氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豇豆中倍硫磷亞砜含量不確定度

◎ 王 儒，張欣琪，王 婷，張 樂，林達(dá)峰，梁 瓊

（海南省食品藥品檢驗(yàn)所?？诜炙?，海南 ?？?570311）

豇豆屬于豆科豇豆屬，別名為豆莢、角豆、帶豆，全國(guó)各省市均有種植[1-2]，熱帶和亞熱帶地區(qū)種植居多[3]。豇豆生長(zhǎng)過程易受病蟲危害，因此，種植人員會(huì)使用農(nóng)藥控制多種病蟲害[4-5]，農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)突出[6-8]，2022年，市場(chǎng)監(jiān)管總局通告豇豆主要農(nóng)藥殘留超標(biāo)物[9]包括倍硫磷農(nóng)藥等。倍硫磷是一種觸殺、廣譜、持效期長(zhǎng)的有機(jī)磷殺蟲劑，可殺死多種害蟲，如大豆食心蟲、果樹害蟲、蔬菜害蟲等。雖然倍硫磷對(duì)人體低毒，一旦殘留量超標(biāo)，也會(huì)引起中毒現(xiàn)象。有機(jī)磷類藥物中毒時(shí)，輕度會(huì)惡心、頭疼，重度出現(xiàn)昏迷、抽搐等[10]。

2021 年3月3日，最新發(fā)布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）[11]規(guī)定豇豆中倍硫磷最大殘留限量為0.05 mg/kg，通常為倍硫磷、倍硫磷亞砜、倍硫磷砜加和計(jì)，其中，倍硫磷亞砜是日常檢測(cè)時(shí)較為常見的一種檢出形式。此外，GB 2763—2021 規(guī)定，豇豆中倍硫磷亞砜留量的檢測(cè)方法有氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。

豇豆是日常抽檢果蔬品種之一，因此，本研究采用了氣質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]，參考了不確定度評(píng)定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行不確定分量的分析，如《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》（JJF 1135—2005）[18]、《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[19]、《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[20]、《常用玻璃量器檢定規(guī)程》 （JJG 196—2006）[21]，并按照GB 23200.113—2018 規(guī)定，對(duì)豇豆中倍硫磷亞砜留量進(jìn)行不確定評(píng)定，旨在提升評(píng)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，更好地滿足日常檢驗(yàn)工作質(zhì)量控制的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

（1）材料。乙酸乙酯色譜純（美國(guó)飛世爾公司）；乙腈色譜純（美國(guó)飛世爾公司）；提取試劑包：4 g硫酸鎂 ＋ 1 g 氯化鈉 ＋ 1 g 檸檬酸氫二鈉 ＋ 0.5 g 檸檬酸鈉（逗點(diǎn)生物科技有限公司）；凈化試劑包：900 mg硫酸鎂＋150 mg乙二胺基-N-丙基（PSA）（逗點(diǎn)生物科技有限公司）。

（2）設(shè)備。美國(guó)安捷倫 7000C氣質(zhì)聯(lián)用儀；QUINTX224-1CN電子分析天平：允許偏差為±0.000 5g；100 μL移液槍：允許偏差為±8%（即±8 μL）；1 000 μL移液槍：允許偏差為±1%（即±10 μL）；5 000 μL移液槍：允許偏差為±1%（即±50 μL）；10 mL單標(biāo)線吸管：允許偏差為±0.020 mL；25 mL分度吸管：允許偏差為±0.030 mL；50 mL分度吸管：允許偏差為±0.10 mL；1 mL A級(jí)容量瓶：允許偏差為±0.010 mL；5 mL A級(jí)容量瓶：允許偏差為±0.020 mL；10 mL A級(jí)容量瓶：允許偏差為±0.020 mL；環(huán)境溫度為20 ℃±5 ℃；

標(biāo)準(zhǔn)品：倍硫磷亞砜（編號(hào)/批號(hào)22873YB/F0034453），曼哈格科技股份有限公司，濃度為1 001.3 μg/mL，擴(kuò)展不確定度為±3%（K=2）。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）準(zhǔn)確稱取10 g樣品，用10 mL乙腈、1.1中的提取試劑包提取，蓋上離心管蓋后劇烈振蕩5 min，低速離心。離心后吸取上清液6 mL加到1.1中的凈化試劑包塑料離心管中，低速離心，凈化后上清液2 mL到干凈試管中40 ℃氮吹至近干。加入5 μg·mL-1環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)20 μL，并加1 mL乙酸乙酯，震蕩混勻后過微孔濾膜（0.22 μm）測(cè)定。

（2）空白基質(zhì)溶液按上述方法氮?dú)獯蹈珊?，加? μg/mL環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)20 μL，加入濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 μg·mL-1和0.5 μg·mL-1的梯度溶液1 mL復(fù)溶，制成混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（曲線），震蕩混勻后過微孔濾膜（0.22 μm）待測(cè)。

（3）氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件。①氣相色譜條件：HP-5 MS（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（純度為99.99%），不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；程序升溫：40 ℃（保持 1 min）， 40 ℃/min 升至120 ℃（保持 0 min）， 5 ℃/min 升至 240 ℃（保持0 min），以 12 ℃/min 升至 300 ℃（保持 5 min）。②質(zhì)譜條件：EI源能量 70 eV ；離子源溫度：250 ℃；接口溫度：280 ℃；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；內(nèi)標(biāo)外環(huán)氧七氯監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）為352.8 ＞253.0，354.8＞253.0；倍硫磷亞砜監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）為278.0＞109.0，278.0＞169.0。

（4）結(jié)果計(jì)算。通過計(jì)算機(jī)按內(nèi)標(biāo)法的公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：X——試樣中待測(cè)物殘留量，mg·kg-1；

Cs——基質(zhì)曲線標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中待測(cè)物的濃度，μg·mL-1；

A——試樣溶液中待測(cè)物的色譜峰面積；

As——基質(zhì)曲線標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中待測(cè)物的色譜峰面積；

Ci——試樣溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，μg·mL-1；

Csi——基質(zhì)曲線標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，μg·mL-1；

Asi——基質(zhì)曲線標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積；

Ai——試樣溶液中內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積；

V——樣液最終定容體積，mL；

m——試樣溶液所代表試樣的質(zhì)量，g。

2 不確定度來源分析

①天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（m0）（m0為樣品質(zhì)量）。②待測(cè)物倍硫磷亞砜濃度引入u（ccs），主要包括倍硫磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)值引入u（ucs）、配制過程引入u1（c）（倍硫磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液），建立擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)引入u2（c）。③體積引入u（V1）（V1為測(cè)定用樣液）。④體積引入u（V2）（V2為試樣處理液吸取體積）。⑤定容體積V3引入u（V3）（V3為試樣處理液定容體積）。⑥多次測(cè)量重復(fù)性引入u（rep）。

3 不確定度分量的量化

3.1 天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（m0）（m0為樣品質(zhì)量）

天平稱重豇豆10.00 g，天平最大允差為0.000 5 g。假定服從矩形模型分布，則天平標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

天平使用2次，一次為去皮，一次毛重。

稱取10.00 g樣品時(shí)，天平引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2 試料溶液中被測(cè)物的倍硫磷亞砜濃度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1（c）

倍硫磷亞砜（編號(hào)/批號(hào)22873YB/F0034453），濃度為1 001.3 μg·mL-1，擴(kuò)展不確定度為±3%（K=2），倍硫磷亞砜溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.1 倍硫磷亞砜稀釋時(shí)引入的不確定度

（1）倍硫磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)品配置，溶劑為丙酮，母液為1 001.3 μg·mL-1。

第1次稀釋：規(guī)范使用1 000 μL移液槍和10.00 mL容量瓶，將母液稀釋10倍得到濃度為100.13 μg·mL-1。第2次稀釋：規(guī)范使用1 000 μL移液槍和10.00 mL容量瓶，逐級(jí)稀釋10倍，得到濃度為10.013 μg·mL-1。

假定移液器與容量瓶的容量允差和環(huán)境影響2個(gè)因素引入的不確定度均服從矩形分布k=3，參考依據(jù)為JJG 646—2006和JJG 196— 2006中允差值見1.1 材料與設(shè)備，有機(jī)溶劑的體積膨脹系數(shù)為1.0×10-3℃-1。

①1 000 μL的移液管

移液管容量允差引起的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

環(huán)境溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

1 000 μL的移液管相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

②10 mL A級(jí)容量瓶

10 mL 容量允差引起的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

環(huán)境溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

10 mL A級(jí)容量瓶相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

標(biāo)準(zhǔn)溶液第1次稀釋過程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

第2次稀釋過程中容量器具引入的不確定度：

（2）與1.2中標(biāo)曲配置過程相同，內(nèi)標(biāo)為外環(huán)氧七氯，因標(biāo)曲和樣品中均加入內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)加入過程引入的不確定度可忽略。

①100 μL的移液管

容量允差帶來的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

環(huán)境溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

100 μL的移液管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

②5 mL A級(jí)容量瓶

5 mL A級(jí)容量瓶容量允差引起的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

環(huán)境溫度所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

5 mL A級(jí)容量瓶相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

標(biāo)準(zhǔn)溶液第3次稀釋時(shí)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.2 工作曲線計(jì)算機(jī)擬合時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(c)

由于工作曲線用計(jì)算機(jī)擬合時(shí)使用了內(nèi)標(biāo)校正，標(biāo)準(zhǔn)曲線建立時(shí)計(jì)算機(jī)計(jì)算模式：以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度ci（μg·mL-1）與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的濃度csi（μg·mL-1）的比值為橫坐標(biāo)c，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測(cè)物的色譜峰面積As與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積Asi的比值相對(duì)響應(yīng)為橫坐標(biāo)Ai（見表1）。

表1 倍硫磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液c與相對(duì)響應(yīng)表

進(jìn)行工作曲線校準(zhǔn)和在線曲線擬合過原點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為線性方程A=ac+b, 斜率為a=0.822 120,截距為b=0.024 61，相關(guān)系數(shù)r=0.995 468 07。

式中：s——曲線的標(biāo)準(zhǔn)差，由公式進(jìn)行計(jì)算；

p——待測(cè)溶液的測(cè)定次數(shù)，p=2；

n——標(biāo)準(zhǔn)曲線建立時(shí)曲線測(cè)定總次數(shù)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)測(cè)定1次，共7個(gè)點(diǎn)，n=7；

a——曲線的斜率，值為0.822 120；

b——曲線的截距，值為0.062 461；

c——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度ci（μg·mL-1）與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的濃度csi（μg·mL-1）的比值；

——基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度ci（μg·mL-1）與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度csi（μg·mL-1）比值的平均值；

ci——建立工作曲線用標(biāo)準(zhǔn)系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度ci（μg·mL-1）與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度csi（μg·mL-1）的比值；

Ai——建立工作曲線用標(biāo)準(zhǔn)曲線中基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測(cè)物的色譜峰面積As/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積Asi的比值相對(duì)響應(yīng)。

根據(jù)以上數(shù)據(jù)求得，s=0.096 7，c=2.367 ；內(nèi)標(biāo)濃度為0.1μg·mL-1，c轉(zhuǎn)換成樣品濃度為0.236 7 μg·mL-1；工作曲線計(jì)算機(jī)擬合時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2（c）=0.094 6；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（c2）=0.094 6/2.367=4.0%。

綜合試料中倍硫磷亞砜的計(jì)算機(jī)擬合曲線過程相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（c）：

3.3 樣品溶液稀釋定容體積V引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（V）

步驟為1.2中樣品稀釋過程，此處用到10 mL移液器和5 000 μL移液槍2次，因內(nèi)標(biāo)物添加時(shí)樣品和標(biāo)樣均用同一把移液槍，該內(nèi)標(biāo)加入過程引入的不確定度可忽略。

3.3.1 10 mL的移液管

移液管容量允差引起的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

環(huán)境溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

100 μL的移液管相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3.2 5 000 μL的移液管

移液管容量允差引起的體積標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

環(huán)境溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

5 000 μL的移液管相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

體積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（V）：

3.4 測(cè)量結(jié)果多次重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（rep）（見表2）

表2 多次重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果表

由貝塞爾公式計(jì)算得到s（A）單次測(cè)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.046，測(cè)量結(jié)果為2次取平均值，則u（rep）為：

4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算

測(cè)定過程中的數(shù)值與不確定度分量見表3。

表3 測(cè)定過程中的數(shù)值與不確定度分量表

將表中的不確定度分量合成：

樣品中倍硫磷亞砜含量取前2個(gè)樣的平均值，最終測(cè)定結(jié)果為0.24 mg·kg-1,因此：

擴(kuò)展不確定度：U=Ku（w）=2×0.017=0.034 mg·kg-1（95% 置信概率下，取包含因子k=2 ）。

樣品中倍硫磷亞砜含量：（0.24±0.034） mg·kg-1，k=2。

5 結(jié)論

本研究按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 23200.113—2018[13]，對(duì)豇豆中倍硫磷亞砜殘留量進(jìn)行測(cè)定，按照試驗(yàn)步驟，對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中不確定度來源進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，倍硫磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程，以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算機(jī)擬合過程中引入的不確定度分量＞測(cè)試結(jié)果多次重復(fù)性不確定度分量＞樣品試驗(yàn)稀釋過程引入的不確定度分量＞樣品稱樣過程的不確定度分量。因此，在檢驗(yàn)時(shí)，工作人員需定期校準(zhǔn)容量瓶移液管等玻璃量器和移液槍等設(shè)備，并嚴(yán)格按試驗(yàn)操作規(guī)程使用儀器設(shè)備，以減少試驗(yàn)過程引入的不確定度，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。