白及中的化學(xué)成分鑒定及對(duì)金葡菌的抑制機(jī)理研究

羅 芳,俞 昳,張琳晗,陸梅芬,陳小明

湖南科技學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院,永州 425199

抗生素被認(rèn)為是20世紀(jì)最“神奇藥物”[1]。然而,由于人們?yōu)E用抗生素,導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[2]。預(yù)計(jì)到2050年,全球因細(xì)菌感染給人類(lèi)帶來(lái)的財(cái)產(chǎn)損失將達(dá)到100萬(wàn)億美元[3]。金黃色葡萄球菌是一種常見(jiàn)的食源性致病細(xì)菌,能導(dǎo)致呼吸道、消化道和泌尿道感染[4]。目前,臨床使用的抗菌藥物存在結(jié)構(gòu)類(lèi)型受限,毒副作用較多和耐藥性現(xiàn)象增多等問(wèn)題[5-7]。因此,迫切需要人們開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物。

天然產(chǎn)物仍然被認(rèn)為是新藥物發(fā)現(xiàn)的資源寶庫(kù)[8]。據(jù)美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)披露,超過(guò)一半的臨床藥物源自天然產(chǎn)品或其合成衍生物,大約200種微生物來(lái)源的天然抗生素被直接用作藥物[9]。

白及又名風(fēng)信子蘭花,風(fēng)信子白及,烏蘭,其塊莖常被作為藥用部位。其味甘、苦、澀,性偏寒,具有收斂止血,消腫生肌的功效[10]。常用于治療咳血吐血,外傷出血,瘡瘍腫毒,皮膚皸裂,潰瘍病出血[11]。其主要成分包括多糖類(lèi)、菲類(lèi)、菲醌類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)、三萜類(lèi)和木脂素及有機(jī)酸[12]。藥理研究表明,白及具有抗炎[13]、抗纖維化[14]、抗腫瘤[15]、調(diào)節(jié)免疫[16]等多種生物活性,但關(guān)于其抑菌機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象,考察了提取液與單體化合物的抑菌活性差異,通過(guò)測(cè)定菌液中堿性磷酸酶(AKP)、DNA泄漏程度以及細(xì)菌電鏡形貌,考察化合物對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜壁的影響,為白及的綜合利用以及開(kāi)發(fā)新的抑菌劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Bruker AVANCE Ⅲ 400型核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司);PuriSmart-200型高效液相制備色譜儀(上?？普苌萍加邢薰?;SL-3506型酶標(biāo)儀(中國(guó)Reotai公司); SU5000掃描電鏡(日本Hitachi公司);GFM-600倒置熒光顯微鏡(上海光密儀器公司)。

1.2 藥品與試劑

白及購(gòu)買(mǎi)自貴州興義,經(jīng)湖南科技學(xué)院制藥系姜紅宇副教授鑒定為蘭科植物白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.的干燥塊莖,標(biāo)本(BS20211009)存貯于湖南科技學(xué)院制藥系中藥標(biāo)本室。

金黃色葡萄球菌(ATCC29213)(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心);蛋白胨(批號(hào):20220301)、酵母提取物(批號(hào):20220603)和瓊脂粉(批號(hào):20220313)(生化試劑,上海泰坦科技有限公司);堿性磷酸酶試劑盒(批號(hào):2022421,南京建成生物科技有限公司);碘化丙啶PI、甲醇、乙醇和丙酮(分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司);硅膠(100～200和200～300目)和薄層色譜(TLC)板(青島海洋化工廠);SephadexLH-20凝膠和5C18-MS-II制備柱(日本,Cosmosil有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取與分離

取干燥的白及藥材0.5 kg置于圓底燒瓶中,加入1.0 kg乙醇(75%)回流提取2次,每次1 h,將提取液合并后減壓濃縮得浸膏250.5 g。將浸膏與硅膠(100～200目)混勻并裝入層析柱,依次用石油醚、乙酸乙酯、丙酮洗脫固定相,收集不同溶劑洗脫液,濃縮后得到石油醚部位(50.1 g)、乙酸乙酯部位(152.4 g)和丙酮部位(18.0 g)浸膏。乙酸乙酯浸膏經(jīng)二氯甲烷/甲醇體系梯度洗脫(100∶1→1∶1)得到5個(gè)洗脫組分(Fr.A～E)。洗脫組分Fr.B(3.6 g)經(jīng)石油醚/乙酸乙酯/甲酸(20∶1∶0.5、10∶1∶0.5和1∶1∶0.5)柱層析純化,得到化合物1(6.1 mg)、2(4.5 mg)和3(4.8 mg)。洗脫組分Fr.C(10.2 g)經(jīng)石油醚/丙酮體系梯度洗脫(20∶1→1∶1)得到4個(gè)子組分(Fr.C1～Fr.C4)。洗脫組分Fr.C2經(jīng)石油醚/乙酸乙酯體系柱層析純化(10∶1→4∶1),得到化合物4(2.6 mg)和5(2.7 mg)。洗脫組分Fr.C4通過(guò)半制備型HPLC(CH3CN∶H2O=55∶45,1.5 mL/min)純化,得到化合物6(1.9 mg,tR=17.5 min)和7(4.8 mg,tR=30.6 min)。洗脫組分Fr.D(8.4 g)通過(guò)半制備型HPLC純化(CH3OH∶H2O=45∶55,1.5 mL/min)獲得化合物8(2.8 mg,tR=8.1 min)和9(2.4 mg,tR=12.5 min),洗脫組分Fr.E(2.4 g)經(jīng)ODS柱(CH3OH∶H2O=50∶50)純化,得到化合物10(5.2 mg)。

1.3.2 抗菌活性評(píng)價(jià)及機(jī)理

1.3.2.1 抗菌活性的測(cè)定

使用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定白及中各提取液和單體化合物對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。用移液槍向96孔板中分別移取150 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.6)金黃色葡萄球菌液,和50 μL不同濃度的單體化合物溶液(0.01～8.0 mg/mL),在37 ℃下孵育24 h,用酶標(biāo)儀在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)量細(xì)菌溶液的吸光度,吸光度小于0.1時(shí)為最小抑菌濃度。然后,從化合物濃度大于最小抑菌濃度的96孔板中各取100 μL細(xì)菌懸浮液,涂布在新鮮LB瓊脂平板上,于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h,未出現(xiàn)菌落或每個(gè)平板少于5個(gè)菌落的藥物濃度被定義為最低殺菌劑濃度(MBC)。阿莫西林作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2.2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

構(gòu)建生長(zhǎng)曲線分析化合物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力。將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移到含有不同濃度藥物的LB液體培養(yǎng)基中,使最終藥物濃度分別為0.125、0.25、0.5和1.0倍的最小抑菌濃度(MIC)。在37 ℃下孵育,每2 h測(cè)量OD600的光密度值,以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.2.3 藥物對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的破壞(AKP法)

將化合物添加到菌液中,使得最終藥物濃度為MBC和MIC,在37 ℃下孵育。依次在0、2、4、6和8 h取樣1 mL菌液,離心3 min,收集上清液,根據(jù)試劑盒說(shuō)明,計(jì)算樣品中的AKP活性,陰性組不含藥物。

1.3.2.4 熒光探針(PI)檢測(cè)細(xì)胞膜損傷

取5mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌溶液與化合物溶液混合,使得最終藥物濃度為MBC,并在37 ℃下孵育4 h(無(wú)藥物處理作為陰性對(duì)照),離心后,將細(xì)菌與PI溶液混合,并在暗室中反應(yīng)15 min,然后在倒置熒光顯微鏡上觀察菌液,根據(jù)熒光的強(qiáng)弱判斷細(xì)菌中DNA的泄漏量。

1.3.2.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌分為兩組,一組加入濃度為MBC的化合物,一組加入去離子水作為空白對(duì)照,在37 ℃下孵育2 h,然后在4 ℃下用2.5%戊二醛溶液固定8 h。離心收集細(xì)菌,用30%、50%、75%和100%乙醇依次洗滌,將細(xì)菌脫水。最后,將細(xì)菌樣品冷凍干燥12 h,然后加載到導(dǎo)電膠上。用金噴涂樣品后,通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1灰色固體粉末;分子式為C22H22O4;1H NMR(500 MHz,(CD3)2CO)δ:8.19(1H,s,12-OH),8.07(1H,s,4-OH),7.95(1H,s,4′-OH),7.83(1H,s,H-14),6.80～6.81(2H,d,J= 5.0 Hz,H-2′,H-6′),6.56(1H,s,H-11),6.55(1H,s,H-13),6.53～6.54(2H,d,J= 5.0 Hz,H-3′,H-5′),6.44(1H,s,H-3),3.81(2H,s,H-7′),3.63(3H,s,2-OMe),2.47～2.50(2H,m,H-8),2.40～2.43(2H,m,H-7);13C NMR(125 MHz,(CD3)2CO)δ:112.5(C-1),153.2(C-2),98.2(C-3),156.5(C-4),117.8(C-5),139.3(C-6),29.6(C-7),26.2(C-8),138.8(C-9),125.3(C-10),113.7(C-11),155.1(C-12),114.9(C-13),128.8(C-14),54.9(2-OMe),132.3(C-1′),129.3(C-2′,C-6′),115.0(C-3′,C-5′),155.2(C-4′),29.6(C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物1為shancidin。

化合物2白色粉末;分子式為C15H14O3;1H NMR(500 MHz,(CD3)2CO)δ:8.25(1H,s,4-OH),δ:8.11(1H,s,12-OH),8.05(1H,s,H-14),6.70(1H,s,H-11),6.68(1H,s,H-13),6.47(1H,s,H-5),6.39(1H,s,H-3),3.83(3H,s,2-OMe),2.64～2.66(4H,s,H-7,H-8);13C NMR(125 MHz,(CD3)2CO)δ:116.3(C-1),158.7(C-2),99.1(C-3),157.3(C-4),108.2(C-5),140.0(C-6),31.4(C-7),30.8(C-8),141.3(C-9),125.7(C-10),114.9(C-11),156.0(C-12),113.5(C-13),129.9(C-14),55.7(2-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物2為coelonin。

化合物3白色粉末;分子式為C15H14O3;1H NMR(500 MHz,(CD3)2CO)δ:8.55(1H,s,12-OH),8.21(1H,s,2-OH),8.12(1H,s,H-14),6.70(1H,s,H-11),6.68(1H,s,H-13),6.43(1H,s,H-5),6.38(1H,s,H-3),3.74(3H,s,4-OMe),2.66～2.70(4H,m,H-7,H-8);13C NMR(125 MHz,(CD3)2CO)δ:114.1(C-1),155.2(C-2),100.7(C-3),158.4(C-4),105.1(C-5),138.9(C-6),29.8(C-7),30.6(C-8),140.5(C-9),125.0(C-10),114.9(C-11),155.0(C-12),112.6(C-13),129.0(C-14),54.4(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物3為lusianthridin。

化合物4白色粉末;分子式為C16H16O3;1H NMR(500 MHz,CD3Cl)δ:8.11～8.13(1H,d,J= 10.0 Hz,H-14),6.70～6.72(2H,d,J= 10.0 Hz,H-11,H-13),6.45(1H,d,J= 10.0 Hz,H-5),6.42(1H,s,H-3),3.87(3H,s,4-OMe),3.84(3H,s,2-OMe),2.73～2.74(4H,m,H-7,H-8);13C NMR(125 MHz,CD3Cl)δ:116.2(C-1),158.9(C-2),97.5(C-3),157.7(C-4),104.6(C-5),140.1(C-6),30.7(C-7),29.7(C-8),140.7(C-9),126.1(C-10),114.9(C-11),151.5(C-12),113.1(C-133),129.7(C-14),55.5(2-OMe),55.3(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物4為orchinol。

化合物5白色粉末;分子式為C22H20O4;1H NMR(500 MHz,(CD3)2CO)δ:8.24(1H,s,2-OH),8.09(1H,s,12-OH),8.00～8.02(1H,d,J= 10.0 Hz,4′-OH),7.97(1H,s,H-14),7.00～7.01(2H,d,J= 5.0 Hz,H-2′,H-6′),6.70～6.72(2H,d,J= 10.0 Hz,H-11,H-13),6.66～6.68(2H,m,H-3′,H-5′),6.61(1H,s,H-3),3.99(2H,s,H-7′),3.81(3H,s,4-OMe),2.59～2.62(2H,m,H-8),2.51～2.53(2H,m,H-7);13C NMR(125 MHz,(CD3)2CO)δ:116.2(C-1),154.3(C-2),98.2(C-3),155.9(C-4),117.2(C-5),139.5(C-6),29.6(C-7),26.2(C-8),138.9(C-9),125.1(C-10),112.5(C-11),155.1(C-12),113.6(C-13),129.3(C-14),54.8(4-OMe),132.2(C-1′),128.9(C-2′,C-6′),114.9(C-3′,C-5′),155.2(C-4′),29.8(C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物5為isoshancidin。

化合物6灰白色粉末;分子式為C30H26O6;1H NMR(500 MHz,(CD3)2CO)δ:8.22(2H,s,12-OH,12′-OH),8.08～8.10(2H,d,J= 10.0 Hz,3-OH,3′-OH),7.48(2H,s,H-1,H-1′),6.68～6.70(4H,d,J= 10.0 Hz,H-2,H-2′,H-4,H-4′),6.60(2H,s,H-13,H-13′),3.87(6H,s,14-OMe,14′-OMe),2.56～2.59(4H,m,H-8,H-8′),2.31～2.34(4H,m,H-7,H-7′);13C NMR(125 MHz,(CD3)2CO)δ:129.2(C-1,C-1′),112.5(C-2,C-2′),155.2(C-3,C-3′),113.6(C-4,C-4′),140.3(C-5,C-5′),128.2(C-6,C-6′),26.9(C-7,C-7′),29.6(C-8,C-8′),139.3(C-9,C-9′),113.8(C-10,C-10′),116.1(C-11,C-11′),154.7(C-12,C-12′),98.1(C-13,C-13′),157.3(C-14,C-14′),54.7(14-OMe,14′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物6為blestriareneA。

化合物7淡黃色粉末;分子式為C9H8O3;1H NMR(500 MHz,(CD3)2CO)δ:7.60～7.63(1H,d,J= 15.0 Hz,H-7),7.54～7.56(2H,d,J= 5.0,10.0 Hz,H-2,H-4),6.89～6.91(2H,d,J= 5.0,10.0 Hz,H-1,H-5),6.32～6.35(1H,t,J= 10.0 Hz,H-8);13C NMR(125 MHz,(CD3)2CO)δ:115.8(C-1,C-5),130.3(C-2,C-4),126.2(C-3),159.6(C-6),144.6(C-7),114.9(C-8),167.3(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物7為(E)-3-(4-hydroxyphenyl)acrylic acid。

化合物8白色粉末;分子式為C9H10O2;1H NMR(500 MHz,(CD3)2CO)δ:7.24～7.29(4H,H-1,H-2,H-4,H-5),7.16～7.20(1H,d,J= 10.0 Hz,H-6),2.91～2.93(2H,d,J= 10.0 Hz,H-8),2.61～2.63(2H,d,J= 10.0 Hz,H-7);13C NMR(125 MHz,(CD3)2CO)δ:128.3(C-1,C-5),128.4(C-2,C-4),141.1(C-3),125.9(C-6),30.6(C-7),35.0(C-8),173.1(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物8為3-phenylpropanoic acid。

化合物9無(wú)色油狀液體;分子式為C10H12O3;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.14～7.16(2H,d,J= 10.0Hz,H-1,H-5),6.79～6.77(2H,d,J= 10.0Hz,H-2,H-4),4.12～4.16(2H,t,J= 5.0,10.0Hz,H-10),3.54(2H,s,H-7),1.23～1.26(3H,t,J= 10.0Hz,H-11);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:130.5(C-1,C-5),115.4(C-2,C-4),163.3(C-3),126.4(C-6),60.8(C-7),172.0(C-8),40.5(C-10),14.2(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物9為ethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate。

化合物10白色油狀固體;分子式為C12H16O2;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.06～7.08(2H,d,J= 10.0 Hz,H-1,H-5),6.74～6.76(2H,d,J= 10.0 Hz,H-2,H-4),4.1～4.14(2H,t,J= 10.0 Hz,H-9),2.86～2.89(2H,t,J= 5.0,10.0 Hz,H-7),2.56～2.59(2H,t,J= 5.0,10.0 Hz,H-11),1.22～1.25(6H,t,J= 10.0 Hz,H-10,H-12);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:129.5(C-1,C-5),115.2(C-2,C-4),158.5(C-3),125.1(C-6),60.4(C-7),199.9(C-8),36.3(C-9),14.2(C-10),30.2(C-11),14.2(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物10為ethyl 2-(4-ethylphenyl) acetate。

化合物1～10的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-10

2.2 抗菌活性評(píng)價(jià)及機(jī)理

2.2.1 抑菌活性和最低抑菌濃度測(cè)定

通過(guò)測(cè)試不同提取物部位抑菌活性,發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位抑菌效果最好(MIC:2.0 mg/mL)。所測(cè)試單體化合物對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度范圍為10～250 μg/mL,其中化合物6抑菌效果最強(qiáng)(MIC:10 μg/mL,MBC:20 μg/mL)。結(jié)果如表1所示。

表1 白及中不同極性部位及單體化合物的抗S.aureus活性

2.2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由圖2可知,12 h后細(xì)菌大量繁殖,不同濃度化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用,且呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。給藥組化合物6對(duì)細(xì)菌的抑制藥效時(shí)間與陽(yáng)性對(duì)照組(阿莫西林0.8 μg/mL)相當(dāng)。

圖2 化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌生存能力的影響Fig.2 Effect of compound 6 on the survivability of

2.2.3 對(duì)細(xì)胞壁完整性的影響

堿性磷酸酶(AKP)存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間,其含量高低可作為細(xì)菌細(xì)胞壁破裂程度的指標(biāo)。由圖3可知,化合物6作用于金黃色葡萄球菌后,陰性對(duì)照組中檢測(cè)到微量AKP,而給藥組中AKP的含量顯著增加,這表明化合物6對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁造成損傷。在6 h左右,化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌的破壞達(dá)到最大值(AKP的含量幾乎不變)。此外,化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的破壞效果與陽(yáng)性對(duì)照組幾乎相當(dāng)。

圖3 給藥后金黃色葡萄球菌中AKP的泄漏量Fig.3 Leakage of AKP in S.aureus after drug 注:與陰性對(duì)照組相比,***P<0.001。Compared with control of negative group, ***P<0.001.

2.2.4 對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響

通過(guò)檢測(cè)DNA與PI探針結(jié)合的熒光強(qiáng)度來(lái)反映化合物對(duì)細(xì)胞膜損傷強(qiáng)弱(見(jiàn)圖4)。在熒光顯微鏡下,與陰性對(duì)照組(見(jiàn)圖4a)相比,濃度為MBC的化合物6給藥組(見(jiàn)圖4b)顯示出多且強(qiáng)的紅色熒光,表明給藥組導(dǎo)致了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)損傷,造成細(xì)菌中DNA的泄漏。

圖4 藥物作用于金黃色葡萄球菌的熒光圖像(1 000×)Fig.4 Fluorescence image of drug action on S.aureus(1 000×)注:a為陰性對(duì)照組;b為MBC濃度化合物6。(a) Normal group;(b) Compound 6 (MBC).

2.2.5 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

細(xì)菌形態(tài)如圖5所示。與正常金黃色葡萄球菌(見(jiàn)圖5a)相比,經(jīng)濃度為MBC的化合物6給藥2 h后,細(xì)菌細(xì)胞膜輪廓被極大破壞,出現(xiàn)細(xì)胞碎片和內(nèi)容泄漏物(見(jiàn)圖5b),進(jìn)一步證實(shí)了化合物6抑制金黃色葡萄球菌主要是破壞其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。

圖5 藥物作用于金黃色葡萄球菌掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.5 SEM image of drug action on S.aureus注:a為正常組;b為MBC濃度的化合物6。Note:(a) Normal group;(b) Compound 6 (MBC).

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以抑菌活性為導(dǎo)向,采用色譜分離技術(shù)對(duì)中藥白及的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化,共分離鑒定了10個(gè)化合物(1～10),包括菲類(lèi)化合物6個(gè)(1～6)和香豆酸類(lèi)似物4個(gè)(7～10)。首次在白及屬植物中發(fā)現(xiàn)了香豆酸類(lèi)似物的存在,對(duì)蘭科白及屬植物化學(xué)成分豐富具有重要的指導(dǎo)意義。

在化合物抑菌機(jī)制的探究中,首先篩選了提取物與單體化合物的抑菌活性,測(cè)試結(jié)果顯示所供試化合物中,化合物6對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性最好(MIC 0.01mg/mL),抑菌效果呈劑量依賴(lài)性。SEM結(jié)果顯示該化合物對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁與膜的破壞并造成胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏。此外,AKP酶的含量變化和PI探針的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步證明了化合物6對(duì)細(xì)菌膜的損傷。在臨床使用中,白及提取物能夠加快傷口的愈合并防治感染的產(chǎn)生,這提示白及藥材具有抗菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能與化合物6等菲類(lèi)衍生物相關(guān)。

從結(jié)構(gòu)類(lèi)型來(lái)看,菲類(lèi)化合物是一種結(jié)構(gòu)完全異于市售抗生素(β-內(nèi)酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、喹諾酮類(lèi))的天然產(chǎn)物,在此項(xiàng)研究中,菲類(lèi)化合物都具有良好的抗菌效果,這對(duì)現(xiàn)行抗菌藥物的豐富有著啟示作用,開(kāi)發(fā)出新的菲類(lèi)抗菌劑有望解決耐藥菌的產(chǎn)生。文獻(xiàn)報(bào)道,即使是同類(lèi)型的菲類(lèi)化合物也會(huì)產(chǎn)生不同的抗菌機(jī)制,如blestriacin主要是通過(guò)破壞細(xì)菌膜電位和膜完整性來(lái)抑制葡萄球菌的生長(zhǎng)[24],aristoloxazine C通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞壁降解和消融來(lái)抑制青枯菌的生長(zhǎng)[25]。從結(jié)構(gòu)上看,菲類(lèi)容易在生物體類(lèi)轉(zhuǎn)化為醌,導(dǎo)致半醌自由基的產(chǎn)生而形成抑菌活性[26]。這提示我們對(duì)菲類(lèi)化合物其抑菌機(jī)制進(jìn)一步深入研究很有必要。總之,我們的研究初步證實(shí)了菲類(lèi)通過(guò)破壞細(xì)菌膜的抑菌機(jī)制,為白及抗菌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。