載藥MOF涂層抗菌真絲縫合線的制備及性能

鄒雨航，張 倩，魏樂倩，毛吉富，c，d，王 璐，c，d

(東華大學(xué) a.紡織學(xué)院,b.纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,c.紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,d.紡織行業(yè)生物醫(yī)用紡織材料與技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室, 上海 201620)

真絲是一種天然的蛋白質(zhì)纖維,真絲編織縫合線具有優(yōu)異的拉伸強(qiáng)度、良好的操作手感和打結(jié)性能,且價(jià)格低廉,在各類外科手術(shù)中應(yīng)用廣泛。但是,真絲縫合線的編織結(jié)構(gòu)為細(xì)菌黏附提供了良好的場(chǎng)所,容易引起手術(shù)部位感染(surgical site infections, SSIs),極大地增加了患者的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。因此,開發(fā)抗菌真絲縫合線具有重要的臨床意義和迫切性。

姜黃素(curcumin, Cur)是一種具有良好生物相容性和生物可降解性的天然化合物,具有抗炎[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]、抗癌[7]等多種作用,在預(yù)防和治療多種疾病方面具有較大的潛力。此外,Cur在傷口愈合的各個(gè)階段均起作用,可增強(qiáng)肉芽組織形成、膠原沉積、組織重塑和創(chuàng)面收縮,加速傷口愈合[8-9]?；诖?利用Cur對(duì)真絲縫合線進(jìn)行表面改性將可能賦予其抗菌性并促進(jìn)傷口愈合。然而,Cur溶解度和穩(wěn)定性較差,因此難以被直接使用,需要尋求合適的藥物載體。

金屬有機(jī)框架(metal organic framework, MOF)是一種金屬離子和有機(jī)配體通過(guò)配位共價(jià)鍵組裝而成的納米多孔材料。沸石咪唑酯骨架材料(zeolitic imidazolate framework-8, ZIF-8)是由鋅離子和2-甲基咪唑構(gòu)筑的具有良好生物相容性的MOF,其不僅具有較高的熱穩(wěn)定性和水熱穩(wěn)定性,而且可作為藥物運(yùn)輸?shù)妮d體[10]?，F(xiàn)有研究[11-13]表明,ZIF-8具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管重建、抗菌的作用,還可作為Cur載體增強(qiáng)Cur的溶解度和穩(wěn)定性。本文以ZIF-8為Cur的功能載體合成納米抗菌材料,并將其修飾到真絲縫合線上構(gòu)建抗菌縫合線。通過(guò)一系列體外試驗(yàn)探究了縫合線的理化性能、抗菌性能和生物相容性,以期為新型抗菌真絲縫合線的開發(fā)提供新思路。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)原料

六水合硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O)、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、無(wú)水乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;Cur購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;2-甲基咪唑(2-methylimidazole, 2-MIM)、鹽酸多巴胺均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;真絲(線密度為6.67 tex,2根真絲合股)購(gòu)自浙江嵊州協(xié)和絲綢有限公司。

1.2 ZIF-8@Cur的制備

稱取2.10 g的 Zn(NO3)2·6H2O溶解在70 mL的超純水中;再將4.62 g的2-MIM、70 mg的Cur溶解在140 mL甲醇中;在轉(zhuǎn)速為700 r/min磁力攪拌下將Zn(NO3)2·6H2O溶液快速倒入2-MIM/Cur溶液中,攪拌1 min后溶液呈橘紅色即生成負(fù)載Cur的ZIF-8;在離心率為8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min(離心半徑為4 cm),收集產(chǎn)物;最后利用甲醇洗滌3次,得到的負(fù)載Cur的ZIF-8命名為ZIF-8@Cur。將產(chǎn)物ZIF-8@Cur用甲醇稀釋至1,5,10,15,20 mg/mL,備用。在不添加Cur的前提下,利用相同的方法制備純ZIF-8。

1.3 真絲編織縫合線的制備

試驗(yàn)采用8根真絲作為殼紗、再將2根相同的真絲作為芯紗,使用國(guó)產(chǎn)8錠立式醫(yī)用編織機(jī),制備2-0型真絲編織縫合線,齒輪比選用82/22,命名為S。

1.4 MOF載藥抗菌縫合線的制備

為了增強(qiáng)載藥MOF在縫合線表面的負(fù)載效果,利用多巴胺對(duì)縫合線進(jìn)行表面改性。具體方法:先配置2 mg/mL的多巴胺溶液,將縫合線S浸漬于其中24 h;然后將清洗干燥所得到的縫合線命名為S/PDA;最后將S/PDA浸泡在1,5,10,15,20 mg/mL的ZIF-8@Cur溶液中12 h,取出后清洗干燥,制備出的載藥MOF涂層真絲縫合線分別命名為S/ZC1,S/ZC5,S/ZC10,S/ZC15,S/ZC20。

1.5 測(cè)試與表征

1.5.1 表面形貌

使用SU8010型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(SEM)觀察ZIF-8@Cur和涂層前后真絲縫合線的表面形貌。使用JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)觀察ZIF-8@Cur的表面形貌。

1.5.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)

使用Spectrum Two型紅外光譜儀測(cè)定ZIF-8@Cur和縫合線的紅外光譜,掃描的波長(zhǎng)為400～4 000 cm-1。使用Bruker D8型X射線衍射儀(XRD)對(duì)ZIF-8@Cur進(jìn)行X射線衍射,分析材料的成分。使用X射線光電子能譜儀(XPS)分析縫合線表面元素。使用全自動(dòng)比表面積分析儀(BET)測(cè)定ZIF-8和ZIF-8@Cur的比表面積、孔體積與孔隙度。

1.5.3 熱穩(wěn)定性

使用TG209F1型熱重分析儀測(cè)試ZIF-8@Cur的熱穩(wěn)定性,測(cè)試條件為氮?dú)夥諊?溫度為50～800 ℃,升溫速度為10 ℃/min。

1.5.4 ZIF-8@Cur載藥量與包封率的測(cè)定

使用紫外分光光度計(jì)(UV-vis),將Cur、ZIF-8和ZIF-8@Cur分別分散在甲醇溶液中,測(cè)量三者在190～900 nm波長(zhǎng)的吸收曲線。將Cur分散在鹽酸和乙醇體積比為1∶9的溶液中,測(cè)量其在433 nm處,質(zhì)量濃度為0,1,2,4,8,16 μg/mL的吸光度值,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10 mg ZIF-8@Cur,用上述鹽酸/乙醇溶液稀釋,計(jì)算其載藥量、包封率,分別如式(1)和(2)所示。

(1)

式中:mZ為ZIF-8@Cur中Cur的質(zhì)量,mg;mZC為ZIF-8@Cur的質(zhì)量,mg。

(2)

式中:mc為 Cur的總投入質(zhì)量,mg。

1.5.5 縫合線藥物上載量的測(cè)定

取15 cm涂層后的真絲縫合線,浸泡在鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%)和乙醇溶液中24 h,測(cè)定433 nm處的吸光度,并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.5.6 縫合線線徑的測(cè)定

使用CH-12.7-BTSX型測(cè)厚儀測(cè)量真絲縫合線直徑,每個(gè)樣品測(cè)試10次,結(jié)果取平均值。

1.5.7 拉伸性能

使用HY-940FS型電腦式拉壓力試驗(yàn)機(jī)測(cè)試縫合線的斷裂強(qiáng)力和伸長(zhǎng)率。參考YY 0167—2020《非吸收性外科縫線》標(biāo)準(zhǔn),測(cè)試參數(shù)中隔距為100 mm,拉伸速率為200 mm/min,每個(gè)樣品測(cè)試5次,結(jié)果取平均值。

1.5.8 抗菌性能

通過(guò)瓊脂平皿擴(kuò)散法來(lái)表征縫合線的抗菌性。將大腸埃希菌(ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)分別放入含有肉湯的試管中培養(yǎng)18 h,取出后用棉簽蘸取濃度為108CFU/mL的菌液,均勻涂抹在配制好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,用鑷子夾取5 cm的待測(cè)縫合線,貼放在平板表面,蓋好平板并倒置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,取出后讀取抑菌帶外徑寬度。

抑菌帶寬度的計(jì)算如式(3)所示。

(3)

式中:H為抑菌帶寬度,mm;D為抑菌帶外徑的平均寬度,mm;d為試樣平均直徑,mm。

1.5.9 細(xì)胞相容性

樣品準(zhǔn)備:將樣品用去離子水浸泡48 h,干燥后裁剪成長(zhǎng)度為1.5 cm并放置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。樣品使用前放置于含75%乙醇的酒精蒸缸中24 h,取出后用無(wú)菌PBS浸泡12 h后,最后細(xì)胞接種前用無(wú)菌PBS清洗兩次,以去除樣品中殘留的乙醇。

細(xì)胞接種與培養(yǎng):復(fù)蘇人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblast, HFF-1)第25代,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中(溫度為37 ℃,CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)90%。使用EDTA-胰酶將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中脫落下來(lái)并轉(zhuǎn)移至離心管中。經(jīng)離心后得到細(xì)胞沉淀物,加入1 mL完全培養(yǎng)基制得細(xì)胞懸浮液;取10 μL上述懸浮液,用無(wú)菌PBS稀釋至100 μL,統(tǒng)計(jì)稀釋細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量以確定細(xì)胞密度,計(jì)數(shù)后配制細(xì)胞密度為4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸浮液。將上述細(xì)胞懸浮液加入24孔培養(yǎng)板中,500 μL/孔。每?jī)商旄鼡Q一次細(xì)胞培養(yǎng)液。

細(xì)胞增殖率:細(xì)胞培養(yǎng)至第1,3,7 d時(shí),取出24孔培養(yǎng)板,移除培養(yǎng)孔內(nèi)樣品,并吸去細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)基,使用無(wú)菌PBS洗去孔內(nèi)殘余液體;配制由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%高糖DMEM和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%CCK-8試劑混合的CCK-8工作液,然后將上述溶液加入培養(yǎng)板(500 μL/孔),于培養(yǎng)箱中孵育3 h。孵育結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移至96孔板,在酶標(biāo)儀中測(cè)量其在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度。

細(xì)胞增殖率計(jì)算公式如式(4)所示。

(4)

式中:Dt為所測(cè)樣品的吸光度值;D0為空板吸光度值;Dc為空白對(duì)照組的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 載藥MOF的表面形貌與結(jié)構(gòu)

2.1.1 ZIF-8和ZIF-8@Cur的表面形貌

通過(guò)SEM觀察ZIF-8和ZIF-8@Cur的表面形貌,結(jié)果如圖1(a)(b)所示。由圖1(a)和(b)可知,ZIF-8和ZIF-8@Cur呈規(guī)則的晶體結(jié)構(gòu),粒徑大小均勻,其中ZIF-8顆粒直徑為120 nm左右,ZIF-8@Cur粒徑直徑為160 nm左右,與文獻(xiàn)[14]所報(bào)導(dǎo)的結(jié)果相吻合。透射電鏡觀察ZIF-8和ZIF-8@Cur的表面形貌,如圖1(c)和(d)所示,與掃面電鏡觀察的結(jié)果相近。

圖1 不同試樣的SEM和TEM圖Fig.1 SEM and TEM images of different samples

2.1.2 ZIF-8和ZIF-8@Cur的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 不同試樣的FTIR,XRD和TGA圖Fig.2 FTIR,XRD and TGA images of different samples

2.1.3 不同試樣的熱穩(wěn)定性

通過(guò)TGA測(cè)試表征ZIF-8@Cur、ZIF-8、Cur等3種試樣的熱穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2(c) 所示。由圖2(c)可知,隨著溫度的升高,Cur在200 ℃時(shí)開始失重下降,ZIF-8和ZIF-8@Cur在600 ℃左右結(jié)構(gòu)開始崩塌,ZIF-8@Cur在300 ℃開始出現(xiàn)第一次快速失重,在600 ℃處ZIF@Cur 比ZIF-8多損失8.66%,這是由負(fù)載的Cur開始降解導(dǎo)致的。

2.1.4 不同試樣的紫外光譜圖與ZIF-8@Cur載藥量

圖3 為Cur、ZIF-8、ZIF-8@Cur在甲醇中的紫外光譜圖。由圖3可知,Cur在421 nm處出現(xiàn)特征峰,ZIF-8@Cur在418 nm處出現(xiàn)特征峰,說(shuō)明Cur成功負(fù)載到ZIF-8上。圖4為Cur在鹽酸/乙醇溶液體系中測(cè)試?yán)L制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為(y=0.164 6x+0.006 7;R2=0.998 9)。利用ZIF-8在酸性條件下崩解的特點(diǎn)[15],并借助該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到ZIF-8@Cur的載藥量為8.52%,包封率為70.29%。

圖3 不同試樣在甲醇溶液中的紫外-可見吸收光譜圖Fig.3 UV-vis absorption of different samples in methanol solution

圖4 Cur在鹽酸和乙醇溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of Cur in hydrochloric acid and ethanol solution

2.1.5 ZIF-8和ZIF-8@Cur的比表面積分析

通過(guò)BET分析,ZIF-8和ZIF-8@Cur的比表面積、微孔體積和孔徑結(jié)果如表1所示。由表1可知,ZIF-8@Cur的比表面積為1 538.48 m2/g,微孔體積為0.50 cm3/g,孔徑為1.18 nm,相比ZIF-8均有所下降,更加證實(shí)Cur成功負(fù)載到ZIF-8納米孔中。

表1 ZIF-8和ZIF-8@Cur的比表面積、微孔體積和孔徑

2.2 載藥MOF涂層抗菌真絲縫合線的表征

2.2.1 涂層前后真絲縫合線的表面形貌

通過(guò)SEM觀察分析涂層前后縫合線表面形態(tài)變化,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,未經(jīng)涂層處理的縫合線表面光滑平整,涂層后縫合線表面都存在ZIF-8@Cur納米顆粒,隨著ZIF-8@Cur質(zhì)量濃度的增大,縫合線表面的納米顆粒的數(shù)量增加,其中S/ZC15組縫合線表面納米顆粒涂層較為均勻平整,S/ZC20組縫合線表面出現(xiàn)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象,這是由ZIF-8@Cur溶液質(zhì)量濃度過(guò)高導(dǎo)致的。

圖5 涂層前后真絲縫合線的SEM圖Fig.5 SEM images of the silk sutures before and after coating

2.2.2 涂層前后真絲縫合線的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖6 S,S/PDA和S/ZC15的紅外光譜和X射線光電子能譜Fig.6 FTIR and XPS of the S,S/PDA and S/ZC15

2.2.3 真絲縫合線的藥物上載量

真絲縫合線的藥物上載量如圖7所示。由圖7可知,不同ZIF-8@Cur質(zhì)量濃度處理后的真絲縫合線載藥量隨著質(zhì)量濃度的增大依次提高,其中S/ZC1為(2.12±0.22)μg,S/ZC5為(2.76±0.26)μg,S/ZC10為(5.12±0.41)μg,S/ZC15為(14.92±1.29)μg,S/ZC20為(21.08±1.09)μg,樣品S/ZC15 和S/ZC20有顯著性提高,但由圖5(f)可知,高質(zhì)量濃度的MOF在縫合線表面會(huì)形成團(tuán)聚,影響縫合線的應(yīng)用,因此選擇較高藥物上載量和涂層均勻的S/ZC15。

圖7 真絲縫合線的藥物上載量Fig.7 Drug load of silk sutures

2.2.4 涂層前后真絲縫合線的力學(xué)性能

涂層前后真絲縫合線的直徑如表2所示。由表2可知,未涂層縫合線S的直徑為(300.4±7.0)μm,涂層后縫合線的直徑未有顯著性提高,這說(shuō)明涂層不會(huì)改變縫合線的線徑,縫合線規(guī)格仍屬于2-0 。

表2 涂層前后真絲縫合線的直徑Table 2 Diameter of silk sutures before and after coating

涂層前后真絲縫合線的斷裂強(qiáng)力-應(yīng)變曲線和打結(jié)斷裂強(qiáng)力-應(yīng)變曲線如圖8所示。由圖8可知,未涂層縫合線S的拉伸斷裂強(qiáng)力為(27.36±0.51)N,斷裂伸長(zhǎng)率為(17.16±0.56)%;打結(jié)斷裂強(qiáng)力為(18.40±0.57)N,斷裂伸長(zhǎng)率為(10.72±0.37)%;涂層后的縫合線斷裂強(qiáng)力未有顯著性變化,S/ZC20的斷裂強(qiáng)力為(25.11±1.75)N,斷裂伸長(zhǎng)率為(16.28±1.86)%,較未涂層縫合線S略有下降,這是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度的MOF涂層會(huì)影響縫合線表面的粗糙度,形成大塊的團(tuán)聚,這些結(jié)構(gòu)會(huì)影響縫合線的斷裂強(qiáng)力和斷裂伸長(zhǎng)率?？p合線的打結(jié)斷裂強(qiáng)力是評(píng)價(jià)縫合線力學(xué)性能的重要指標(biāo),如圖8(d)所示,涂層前后縫合線的打結(jié)斷裂強(qiáng)力未有顯著性變化,均符合YY 0167—2020《非吸收性外科縫線》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(圖8(d)中虛線)。

圖8 涂層前后真絲縫合線的力學(xué)性能Fig.8 Mechanical properties of silk sutures before and after coating

2.3 載藥MOF涂層真絲縫合線的抗菌性能

為探究S/ZC15的抗菌性能,采用瓊脂平皿擴(kuò)散法測(cè)試涂層前后縫合線對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用,結(jié)果如圖9所示。由圖9可知,改性前的縫合線S對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均沒有抑制作用,而S/ZC15可觀察到清晰的抑菌圈,其對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌帶寬度分別為(2.20±0.05)和(2.09±0.08)mm,參照GB/T 20944—2007《紡織品 抗菌性能的評(píng)價(jià) 第1部分:瓊脂平皿擴(kuò)散法》,抗菌效果評(píng)價(jià)中抑菌帶大于1 mm沒有細(xì)菌繁殖,這說(shuō)明S/ZC15涂層縫合線具有良好的抗菌性能。

圖9 S和S/ZC15真絲縫合線的抗菌性能Fig.9 The antibacterial activity of S and S/ZC15 silk sutures

2.4 載藥MOF涂層真絲縫合線的細(xì)胞相容性

人包皮成纖維細(xì)胞HFF-1與S/ZC15縫合線共培養(yǎng)1,3,7 d的細(xì)胞增殖率如圖10所示。由圖10可知,7 d內(nèi)人包皮成纖維細(xì)胞都呈顯著性增加趨勢(shì),第一天S/ZC15縫合線細(xì)胞增殖率與空白對(duì)照組相比沒有顯著差異,第五天和第七天S/ZC15縫合線的增殖率為137.36%和388.48%,較空白組細(xì)胞增殖率分別下降17.84%和40.78%,這表明縫合線有很好的細(xì)胞相容性,有望在臨床上得到進(jìn)一步應(yīng)用。

圖10 人包皮成纖維細(xì)胞HFF-1與縫合線共培養(yǎng)增殖率Fig.10 Proliferation of the HFF-1 cells co-cultured with the sutures

3 結(jié) 論

(1)通過(guò)溶劑合成法成功制備了載藥MOF ZIF-8@Cur,結(jié)果顯示,ZIF-8@Cur的形貌規(guī)則,載藥量為8.519%,包封率為70.29%。

(2)通過(guò)編織工藝制備了2-0型真絲縫合線,經(jīng)多巴胺改性處理后,通過(guò)調(diào)控ZIF-8@Cur溶液的質(zhì)量濃度,探究不同質(zhì)量濃度ZIF-8@Cur溶液對(duì)真絲縫合線的化學(xué)結(jié)構(gòu)、表面形貌、力學(xué)性能和藥物上載量的影響,選出 ZIF-8@Cur涂層的最佳質(zhì)量濃度為15 mg/mL,涂層處理后真絲縫合線表面涂層均勻、力學(xué)性能良好。

(3)抗菌試驗(yàn)證明,制備的S/ZC15真絲縫合線對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌有良好的抗菌效果。細(xì)胞相容性試驗(yàn)結(jié)果顯示,S/ZC15真絲縫合線具有良好的生物相容性,在修復(fù)感染性傷口中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。