學院, b.紡織面料技術教育部重點實驗室, 上海 201620)

膠原纖維以平行束的形式存在于人體多個部位的細胞外基質(ECM)中,通常呈卷曲的周期性波浪形態(tài)[1]。這種屈曲結構ECM能夠為瓣膜小葉、韌帶和肌腱等組織提供彈性以防止損傷,有助于改善組織的非線性力學性能。除纖維間的相互作用以外,隨著應變的增加,波紋逐漸展開,組織剛度增加[2],這種應變加固效應能夠在低應變下提供柔韌性,防止過載和損傷,增加延伸性[1]。

靜電紡絲技術被廣泛應用于組織工程,如利用微納米纖維結構來模擬天然ECM的纖維微環(huán)境。此外,利用靜電絲技術制備平行取向排列的微納米纖維,可用于模仿部分天然組織的高度各向異性結構[3]。探索靜電紡絲微納米纖維屈曲結構的制備方法成為當前的研究熱點。通過獲得卷曲結構從而提高纖維膜的力學性能可制備既具有優(yōu)異的生物相容性又能滿足天然組織力學需求的組織工程支架[4],現(xiàn)有的制備方法分為直接電紡卷曲纖維膜以及對電紡膜進行后處理兩種方式[5]。目前大部分用于進行組織再生的卷曲電紡纖維膜是通過后處理技術獲得的,例如:Surrao等[6]和Szczesny等[7]先將聚合物電紡到旋轉的芯棒上以獲得取向纖維,再將其浸泡于37 ℃的緩沖溶液中進行后處理以賦予纖維卷曲形態(tài),細胞試驗結果表明該支架有助于韌帶組織的再生和重塑;Liu等[3]利用聚合物和增塑劑之間的相互作用,獲得卷曲程度可控的電紡聚乳酸納米纖維,結果顯示,在卷曲的納米纖維上培養(yǎng)的肌腱成纖維細胞能夠對外界壓力表現(xiàn)出更高的耐受性,即電紡卷曲的聚乳酸納米纖維可用于修復結締組織。由此可見,卷曲結構的特性能夠對用于修復韌帶、肌腱等致密結締組織的纖維支架產生有效影響。

聚對二氧環(huán)己酮(PPDO)是一種脂肪族聚酯材料,其分子鏈中的酯鍵使該材料具有良好的生物相容性、生物降解性和可吸收性[8-9],能夠在體內完全降解,且降解產物無毒副作用[10-11],相比降解后產生酸性產物引起炎癥反應的聚乳酸而言具有更好的生物相容性;此外,PPDO分子鏈中含有獨特的醚鍵,使得材料具備了優(yōu)異的柔韌性和抗拉強度[12-13]。本研究在此基礎上對PPDO電紡纖維膜進行天然膠原纖維屈曲結構的仿生處理,以提高其拉伸彈性,改善其親水性;同時,探究其應用于組織工程再生的可能性。采用熱處理的方法使靜電紡PPDO微納米纖維獲得波紋形屈曲結構;為避免因電紡纖維膜中的纖維排列過于緊密而限制細胞向膜內滲透和生長[14],利用硼氫化鈉(NaBH4)與甲醇(CH3OH)之間的化學反應生成氫氣氣泡將纖維吹散,以增加纖維間的孔隙,從而對屈曲的PPDO微納米纖維膜進行蓬松處理,獲得仿膠原纖維屈曲結構的PPDO纖維膜,并對PPDO纖維膜的各項性能進行表征,探討此工藝模擬ECM膠原屈曲形態(tài)的可行性。

1 試驗部分

1.1 試驗材料與儀器

PPDO,東莞市凱茜利塑膠原料有限公司;六氟異丙醇(HFIP),上海市阿拉丁試劑有限公司;乙醇(C2H5OH)、NaBH4、CH3OH,國藥集團化學試劑有限公司;人包皮成纖維細胞(HFF-1)、完全培養(yǎng)基,中國科學院上海細胞庫;細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8),上海圣爾生物科技有限公司;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)1X,美國Thermo公司。

ME204E型電子天平,瑞士METTLER TOLEDO;524 G型磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;ET-2535 H型靜電紡絲裝置,永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司;SU8010型場發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本日立公司;D8 ADVANCE型X射線衍射儀,德國Bruker 公司;Autosorb-iQ型全自動快速比表面與孔隙度分析儀,美國康塔儀器公司;OCA15EC型接觸角測量儀,德國dataphysics公司;HY-940FS型電腦式拉壓力試驗機,上海恒馭儀器有限公司;Multiskan FC型酶標儀,美國Thermo公司。

1.2 PPDO纖維膜的制備

稱取一定質量PPDO顆粒溶解于HFIP中,用磁力攪拌器在室溫下攪拌12 h,配制PPDO質量分數(shù)為17%的紡絲溶液。靜電紡絲選用規(guī)格為22 G的針頭,紡絲電壓為24 kV,接收距離為18 cm,注射器推注速度為2 mL/h,承接滾軸轉速為1 800 r/min,環(huán)境參數(shù)為溫度20～30 ℃,相對濕度50%～60%。紡絲完成后,將所得的纖維膜置于通風櫥中,在室溫下干燥24 h以去除殘留溶劑。

1.3 仿膠原纖維屈曲結構的制備

在恒溫水浴鍋中將無水乙醇溶液加熱至35 ℃并保持溫度恒定,將裁剪好的PPDO纖維膜浸泡在熱的無水乙醇溶液中,30 min后取出靜置干燥。稱取硼氫化鈉粉末并將其溶解于甲醇溶液中,配置成濃度為0.1 mol/L的硼氫化鈉-甲醇溶液,將裁剪好的PPDO纖維膜置于上述溶液中,待反應結束后取出纖維膜并置于通風櫥中干燥。

1.4 理化性能測試與表征

1.4.1 微觀形貌

使用SU8010型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察各仿生層支架的微觀形態(tài)。采用Image J軟件測試纖維直徑、纖維排列的取向程度、卷曲波紋形纖維中波紋的振幅和波紋的長度。其中:用纖維排列的角度表征纖維排列的取向程度;通過測量卷曲纖維中一個波紋內波峰位置和波谷位置的高度差表征波紋振幅;用卷曲纖維中一個波紋內波峰位置與波谷位置間距的兩倍表征波紋的波長。每種樣品測試100組,結果取平均值。

1.4.2 結晶度測試

采用D8 ADVANCE型X射線衍射(XRD)儀測試PPDO纖維膜的結晶度。設定衍射角掃描范圍為5°～60°。根據(jù)結晶峰計算樣品的結晶度。

1.4.3 比表面積及孔隙分布

稱取400～500 mg PPDO纖維膜,在40 ℃條件下真空脫氣處理10 h;使用Autosorb-iQ型全自動快速比表面與孔隙度分析儀,采用氮氣吸附法在液氮溫度77 K的環(huán)境下對PPDO纖維膜的比表面積及孔隙分布進行測量。

1.4.4 水接觸角

采用OCA15EC型接觸角測量儀測試PPDO纖維膜的靜態(tài)水接觸角。將體積為5 μL的去離子水滴至材料表面,通過懸液法測定樣品表面的靜態(tài)水接觸角,每個樣品測試5個不同位置的水接觸角,結果取平均值。

1.4.5 力學性能

使用HY-940FS型電腦式拉壓力試驗機,參照GB/T 3923.1—2013《紡織品 織物拉伸性能 第1部分:斷裂強力和斷裂伸長率的測定(條樣法)》[15]對PPDO纖維膜進行單軸拉伸測試。將纖維膜分別沿橫向和縱向裁剪成尺寸為10 mm×70 mm的條形試樣,用臺式測厚儀測量纖維膜的厚度,設定標距為50 mm。當條形試樣的夾持方向平行于受力方向時,以100 mm/min的速度拉伸試樣至樣品斷裂,根據(jù)拉伸應力-應變曲線計算不同PPDO纖維膜的拉伸強度、斷裂伸長率及彈性模量,每組測試5個樣品,結果取平均值。

1.5 生物性能評價

1.5.1 細胞增殖

樣品準備:樣品用去離子水浸泡48 h,干燥后裁剪成直徑為1.5 cm的圓片并置于24孔細胞培養(yǎng)板內。樣品使用前在乙醇體積分數(shù)為75%的酒精蒸缸中處理24 h,取出后用PBS溶液浸泡12 h,再更換新的無菌PBS溶液浸泡6 h并重復一次,細胞接種前用無菌PBS溶液清洗試樣兩次,去除樣品中殘留的乙醇。

細胞接種與培養(yǎng):復蘇HFF-1第25代,于溫度37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞密度達90%。使用乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶將細胞從培養(yǎng)瓶中消化下來并轉移至離心管中。離心后得到細胞沉淀物,加入1 mL完全培養(yǎng)基制得細胞懸浮液;取10 μL上述懸浮液,用無菌PBS溶液稀釋至100 μL,統(tǒng)計稀釋細胞懸液中的細胞數(shù)量以確定細胞密度,計數(shù)后配制細胞密度為4×104個/mL的細胞懸浮液。將上述細胞懸浮液以500 μL/孔的含量加入24孔培養(yǎng)板中,每2 d更換一次細胞培養(yǎng)液。

細胞增殖曲線:細胞培養(yǎng)1 d后,取出24孔培養(yǎng)板,移除培養(yǎng)孔內樣品,并吸去細胞培養(yǎng)孔內培養(yǎng)基,使用無菌PBS溶液洗去孔內殘余液體;配制由90% 高糖的氨基酸葡萄糖培養(yǎng)基(DMEM)和10% CCK-8試劑混合而成的CCK-8工作液,并將上述溶液加至500 μL/孔的培養(yǎng)板中,在培養(yǎng)箱中于標準試驗條件下孵育3 h。孵育結束后將溶液轉移至96孔板,在酶標儀中測量其在波長450 nm處的吸光度。細胞增殖率Rcell計算方法如下:

(1)

式中:Dt為所測樣品的吸光度值;D0為空板吸光度值;Dc為空白對照組的吸光度值。

根據(jù)計算所得的細胞增殖率按表1進行細胞毒性分級評定,其中毒性反應級別在Ⅰ級以下時可判定為材料無細胞毒性。

表1 細胞毒性評級標準[16]Table 1 Cytotoxicity rating criteria[16]

1.5.2 免疫熒光染色

使用鬼筆環(huán)肽和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對顯綠色的纖維形肌動蛋白(F-Actin)和顯藍色的細胞核進行熒光標記。具體步驟:配制1%牛血清白蛋白(BSA)溶液,0.5%聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100),100 nmol/L異硫氰酸熒光素標記鬼筆環(huán)肽(FITC Phalloidin)工作液,100 nmol/L DAPI工作液;取出培養(yǎng)板后吸去培養(yǎng)液,用37 ℃預熱的PBS(pH=7.4)溶液清洗細胞2次;用4%多聚甲醛室溫固定10 min,隨后用PBS溶液清洗細胞10 min(重復3次);用0.5% Triton X-100室溫透化20 min,隨后用PBS溶液清洗細胞10 min(重復2次);每孔加入200 μL 100 nmol/L的FITC Phalloidin工作液,室溫避光孵育30 min;孵育結束后,PBS溶液清洗5 min(重復3次),每孔加入200 μL 100 nmol/L的DAPI工作液,室溫避光孵育5 min;吸去染色液后用PBS溶液清洗,留少許PBS溶液濕潤樣品,在熒光顯微鏡下觀察試樣。

1.6 統(tǒng)計學分析

本文數(shù)據(jù)均以平均值±標準差形式表示。采用單因素方差分析比較各組結果之間的差異。當p<0.05時,差異顯著,用*表示;當p<0.01時,差異非常顯著,用**表示。

2 結果與討論

2.1 微觀形貌分析

纖維表面的幾何形貌能夠直觀反映處理前后材料表面發(fā)生的細微變化。對未處理的PPDO取向纖維膜(PPDO-O)、蓬松處理后的蓬松PPDO纖維膜(PPDO-F)、卷曲處理后的卷曲PPDO纖維膜(PPDO-W)以及卷曲處理后再進行蓬松處理的卷曲蓬松PPDO纖維膜(PPDO-W-F)的表觀形貌進行觀察,并對纖維進行表面幾何形貌分析,結果如圖1～4所示。

圖1 PPDO取向纖維膜的SEM圖及表面幾何形貌信息圖Fig.1 SEM image and surface geometry information images of PPDO oriented fiber membrane

圖3 卷曲PPDO纖維膜的SEM圖及表面幾何形貌信息圖Fig.3 SEM image and surface geometry information images of wavy PPDO fiber membrane

由圖1～4可知:取向纖維膜PPDO-O中的纖維排列取向程度較高,纖維直徑為(0.488±0.366)μm。蓬松處理后PPDO纖維膜的纖維直徑為(0.574±0.427)μm,纖維排列的取向程度略有降低且排列較為松散,纖維膜截面SEM圖顯示纖維層間出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象。卷曲處理后PPDO纖維膜的纖維沿取向方向產生了類似天然膠原纖維的波紋形屈曲結構,波紋振幅為(4.464±1.236)μm,單個波紋的周期性長度為(38.725±9.689)μm。卷曲的PPDO纖維膜再進行蓬松處理后所得的纖維的屈曲結構仍穩(wěn)定存在且纖維排列更為松散,纖維層間仍存在明顯的分層現(xiàn)象。對比4種PPDO纖維膜的微觀形貌可知,研究中采用的卷曲處理和蓬松處理方法不僅能使PPDO取向纖維膜產生仿膠原纖維屈曲結構的波紋形纖維,而且能夠對緊密排列的電紡纖維產生一定的分散作用,使得纖維結構更為疏松。

2.2 結晶度分析

對不同PPDO纖維膜進行XRD測試,結果如圖5所示。由圖5可知,PPDO纖維膜的衍射角在21°和24°處均出現(xiàn)了結晶峰,且結晶峰的峰強存在明顯差異,說明卷曲處理和蓬松處理會對PPDO纖維的結晶情況產生顯著影響。

通過分峰處理,計算得出不同PPDO纖維膜的結晶度,如圖6所示。由圖6可知,PPDO取向纖維膜結晶度為(46.96±1.25)%,卷曲處理后纖維膜結晶度減小為(40.34±0.34)%,蓬松處理后纖維膜降低為(43.13±0.32)%,卷曲-蓬松處理后纖維膜結晶度下降至(40.95±1.07)%,說明蓬松處理和卷曲處理顯著降低了纖維膜的結晶度。這可能是因為取向纖維膜成型過程中的取向牽伸使得PPDO的分子鏈鏈段沿牽伸方向取向排列并形成結晶結構,將其浸泡于乙醇或甲醇溶液后,PPDO晶態(tài)結構中取向排列的分子鏈鏈段逐漸舒展并解取向,溫度升高至35 ℃會對分子鏈鏈段的解取向產生熱定型作用從而使纖維呈現(xiàn)波紋形態(tài),纖維的結晶區(qū)隨著分子鏈鏈段的解取向逐漸轉變?yōu)榉墙Y晶區(qū),因此處理后PPDO纖維膜的結晶度明顯降低。

圖6 不同PPDO纖維膜的結晶度Fig.6 Crystallinity of different PPDO fiber membranes

2.3 比表面積及孔隙體積分析

比表面積對微納米材料而言具有重要意義,材料的比表面積越大,其所具有的表面能越大,材料表面的接觸位點也就越多。對不同PPDO纖維膜的比表面積和孔隙體積進行測試,結果如圖7和表2所示。根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)在2015年更新的物理吸附等溫線的分類可知,圖7中PPDO纖維膜的測試曲線趨勢呈典型的Ⅱ型等溫線特征[17]。這是因為PPDO纖維膜表面具有較強的相互作用,在相對較低的壓力下吸附量迅速增加,表現(xiàn)為曲線斜率較大;隨著相對壓力的增大,單層吸附逐漸飽和,從而轉變?yōu)槎鄬游?從圖7可以看出,相對壓力趨向1時,卷曲、蓬松處理后的纖維膜的吸附量明顯高于未處理的PPDO取向纖維膜,說明處理后纖維膜中可吸附氣體的位點明顯增多。

表2 不同PPDO纖維膜的比表面積和總孔隙體積

由表2可知,PPDO取向纖維膜的比表面積為4.094 m2/g,孔隙體積為1.31×10-2cm3/g;蓬松處理后纖維膜的比表面積減小至3.740 m2/g,而孔隙體積增至1.72×10-2cm3/g,說明蓬松處理對纖維排列有一定的分散作用,可使部分纖維團聚成簇的同時各簇纖維間出現(xiàn)間隙;卷曲處理后纖維膜的比表面積增至5.875 m2/g,孔隙體積也略有增加,說明卷曲處理賦予纖維膜的屈曲結構能夠使纖維膜的比表面積增大;蓬松卷曲PPDO纖維膜的比表面積增至5.112 m2/g,孔隙體積顯著增至2.19×10-2cm3/g,說明卷曲處理和蓬松處理能夠對纖維的分散產生協(xié)同作用,同時能夠增大纖維膜的比表面積和孔隙體積,有利于細胞的黏附和生長。

2.4 水接觸角分析

接觸角是衡量材料表面對液體的潤濕性能的重要參數(shù),常用于表征纖維膜表面的親疏水性,若接觸角小于90°,則材料表面呈親水性,反之,材料表面呈疏水性。研究[18]表明,改善材料表面的親水性能夠促進細胞的黏附和遷移。本研究使用超純水對不同PPDO纖維膜的水接觸角進行測試,結果如圖8所示。

圖8 不同PPDO纖維膜的水接觸角Fig.8 Water contact angle of different PPDO fiber membranes

PPDO取向纖維膜的水接觸角為(125.26±2.33)°,說明PPDO取向纖維膜表面疏水;蓬松處理后纖維膜的水接觸角減小至(84.72±10.65)°,纖維膜表面的親水性明顯提高,這是因為蓬松處理使得纖維間隙增加且纖維層間發(fā)生分層,纖維膜內儲存水的孔隙增大,促進纖維膜表面對水的潤濕作用;卷曲處理后纖維膜的水接觸角為(127.07±2.01)°,相比取向纖維膜未發(fā)生明顯改變,說明卷曲處理并未明顯改變纖維膜的親疏水性。在卷曲處理的基礎上進行蓬松處理所得的纖維膜表面的水接觸角為(93.16±7.06)°,說明同時經過卷曲處理和蓬松處理的PPDO纖維膜的親水性有明顯提高。

2.5 力學性能測試

植入體內的材料通常對力學性能都有一定的要求,需要材料與植入部位的力學需求相匹配,電紡膜材料的力學性能主要取決于纖維的結構以及材料本身的力學性能。對不同PPDO纖維膜分別進行縱向和橫向拉伸性能測試,其中,橫向拉伸是指拉伸方向垂直于纖維原有的取向方向,縱向拉伸則是指拉伸方向平行于纖維原有的取向方向,結果如圖9和10所示。由圖9和10可知,4種PPDO取向纖維膜均表現(xiàn)出明顯的力學各向異性。

圖9 不同PPDO纖維膜縱向拉伸測試結果Fig.9 Tensile results of different PPDO fiber membranes in vertical direction

由圖9可知:蓬松處理對纖維膜縱向拉伸性能未產生明顯影響;卷曲處理對縱向拉伸強度的影響不顯著,但纖維膜縱向拉伸的斷裂伸長率顯著增大,縱向拉伸的彈性模量顯著降低。原因在于處理后的纖維沿取向方向產生屈曲結構,拉伸初期這種波紋狀的屈曲結構逐漸伸直,纖維本身未受到拉伸,因此表現(xiàn)為纖維膜的彈性增強。卷曲-蓬松PPDO纖維膜縱向拉伸強度略有增大,從(4.13±0.28)MPa增至(5.31±0.32)MPa,其斷裂伸長率和彈性模量幾乎沒有變化,說明卷曲處理和蓬松處理對纖維膜的縱向拉伸起到了一定的增強作用。

由圖10可知,蓬松處理后,纖維膜的橫向拉伸性能顯著提高,橫向拉伸強度由原取向纖維膜的(0.18±0.01)MPa增至(0.28±0.01)MPa,斷裂伸長率變?yōu)樵∠蚶w維膜的兩倍多,彈性模量也略有提高。推測原因可能是蓬松處理在橫向上對纖維產生分簇作用,從而纖維在橫向上隨機發(fā)生分散,且部分位置有纖維沿取向方向隨機聚集成簇,成簇的纖維間的纏結增強,并且各簇纖維在不同位置的纏結狀態(tài)不同,表現(xiàn)為橫向拉伸性能顯著提高。卷曲處理僅對纖維膜的橫向拉伸強度有所增強,對纖維膜的斷裂伸長率和彈性模量的影響不顯著。同時經過蓬松處理和卷曲處理的纖維膜在橫向上的拉伸強度[(0.25±0.02)MPa]、斷裂伸長率[(167.67±38.22)%]以及彈性模量[(0.97±0.12)MPa]均有增大,說明卷曲處理并未削弱蓬松處理對纖維膜橫向拉伸性能的提高作用。

圖10 不同PPDO纖維膜橫向拉伸測試結果Fig.10 Tensile results of different PPDO fiber membranes in horizontal direction

2.6 細胞毒性分析

纖維的微觀幾何結構對細胞的形態(tài)、黏附、增殖等具有調節(jié)作用,進而影響組織的再生重塑。采用CCK-8法對不同的PPDO纖維膜進行細胞增殖試驗,結果如圖11所示。由圖11可知,試驗所用的4種PPDO纖維膜在1 d的細胞增殖率均在80%以上。根據(jù)表1的評級標準,4種PPDO纖維膜對應的細胞毒性級別均在Ⅰ級以下,表明上述纖維膜未產生細胞毒性,細胞黏附良好,說明蓬松處理和卷曲處理過程未對材料的細胞相容性產生影響,即處理后的PPDO纖維膜仍具有良好的細胞相容性。

圖11 不同PPDO纖維膜的細胞增殖率Fig.11 Cell viability of different PPDO fiber membranes

2.7 細胞形態(tài)分析

免疫熒光染色可直觀反映材料對細胞形態(tài)的影響,結果如圖12所示。由圖12可知,4種PPDO纖維膜上細胞數(shù)量均隨著培養(yǎng)時間的增加而增加。培養(yǎng)1 d后,纖維膜上的細胞均呈取向排列;培養(yǎng)3、7 d后,細胞取向排列更顯著,說明處理前后的纖維膜均能夠誘導細胞沿著纖維取向方向進行取向生長和排列。相比空白對照組,纖維膜上的細胞形態(tài)更加纖長,排列更加規(guī)則有序,這是因為卷曲處理和蓬松處理使得纖維具有了屈曲結構并且增大了纖維間隙,有利于細胞的長入。

圖12 不同PPDO纖維膜在1、3、7 d時的免疫熒光染色圖Fig.12 Immunofluorescence staining of different PPDO fiber membranes at 1, 3, 7 d

3 結 語

通過對采用靜電紡絲技術制備的PPDO取向纖維膜進行蓬松處理和卷曲處理,成功制備了4種不同結構的PPDO纖維膜,并對其結構與性能進行測試。結果表明:相比取向纖維膜(比表面積為4.094 m2/g),處理后纖維膜的比表面積顯著增大(5.112 m2/g),纖維膜的孔隙體積由1.31×10-2cm3/g增至2.19×10-2cm3/g;纖維膜表面的水接觸角從(125.26±2.33)°減小至(93.16±7.06)°,說明纖維膜的親水性有明顯改善。卷曲-蓬松處理PPDO纖維膜的縱向拉伸強度從(4.13±0.28)MPa增至(5.31±0.32)MPa,橫向拉伸強度從(0.18±0.01)MPa增至(0.25±0.02)MPa,說明卷曲處理和蓬松處理提高了纖維膜整體的拉伸力學性能。4種PPDO纖維膜均無細胞毒性,處理后的纖維膜仍能夠誘導細胞取向排列生長,具有良好的生物相容性。綜上所述,卷曲-蓬松PPDO纖維膜兼具優(yōu)異的拉伸力學性能和良好的細胞相容性。該材料具有應用于組織工程再生修復的潛力。