海洋真菌Aspergillus jensenii SS5中化學成分研究

胡靖瑤,袁瑞瑛*,王廣明,蔡詩琪,周明琦,王富乾,蔡由生

1西藏大學醫(yī)學院,拉薩 850012;2武漢大學藥學院,武漢 430071;3武漢市第一醫(yī)院藥學部,武漢 430022

海洋是地球上最大的表面資源,其中存在著巨大的生物多樣性,是天然產物的重要來源之一。尤其是其中多種多樣的海洋微生物,在很大程度上還未被開發(fā)。海洋真菌在極端的生存環(huán)境下,有著獨特的代謝方式與途徑,生存繁殖方式、適應機制,從而產生結構新穎、具有多種生物活性的次級代謝產物,引起國內外科學家的密切關注[1,2],成為當前最具開發(fā)前景的海洋天然產物新藥源,也是研發(fā)新型先導化合物的熱點之一[3]。

曲霉屬廣泛分布于陸地和海洋環(huán)境中,海洋曲霉已證實具有產生大量結構多樣次級代謝物的能力。1992年Numata等[4]報道了首個海洋曲霉來源的天然產物,揭開了海洋曲霉次級代謝產物研究的篇章。截至2018年,研究報道的海洋曲霉來源的新天然產物數量已經超過了979個,包括聚酮類、生物堿類、萜類、大環(huán)內酯、酰胺類、甾體類、鹵代物類、肽類等多種類型,這一系列海洋真菌次級代謝產物具有抗腫瘤、抗病毒、清除自由基、抗氧化、神經保護、抗炎、抗心腦血管等疾病、抑菌和抗蟲等多種生物活性[5,6]。例如,從海洋真菌Aspergillusniger發(fā)酵產物中提取得到了化合物aurasperone H,對人急性早幼粒白血病細胞HL-60具有顯著的細胞毒性[7]。海洋真菌AspergillusjenseniiLW128發(fā)酵粗提取物中獲得的二苯醚類化合物diorcinol D具有良好的抗菌活性[8]。有必要進一步對罕見的海洋曲霉屬真菌進行深入研究,充分發(fā)掘其生物合成潛力,以獲得更多可以開發(fā)為前體藥物的天然產物。因此本實驗以一種從中國南海海洋沉積物中分離獲得海洋真菌AspergillusjenseniiSS5為研究對象,對其發(fā)酵產物進行化學成分鑒定,以期獲得具有顯著細胞毒活性的次級代謝產物,為小分子癌癥治療藥物設計提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AVANCE400和600超導核磁共振儀;LC3000高效液相色譜儀(瑞億斯公司);SB-2000旋轉蒸發(fā)儀器(上海艾朗儀器有限公司)。提取分離所用分析純試劑丙酮、醋酸乙酯、甲醇、石油醚等(湖北申試化工科技有限公司);色譜級甲醇(湖北弗頓科學技術有限公司)。人肺癌A549和人肝癌Bel-7402均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC);5-氟尿嘧啶(5-FU)(純度≥99%,批號F6627,Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司)。

1.2 菌種來源

本實驗所使用的真菌菌株是從中國南海海洋沉積物中分離獲得,編號SS5,菌株由武漢大學藥學院洪葵教授課題組鑒定。根據測序結果構建系統(tǒng)發(fā)育樹,菌株SS5與AspergillusjenseniiNRRL 58600親緣關系最近,比對結果中其序列相似度為99.28%,結合形態(tài)學分析,初步判斷菌株SS5為曲霉屬真菌A.jensenii。

1.3 菌種的發(fā)酵與分離提取

將26℃下靜置培養(yǎng)30 d后的液體發(fā)酵的菌絲體破碎,丙酮超聲提取3次,每次20 min,濃縮提取液,和培養(yǎng)液混合,濃縮后用醋酸乙酯萃取3次,濃縮得到浸膏(32.0 g)。浸膏經正相硅膠柱色譜分離,石油醚-醋酸乙酯(20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶2)梯度洗脫,得到9個部分A～I。組分B(1.5 g)用正相硅膠柱色譜分離,石油醚-醋酸乙酯(5∶1、2∶1、1∶2)梯度洗脫后,得到4組分B1～B4。B3(298 mg)組分進一步采用Sephadex LH-20柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)分離,得到7個組分B3a～B3g。B3d(34 mg)通過半制備HPLC分離純化(60%甲醇,體積流量3 mL/min,254 nm),得到化合物1(6 mg,tR= 15.6 min)、2(8 mg,tR= 26.1 min)。組分E(3.1 g)經正相硅膠柱色譜分離,用二氯甲烷-甲醇(50∶1→1∶1)梯度洗脫后,得到6個組分,即E1～E6。E2(184 mg)經Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)分離得到E2a(31 mg)、E2b(22 mg)、E2c(39 mg)、E2d(19 mg)、E2e(61 mg)。E2b經半制備HPLC分離(40%～80%甲醇,體積流量3 mL/min,254 nm)得到化合物3(6 mg,tR= 15.3 min)。G部分(8.3 g)經Sephadex LH-20柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)分離,得到7個組分G1～G7。G1(135 mg)經正相硅膠柱色譜分離,用石油醚-醋酸乙酯(10∶1、5∶1、2∶1、1∶1)梯度洗脫后,得到6個組分G1a～G1f。G1c(15 mg)經半制備型HPLC分離(55%甲醇,體積流量3 mL/min,254 nm)得到化合物4(2 mg,tR=25.6 min)。

1.4 化合物活性測試

采用SRB法[9],測試了化合物1～4化合物對人肺癌A549和人肝癌Bel-7402兩種細胞的生長抑制作用,5-氟尿嘧啶(5-FU)為陽性對照,選用對數生長期細胞,胰酶消化后用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞濃度至2×104個細胞/mL,按照每孔190 μL細胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。藥物處理孔加入10 μL樣品溶液(終質量濃度化合物為5 μg/mL,混合物為50 μg/mL),陽性藥物孔加入終質量濃度為5 μg/mL的5-FU進行處理;對照孔加入含等體積溶媒的培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)3 d。棄去培養(yǎng)基,加入100 μL 4 ℃預冷的50% 三氯乙酸(TCA)固定細胞。先靜置5 min,然后再移至4 ℃放置1 h。倒掉固定液,蒸餾水洗滌5次去除TCA,空氣干燥1 h。每孔加入0.4% SRB溶液80 μL,室溫染色30 min。棄染液,1% 醋酸洗滌5次充分去除未結合的SRB,空氣干燥。加入150 μL 10 mmol/L Tris-base(pH 10.5)溶解,微型振蕩器上振蕩5 min。M5酶標儀測定OD510 nm值。根據公式:腫瘤細胞生長抑制率=(OD對照-OD藥物)/(OD對照-OD空白)×100%計算各化合物的細胞抑制率。

2 結果

2.1 結構鑒定

圖1 化合物1的X射線晶體結構Fig.1 X-ray crystal structure of compound 1

化合物1～4的化學結構如圖2。

圖2 化合物1～4的化學結構Fig.2 Chemical structures of compounds 1-4

2.2 腫瘤細胞毒活性

活性測試結果表明(見表1),海洋真菌A.jenseniiSS5中的化合物4對A549人肺癌細胞株和Bel-7402人肝癌細胞株均有較好的抑制作用,在5 μg/mL濃度下,初篩抑制率分別為41.23%、42.23%(陽性對照5-氟尿嘧啶對兩株腫瘤細胞抑制率分別為47.45%、72.99%);化合物2對A549人肺癌細胞株的初篩抑制率為47.34%?；衔?和3在初篩濃度下對這兩種細胞無明顯細胞毒活性。

表1 化合物1～4的癌細胞生長抑制活性

3 討論與結論

從海洋真菌A.jenseniiSS5的粗提取物中分離得到四個化合物:epigriseofulvin(1)、sterigmatocystin(2)、brevianamide M(3)、meleagrin(4),其中化合物1～3是首次從海洋A.jensenii中分離得到,極大地豐富了曲霉屬真菌A.jensenii次生代謝產物結構的多樣性。大量的研究結果已經證明,海洋曲霉屬真菌是多種具有豐富生物活性的次級代謝產物的重要來源,許多海洋曲霉來源的新天然產物具有較好的抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性,因此本文對4種化合物的細胞毒性進行了測試,結果表明化合物4可以有效抑制人肺癌A549細胞和人肝癌Bel-7402細胞,化合物2對A549人肺癌細胞株有較好抑制作用,這兩種化合物有望作為抗癌前體藥物進行深入研究,本研究也為天然活性化合物的開發(fā)提供了一定的理論依據。