草果果實(shí)的化學(xué)成分及其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

呂福杰,路繼剛,范在舉,鄧愛霞

1聊城市中醫(yī)醫(yī)院;2聊城大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,聊城 252000

草果Amomumtsao-koCrevost &Lemarie為姜科豆蔻屬多年生草本植物,主要分布于中國云南、廣西、貴州等省。果實(shí)入藥,具有燥濕健脾,除痰截瘧的功能;也可作為調(diào)味香料,提取芳香油,是一類藥食兩用的品種[1]。作為國內(nèi)較為常見的藥食同源品種,草果的化學(xué)成分及藥理作用得到了較為廣泛的研究:化學(xué)成分方面,除去揮發(fā)油類成分外,主要包括黃酮類[2]、酚類[3]、二苯基庚烷類成分[4]等,其中黃酮類化合物多以抗炎及抗氧化活性、酚類化合物多以抗氧化活性、二苯基庚烷類化合物多以抗腫瘤及抑制α-葡萄糖苷酶活性被廣泛報(bào)道[5]。

糖尿病是一種以高血糖為特征,具有多種并發(fā)癥的代謝性疾病,近年來已成為僅次于心腦血管疾病和癌癥的第三位“健康殺手”。α-葡萄糖苷酶抑制劑可以通過降低餐后血糖峰值,控制糖尿病的發(fā)展尤其是并發(fā)癥的發(fā)生,是一種有廣闊應(yīng)用前景的糖尿病治療藥物。阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇是目前臨床應(yīng)用最廣泛的α-葡萄糖苷酶抑制劑,但價(jià)格昂貴,具有消化道障礙、低血糖導(dǎo)致休克等副作用,而且對(duì)糖尿病并發(fā)癥不能起到有效的治療,發(fā)掘新型α-葡萄糖苷酶抑制劑有著重要意義。研究表明草果的干粉及提取物具有降血糖功能及抑制α-葡萄糖苷酶相關(guān)活性[6,7],但并無其中單體成分對(duì)降糖的相關(guān)研究。本研究通過對(duì)草果進(jìn)行系統(tǒng)的提取分離,發(fā)現(xiàn)其中單體成分以豐富該物種化學(xué)成分多樣性,并挖掘其中具有抑制α-葡萄糖苷酶的化合物,有望為傳統(tǒng)中藥的臨床用途提供新思路。

2 材料與方法

1.1 儀器與材料

Autopol I自動(dòng)旋光儀(美國Rudolph Research Analytical公司); Waters-Micromass Q-TOF electrospray質(zhì)譜儀;圓二色譜儀(英國Applied Photophysics公司);AvanceIII-600 MHz核磁共振儀(瑞士Bruker公司)。柱色譜硅膠及GF254薄層色譜硅膠(青島海洋化工廠);Sephadex LH-20(美國GE公司);反相硅膠(德國Merck公司);CHP-20 MCI(日本Mitsubishi公司)。石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等溶劑(分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠)。

藥材于2019年采購于安徽亳州藥材市場(chǎng),經(jīng)聊城市中醫(yī)院范在舉主管中藥師鑒定為豆蔻屬植物草果(Amomumtsao-koCrevost &Lemarie)的果實(shí),標(biāo)本(編號(hào):CG2019)儲(chǔ)存于聊城市中醫(yī)院中藥制劑中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 提取與分離

對(duì)烘干后的3 kg草果果實(shí)進(jìn)行粉碎,用95%乙醇提取三次(5.0 L×3),濃縮后除去乙醇,得到粗浸膏(200 g)。將粗浸膏用水混懸,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到三個(gè)不同極性部位的浸膏,對(duì)乙酸乙酯部位(90 g)進(jìn)行系統(tǒng)分離:浸膏經(jīng)MCI柱層析(甲醇∶水 = 4∶6→9∶1)洗脫為12個(gè)餾分(Fr.A～Fr.L)。其中Fr.C段經(jīng)反相硅膠柱色譜進(jìn)行梯度(甲醇∶水 = 3∶7→7∶3)洗脫分為兩個(gè)餾分(Fr.C1和Fr.C2),Fr.C1經(jīng)高效液相色譜儀(50%甲醇/水,3mL/min)進(jìn)行分離得到化合物3(1.3 mg,tR= 12 min)和5(1.4 mg,tR= 15 min);Fr.C2經(jīng)高效液相色譜儀(55%甲醇/水,3 mL/min)進(jìn)行分離得到化合物4(0.9 mg,tR= 11 min)和6(1.6 mg,tR= 14 min)。Fr.E段經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行梯度(石油醚∶乙酸乙酯 = 2∶1→1∶3)洗脫分為三個(gè)餾分(Fr.E1～E3),Fr.E1經(jīng)凝膠色譜(100%乙醇)純化后經(jīng)高效液相色譜儀(50%甲醇/水,3mL/min)進(jìn)行分離得到化合物10(2.3 mg,tR= 9 min)和11(4 mg,tR= 11 min)。Fr.E3經(jīng)凝膠色譜(100%甲醇)純化后經(jīng)高效液相色譜儀(70%甲醇/水,3mL/min)進(jìn)行分離得到化合物8(5 mg,tR= 9 min)和9(4 mg,tR= 11 min)。Fr.G段經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行梯度(石油醚∶丙酮=10∶1→2∶1)洗脫后再經(jīng)凝膠色譜(氯仿∶甲醇 = 1∶1)純化得到化合物7(2 mg)。Fr.H經(jīng)凝膠色譜(100%甲醇)純化后經(jīng)高效液相色譜儀(80%甲醇/水,3mL/min)分離得到化合物1(1 mg,tR= 15 min)和2(1 mg,tR= 16 min)。

1.2.2 化合物1的ECD計(jì)算

采用Maestro 10.2中的構(gòu)象搜索功能,采用MMFFs力場(chǎng)計(jì)算構(gòu)象能量,挑選能量閾值在2.5 kcal/mol以內(nèi)的構(gòu)象進(jìn)行量子化學(xué)幾何優(yōu)化。然后采用Gaussian 09在B3LYP-6-311G(2d,q)對(duì)得到的構(gòu)象進(jìn)行幾何優(yōu)化以及TD-DFT方法計(jì)算每個(gè)優(yōu)勢(shì)構(gòu)象的激發(fā)態(tài)。最后采用SpecDis軟件擬合化合物的ECD圖譜,并與實(shí)驗(yàn)圖譜比對(duì)。

1.2.3α-葡萄糖苷酶活性成分的篩選方法

1.2.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測(cè)方法

本檢測(cè)按照Zhang等[8]的方法進(jìn)行操作,以阿卡波糖作為陽性對(duì)照藥物,按照公式計(jì)算抑制率:抑制率=[1- (A樣品-A空白) / (A陰性-A空白) ]×100%,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用數(shù)據(jù)分析軟件Graph Pad Prism 8.0進(jìn)行處理并求出相應(yīng)IC50值,結(jié)果通過至少3次平行實(shí)驗(yàn)獲得,實(shí)驗(yàn)值表示為數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)。進(jìn)一步對(duì)所得IC50值應(yīng)用Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用單因素方差分析(One-wayANOVA)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,以P<0.01表示存在顯著性差異。

1.2.3.2 酶動(dòng)力學(xué)的測(cè)定

活性化合物與的抑制類型活性根據(jù)之前描述的方法[9]進(jìn)行評(píng)估。在加入或不加入IC50值附近四種不同濃度的受試化合物的情況下,增加底物PNPG的濃度。所研究化合物結(jié)合α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型是通過Lineweaver-Burk曲線進(jìn)行分析得出。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～11的結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of the compounds 1-11

圖2 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY(━)和HMBC(→)相關(guān)Fig.2 Key1H-1H COSY(━)and HMBC(→)correlations of compound 1

圖3 化合物1的計(jì)算ECD及實(shí)測(cè)ECD圖Fig.3 Calculated and experimental ECD spectra of 1

表1 化合物1的1H和13C NMR數(shù)據(jù)(600 MHz和150 MHz,CDCl3)

化合物2無色油狀物;ESI-MS:m/z249.1 [M+Na]+,分子式為C12H18O4;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.51(2H,s,H-2,6),3.91(1H,m,H-7),3.89(6H,s,3,5-OMe),3.21(3H,s,4-OMe),1.81(1H,m,H-8b),1.63(1H,m,H-8a),0.87(3H,t,J= 7.4 Hz,H-9);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:133.4(C-1),103.2(C-2,6),147.0(C-3,5),133.8(C-4),85.8(C-7),31.0 (C-8),10.3(C-9),56.3(3,5-OMe),56.5(4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物2為(R)-1-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propan-1-ol。

化合物3無色油狀物;ESI-MSm/z:179.2 [M+H]+,分子式為C10H12O3;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.55(1H,d,J= 1.9 Hz,H-2),7.55(1H,dd,J= 8.7,1.9 Hz,H-5),6.94(1H,d,J= 8.7 Hz,H-6),3.95(3H,s,3-OMe),2.96(2H,q,J= 7.3 Hz,H-8),1.22(3H,t,J= 7.3 Hz,H-9);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:129.9(C-1),109.7(C-2),146.8(C-3),150.1(C-4),113.7(C-5),123.2(C-6),199.6(C-7),31.3(C-8),8.6(C-9),56.1(3-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物3為3-甲氧基-4-羥基苯丙酮。

化合物4無色油狀物;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.54(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2),7.54(1H,dd,J= 8.6,1.8 Hz,H-5),6.94(1H,d,J= 8.6 Hz,H-6),3.95(3H,s,3-OMe),2.56(3H,s,H-8);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:130.2(C-1),109.7(C-2),146.6(C-3),150.4(C-4),113.8(C-5),124.0(C-6),196.8(C-7),26.2(C-8),56.0(3-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物4為香草乙酮。

化合物5無色油狀物;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.39(2H,s,H-2,6),3.87(6H,s,3,5-OMe),2.30(3H,s,H-7);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:132.4(C-1),105.6(C-2,6),146.8(C-3,5),128.8(C-4),21.6(C-7),56.3(3,5-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物5為2,6二甲氧基-4甲基苯酚。

化合物6無色油狀物;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:9.67(1H,s,H-7),7.09(2H,m,H-2,5),6.88(1H,m,H-6),3.81(3H,s,3-OMe);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:130.0(C-1),108.7(C-2),147.2(C-3),151.7(C-4),114.4(C-5),127.6(C-6),190.9(C-7),56.2(3-OMe)。以上數(shù)據(jù)[12]與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致,故鑒定化合物6為香蘭素。

化合物7無色油狀物;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.30(1H,brs,H-4),1.68(3H,brs,H-10),0.95(3H,d,J= 7.3 Hz,H-8),0.92(3H,d,J= 7.3 Hz,H-8);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:133.8(C-1),118.4(C-2),34.5(C-3),71.8(C-4),30.8(C-5),27.1(C-6),36.8(C-7),16.8(C-8),16.8(C-9),23.3(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物7為4-萜烯醇。

化合物8無色油狀物;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.77(2H,m,H-11,12),5.46(2H,m,H-15,16),0.97(3H,t,J= 7.5 Hz,H-18);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:176.0(C-1),34.8(C-2),26.0(C-3),26.5(C-4),30.1(C-5),30.3(C-6),30.5(C-7),38.3(C-8),73.0(C-9),136.5(C-10),131.1(C-11),75.9(C-12),75.8(C-13),31.5(C-14),134.3(C-15),126.4(C-16),21.7(C-17),14.6(C-18),52.0(1-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物8為methyl (9S,10R,11E,13R,15Z)-9,10,13-trihydroxyoctadeca-11,15-dienoate。

化合物9無色油狀物;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.70(2H,m,H-11,12),0.91(3H,t,J= 7.5 Hz,H-18);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:176.0(C-1),34.8(C-2),26.0(C-3),30.1(C-4),30.4(C-5),30.5(C-6),26.6(C-7),33.5(C-8),75.8(C-9),76.5(C-10),136.5(C-11),131.1(C-12),73.0(C-13),38.3(C-14),26.5(C-15),33.1(C-16),23.7(C-17),14.4(C-18),52.0(1-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物9為methyl (9S,10R,11E,13R)-9,10,13-trihydroxyoctadec-11-enoate。

化合物10無色膠狀物;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.63～7.00(9H,m,H-2′,2′′,2′′′,5′,5′′,5′′′,6′,6′′,6′′′),5.48(1H,d,J= 2.5 Hz,H-1),5.01(1H,d,J= 5.7 Hz,H-7′′′),4.25(1H,dt,J= 7.6,6.5 Hz,H-3),3.84(3H,s,3′′′-OMe),3.83(3H,s,3′′-OMe),3.73(3H,s,3′-OMe),3.71(1H,dt,J= 8.2,3.6 Hz,H-6),3.66(1H,dt,J= 8.2,3.6 Hz,H-5),3.50(1H,dd,J= 9.5,5.8 Hz,H-9′′′),3.04(1H,ddd,J= 10.1,7.8,2.5 Hz,H-2),2.84(1H,dd,J= 14.3,6.8 Hz,H-7b),2.62(1H,dd,J= 14.3,5.5 Hz,H-7a),2.15(1H,ddd,J= 14.0,6.1,4.2 Hz,H-4b),1.95(1H,ddd,J= 14.0,8.4,6.6 Hz,H-4a);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:84.9(C-1),56.5(C-2),83.8(C-3),38.5(C-4),71.5(C-5),76.3(C-6),40.0(C-7),132.3(C-1′),110.5(C-2′),149.3(C-3′),148.1(C-4′),116.1(C-5′),119.8(C-6′),131.8(C-1′′),114.0(C-2′′),148.7(C-3′′),145.8(C-4′′),116.6(C-5′′),122.9(C-6′′),133.7(C-1′′′),110.7(C-2′′′),149.0(C-3′′′),147.5(C-4′′′),116.0(C-5′′′),119.8(C-6′′′),84.7(C-7′′′),55.5(C-8′′′),179.4(C-9′′′),56.3(3′-OMe),56.2(3′′-OMe),56.4(3′′′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物10為amomutsaoko A。

化合物11無色膠狀物;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.54(1H,dd,J= 8.3,1.8 Hz,H-6′),7.51(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2′),6.84(1H,br s,H-5′),6.83(1H,m,H-2′′),6.67(2H,m,H-5′′,6′′),3.80(3H,s,3′-OMe),3.72(3H,s,3′′-OMe),3.00(1H,dd,J= 15.6,5.7 Hz,H-2a),2.84(1H,dd,J= 13.8,6.8 Hz,H-7b),2.75(1H,dd,J = 13.8,7.3 Hz,H-7a),2.21(1H,dd,J= 13.6,6.1 Hz,H-4b),1.89(1H,ddd,J= 13.6,9.2,4.7 Hz,H-4a);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:199.6(C-1),45.5(C-2),75.7(C-3),42.7(C-4),73.4(C-5),85.1(C-6),36.0(C-7),130.7(C-1′),114.0(C-2′),145.7(C-3′),149.0(C-4′),115.8(C-5′),122.6(C-6′),132.0(C-1′′),112.1(C-2′′),148.7(C-3′′),153.4(C-4′′),115.9(C-5′′),125.0(C-6′′),56.2(3′-OMe),56.3(3′′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物11為renealtin A。

2.2 活性測(cè)試

對(duì)以上得到的化合物進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選,以阿卡波糖作為陽性對(duì)照(IC50=465±23 μmol/L),化合物10和化合物11顯示出明顯強(qiáng)于陽性對(duì)照的活性,其IC50分別為180±12 μmol/L和94±4 μmol/L,其他化合物顯示中等或較弱抑制活性(見表2)。

表2 草果中單體化合物α-葡萄糖苷酶抑制活性

進(jìn)一步對(duì)活性化合物11及陽性對(duì)照藥物阿卡波糖進(jìn)行了酶動(dòng)力學(xué)活性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)阿卡波糖的動(dòng)力學(xué)直線匯聚在Y軸,即其Vm不變,Km增大符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的特點(diǎn),這也符合阿卡波糖與α-葡萄糖苷酶的作用關(guān)系,而化合物11的動(dòng)力學(xué)直線匯聚在X軸,說明其Km值相等。而隨著11濃度的增加,斜率增大,Vm減小,這些特征與該酶非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用特征一致,說明化合物11是α-葡萄糖苷酶非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,Ki值為261 μmol/L(見圖4)。

圖4 化合物11與α-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The kinetic assay of 11 with α-glucosidase注:A、B:化合物11和阿卡波糖的Lineweave-Burk雙倒數(shù)線形結(jié)果;C:斜率與化合物11濃度二次線性結(jié)果。Note:A and B.Lineweaver-Burk reciprocal plots of 11 and acarbose;C.The secondary plot of slopes versus the concentration of 11.

3 結(jié)論

本研究從中藥草果的果實(shí)中分離得到11個(gè)化合物,其中化合物1為酚類化合物,是作為天然產(chǎn)物首次報(bào)道,化合物2、8和9為首次從豆蔻屬中分離得到的酚類及脂肪酸類化合物;通過α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)二苯基庚烷類化合物具有強(qiáng)于上市藥物阿卡波糖的活性,前期研究表明草果醇提物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性且本研究中其余單體成分并無顯著抑制活性,推測(cè)該類二苯基庚烷類化合物是草果體外發(fā)揮降血糖功效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。α-葡萄糖苷酶抑制劑作為臨床治療2型糖尿病的藥物近年來被廣泛關(guān)注,本研究不僅豐富了中藥草果的成分多樣性,也有望通過其中單體成分抑制α-葡萄糖苷酶的活性進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)中藥草果在臨床上新的應(yīng)用途徑。