HS-SPME-GC-MS分析柴胡、白芍配伍前后揮發(fā)性組分變化規(guī)律

張心一,江漢美,成 立,劉 毅

湖北中醫(yī)藥大學藥學院 湖北省藥用植物研發(fā)中心,武漢430070

中藥藥對是組方用藥的最小單元,藥對的配伍主要遵循同氣相求、相輔相成、相反相成、相制為用的規(guī)律[1]。白芍養(yǎng)肝柔肝、柴胡疏肝解郁,二藥相合,共奏疏達肝氣,養(yǎng)血柔肝之功,白芍與柴胡配對,亦具有相反相成的配伍關系,白芍養(yǎng)血,防柴胡疏散太過而劫肝陰,柴胡和散,防白芍酸寒而肝氣結也。既得疏肝解郁,相須為伍,又相輔佐,取長補短,二藥相配形成逍遙散、四逆散、大柴胡湯、柴胡疏肝散等方。柴胡為傘科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根[2]。白芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根[2]。查閱相關文獻發(fā)現(xiàn),已有研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析柴胡、白芍揮發(fā)性成分[3-5],而到目前為止,還未有采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)聯(lián)用分析柴胡、白芍配伍前后揮發(fā)性成分的報道。HS-SPME應用廣泛[6],具有高效、便捷的特點。本研究采用HS-SPME-GC-MS技術,結合主成分分析(PCA)等數(shù)據(jù)分析方法,對柴胡和白芍的揮發(fā)性成分及其配伍前后揮發(fā)性組分的變化規(guī)律進行研究,為進一步深入探究此藥對的配伍機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柴胡(Radix Bupleurum,RB)和白芍(Radix Paeoniae Alba,RP)藥材由湖北中醫(yī)藥大學黃家湖醫(yī)院提供,經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學中藥鑒定為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)的干燥根及毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根。

手動固相微萃取(SPME)進樣裝置(德國IKA公司);ThermoFisher Trace 1310型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國ThermoFisher公司);頂空瓶(規(guī)格:15 mL);聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取纖維頭(規(guī)格:65 μm,美國Supelco公司);ALC-210.2型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 樣品處理

先將柴胡、白芍樣品置于冷凍干燥機中干燥,然后分別用打粉機粉碎,過16目篩備用。

1.3 GC-MS條件

GC條件:色譜柱為TG-1701MS毛細管柱;升溫程序:從50 ℃開始,保留2.5 min以10 ℃/min升溫至250 ℃;載氣:高純度He(99.999%);柱流速:1.0 mL/min;進樣口溫度:250 ℃。

MS條件:EI源;電子能量70 eV,溫度250 ℃。采用全掃描模式采集數(shù)據(jù),掃描范圍40～600。

1.4 萃取方法

精密稱取柴胡-白芍藥對混合粗粉0.8 g(柴胡、白芍粉末各0.4 g),置于15 mL頂空瓶中,插入裝有65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭的手動進樣器,在100 ℃下平衡10 min后,再壓縮手柄伸出萃取頭萃取15 min,取出,立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)解析3 min。單味藥材實驗條件同上。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量,并通過Mainlib質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對獲得的質(zhì)譜圖進行檢索,以鑒定各組分。以SPSS 21.0軟件對柴胡、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分及其相對百分含量進行主成分分析(PCA)。

2 結果

按上述HS-SPME和GC-MS條件分析柴胡、白芍配伍前后揮發(fā)性成分的變化,采用峰面積歸一化法,將數(shù)據(jù)導入安捷倫化學工作站進行處理,并計算各組分相對百分含量,在Mainlib質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中按各峰的質(zhì)譜圖進行檢索,查閱相關文獻初步鑒定出111種化合物,化學成分鑒定結果見表1,柴胡、白芍及藥對的總離子流圖見圖1。

圖1 柴胡、白芍及其藥對揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ionchromatogram of volatile components in RB,RP and RB-RP

表1 柴胡、白芍及柴胡-白芍藥對揮發(fā)性成分

2.1 柴胡、白芍及其藥對的揮發(fā)性成分分析結果

2.1.1 柴胡、白芍及其藥對的揮發(fā)性組分的定量分析

從柴胡藥材粉末分離鑒定出61個揮發(fā)性成分;從白芍藥材粉末分離出50個揮發(fā)性成分;柴胡-白芍藥對藥材粉末分離鑒定出61個揮發(fā)性成分;柴胡、白芍及其藥對鑒定出的揮發(fā)性成分含量分別占總揮發(fā)性成分含量的93.04%、92.14%和95.21%。

2.1.2 藥對與單味藥之間揮發(fā)性成分的比較與分析

在柴胡中鑒定出了61種揮發(fā)性成分,其中最主要的成分是(+)-β-柏木萜烯(30.41%)、異丁香烯(6.31%)、正十三烷(5.42%);在白芍中鑒定出了50種揮發(fā)性成分,其中最主要的成分是α-姜黃烯(10.17%)、草蒿腦(7.66%)、桃金娘烷醇(6.17%);在柴胡-白芍藥對中鑒定出了61種揮發(fā)性成分,其中最主要的成分是(+)-β-柏木萜烯(25.01%)、1,8,11,14-十七碳四烯(6.50%)、十五烷(5.59%)、α-姜黃烯(4.62%)。柴胡和藥對的共有成分為27個,主要為(+)-β-柏木萜烯、異丁香烯、冰草烯、叩巴烯等;白芍和藥對的共有成分為7個,主要為γ-古蕓烯、β-瑟林烯、1,8,11,14-十七碳四烯、1,8,11-十七碳三烯等;柴胡、白芍及藥對的共有成分為11個,主要為α-姜黃烯、β-紅沒藥烯、β-瑟林烯、氧化石竹烯等,結果見表1。

2.1.3 柴胡、白芍及其藥對揮發(fā)性成分種類和含量的差異

由表1得,揮發(fā)性成分主要分為烯類、酯類、酮類、醛類、酸類、醇類、烷烴類及其他類化合物。烯類成分在柴胡、白芍及其藥對揮發(fā)性成分相對百分含量中占比最高,其中柴胡揮發(fā)性成分中烯類成分占比為54.49%,白芍揮發(fā)性成分中烯類成分占比為58.95%,藥對揮發(fā)性成分中烯類成分占比為64.17%,三者揮發(fā)性成分種類和含量見表2。

表2 柴胡、白芍及藥對揮發(fā)性成分種類和相對含量的分析

2.2 柴胡、白芍及其藥對揮發(fā)性成分的PCA

由表1可知,柴胡、白芍及其藥對三者的揮發(fā)性成分含量數(shù)據(jù)較為分散,擬通過主成分分析(PCA)將離散的數(shù)據(jù)進行標準化處理。采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對3組樣品的111種揮發(fā)性成分含量進行PCA。特征值和貢獻率見表3,各成分的主成分特征向量及載荷矩陣見表4。從表3和表4可以看出,第一主成分的貢獻率為67.001%,它主要反映了醇類、酯類、烷烴類3類組分的變化信息,并且第一主成分與醇類化合物之間存在正相關,而與酯類化合物和烷烴之間存在負相關關系;第二主成分的貢獻率為32.999%,與酸類化合物存在正相關關系,與烯類化合物存在負相關關系,兩個主成分的累計貢獻率達到100.000%,較好地反映了樣本的總體信息。以F1和F2兩個新的綜合指標來代替原來的8類成分所表達的信息,綜合得分F=67.001%Y1+32.999%Y2,得到綜合得分值表5。PCA結果如圖2所示,單味藥材和藥對的綜合評分具有較大差異,柴胡-白芍藥對揮發(fā)性成分的得分明顯高于單味藥材。綜合得分越高,表明揮發(fā)性成分含量越多,因此可以認為主成分在該組總揮發(fā)性成分含量的比重也越高。從揮發(fā)性成分的角度來看,柴胡-白芍藥對配伍后具有最豐富的揮發(fā)性成分。

圖2 柴胡、白芍及其藥對PCA分析得分圖Fig.2 PCA analysis scores of RB,RP and RB-RP

表3 主成分分析的特征值及其貢獻率

表4 主成分的特征向量和載荷矩陣

表5 柴胡、白芍及其藥對揮發(fā)性成分主成分得分和綜合得分

3 討論與結論

本研究采用HS-SPME-GC-MS法對柴胡、白芍及柴胡-白芍藥對的揮發(fā)性成分進行測定分析,柴胡-白芍藥對特有的揮發(fā)性組分為16個,與柴胡有27個共有揮發(fā)性組分,與白芍有7個共有揮發(fā)性組分。

將藥對與單味藥的揮發(fā)性成分含量進行對比可得,藥對揮發(fā)性成分含量較單味藥有所提高的成分有15種,包括α-姜黃烯、β-紅沒藥烯、氧化石竹烯、紫穗槐二烯、(+)-β-柏木萜烯等。藥對中揮發(fā)性成分含量較單味藥有所降低的成分有15種,包括十二烷、苯甲醇、十六烷、十九烷等。同時,藥對新增了16種新的揮發(fā)性成分,包括馬鞭烯酮、反式石竹烯、α-蓽澄茄油烯、瓦倫亞烯、前列腺素E1等。與單味藥相比,藥對中含量增加的(+)-β-柏木萜烯是側(cè)柏精油的主要成分[7],具有抗菌消炎、收斂、利尿、柔軟、化痰、殺霉菌等作用;α-姜黃烯具有比較強的抗菌活性[8];β-紅沒藥烯對多種乳腺癌細胞有抑制作用[9];氧化石竹烯具有平喘、抗腫瘤、抗菌和鎮(zhèn)咳作用[10]。并且,二藥配伍后新增加的成分如反式石竹烯、α-蓽澄茄油烯、前列腺素E1等,反式石竹烯具有一定的平喘、抗菌作用[14],產(chǎn)生的α-蓽澄茄油烯具有良好的抑菌作用[15],前列腺素E1具有良好的抗炎作用[16],與柴胡-白芍配伍的臨床應用相符。此外,藥對中含量降低的成分如十二烷具有低毒性[11];苯甲醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒性[12];十六烷蒸氣會對人體上呼吸道、眼和皮膚產(chǎn)生刺激性[13]等,這些有害成分在二藥配伍后含量均有所降低。從揮發(fā)性成分的角度出發(fā)可得柴胡-白芍配伍后有減毒增效的作用,如經(jīng)典中藥制劑安乳消痛丸,柴胡和白芍作為其中主要成分,二藥合用,既能疏肝解郁以治肝用之不達,又能柔肝益陰以補肝體,有養(yǎng)血斂陰,緩解疼痛之功效[17]。

有研究[18]采用索氏、微波、水蒸餾、超臨界CO2-水蒸氣蒸餾提取法提取柴胡揮發(fā)油并定性化學成分,共分析鑒定其所得揮發(fā)性成分分別為34、21、25、19種,本研究采取HS-SPME分離定性的柴胡揮發(fā)性成分為61種,采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術可提高藥物揮發(fā)性成分的提取率,與文獻中所用的方法相比,藥物的出峰數(shù)和揮發(fā)性物質(zhì)含量更高,表明頂空固相微萃取萃取藥物揮發(fā)性組分具有高效靈敏的特性。

綜上所述,柴胡、白芍配伍使用在臨床上運用廣泛。但鮮有柴胡、白芍及其藥對揮發(fā)性成分的研究。本實驗應用HS-SPME-GC-MS技術測定柴胡、白芍以及柴胡-白芍藥對揮發(fā)性成分,通過面積歸一法確定各成分百分含量,從揮發(fā)性成分角度出發(fā),分析柴胡-白芍藥對配伍前后化學成分的變化,根據(jù)配伍規(guī)律,探討柴胡-白芍藥對的配伍作用,以期進一步挖掘其療效機理。