高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定兩當(dāng)狼牙蜜中5種苦參類生物堿

◎ 禹 潔， 周 佳， 蘇阿龍， 王麗君， 顧培良

（甘肅省食品檢驗(yàn)研究院， 甘肅 蘭州 730300）

生物堿是廣泛存在于自然界中的一類含氮堿性物質(zhì)，具有一定的毒理作用和藥理作用[1-3]?？鄥㈩惿飰A廣泛存在于苦參、苦豆子等豆科植物當(dāng)中[4]。苦參堿和氧化苦參堿均屬于苦參類生物堿中的活性成分，兩者在特定的條件下能夠互相轉(zhuǎn)化[5]，具有抗腫瘤、抗炎癥、調(diào)整心律、保護(hù)心臟、提高免疫力等多種功效[6-7]。除此之外，在病蟲(chóng)害預(yù)防及治理方面，苦參堿和氧化苦參堿是一類利用率高，效果顯著的植物源殺蟲(chóng)劑，具有低毒性、低殘留等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛被應(yīng)用在防治各種松毛蟲(chóng)、茶毛蟲(chóng)等農(nóng)林害蟲(chóng)領(lǐng)域[8-9]?；惫麎A即13,14-脫二氫苦參堿，氧化槐果堿即13,14-脫二氫氧化苦參堿，均屬苦參類生物堿，有研究發(fā)現(xiàn)，其具有調(diào)節(jié)心律失常和一定的中樞神經(jīng)藥理作用[10]?；倍▔A即5β-苦參堿，是苦參堿（α-苦參堿）的差向異構(gòu)體，研究表明，槐定堿對(duì)多種癌癥尤其是消化道類癌癥療效很好，且不良反應(yīng)發(fā)生率較低。近年，槐定堿因具有穩(wěn)定、化學(xué)結(jié)構(gòu)靈活、生物利用度高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，受到學(xué)界廣泛關(guān)注[11-13]。

狼牙刺（Sophora viciifolia Hance）為豆科槐屬多年生灌木，又名白刺花，通常生長(zhǎng)于海拔1 000～1 500 m的陽(yáng)坡或河谷地帶，廣泛分布于我國(guó)的陜西、甘肅等地。狼牙刺不同部位中均含有苦參堿、氧化苦參堿等多種生物堿，其中，氧化苦參堿的含量在果實(shí)中可高達(dá)3.6%[14-17]。此外，狼牙刺還是一種特色蜜源植物，因狼牙刺花而得名的狼牙蜜，產(chǎn)量大，品質(zhì)獨(dú)特，內(nèi)含豐富的礦物質(zhì)、氨基酸、維生素和活性酶等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠被人體吸收，體現(xiàn)了較高的食用和藥用價(jià)值。狼牙蜜盛產(chǎn)于甘肅兩當(dāng)縣、徽縣，是在得天獨(dú)厚的地理環(huán)境和優(yōu)渥的資源條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和精煉加工孕育而生的一種特殊產(chǎn)品，年產(chǎn)量達(dá)5萬(wàn)多kg，遠(yuǎn)銷中外，兩當(dāng)縣也因此被譽(yù)為“狼牙蜜之鄉(xiāng)”[18-19]。2008年，原國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將兩當(dāng)狼牙蜜作為地理標(biāo)志產(chǎn)品[20]。目前，對(duì)狼牙刺植株中生物堿的組成和含量測(cè)定已有不少報(bào)道[21-23]，蜂蜜中生物堿的測(cè)定采用固相萃取、QuEChERS提取和凈化，然后用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定性和定量分析[1-2]，但對(duì)狼牙蜜中苦參類生物堿的組成及含量測(cè)定至今未有報(bào)道。

本研究以兩當(dāng)狼牙蜜中苦參類生物堿為研究對(duì)象，采用液液萃取結(jié)合高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的定性定量分析方法，旨在為狼牙蜜中苦參類生物堿的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)，更好地研究與開(kāi)發(fā)與狼牙刺有關(guān)的植物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、三氯甲烷、甲酸：色譜純（德國(guó)默克公司）；乙酸銨：色譜純（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；氨水：分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

苦參堿（純度：98.9%)、氧化苦參堿（純度：99.1%)、氧化槐果堿（純度：99.4%)、槐定堿（純度：98.5%)，均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；槐果堿（純度：99.85%)，購(gòu)于Stanford Chemicals 上海佰世凱化學(xué)科技有限公司。

蜂蜜：共65份，根據(jù)蜜源進(jìn)行分類。其中，狼牙蜜10份，槐花蜜10份，棗花蜜10份，油菜蜜10份，椴樹(shù)蜜5份，枸杞蜜5份，桂花蜜5份，茴香蜜5份，野菊花蜜5份。樣品均來(lái)源于甘肅省兩當(dāng)縣及蘭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和大型超市。

1.2 儀器與設(shè)備

5500QTRAP高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB.SCIEX公司）；ME403T電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；Elmasonic P 300 H超聲波清洗機(jī)（德國(guó)Elma公司）；SORVALL LYNX 6000高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司）；VORTEX 3渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；N-EVAP116氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取攪拌均勻的蜂蜜樣品2 g（準(zhǔn)確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入3 mL氨水使樣品溶解，再加入10 mL三氯甲烷，渦旋振蕩3 min，超聲提取30 min，8 000 r·min-1離心5 min，用吸管將下層三氯甲烷層轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中，用10 mL三氯甲烷反復(fù)洗滌吸管，洗滌液轉(zhuǎn)移至殘?jiān)薪?jīng)上述相同操作進(jìn)行提取。重復(fù)此過(guò)程3次，合并提取液于40 ℃氮?dú)獯蹈伞埩粑镆猿跏剂鲃?dòng)相溶解并定容至1 mL。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取適量的5種苦參類生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確量取配制的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成濃度為1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。臨用時(shí)，取配制的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用初始流動(dòng)相稀釋制成含5種苦參類生物堿濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

（4）基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液 。用空白基質(zhì)蜂蜜樣品按1.3.1樣品前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，采用空白基質(zhì)溶液配制成0.1、0.2、0.5、1.0 、2.0、5.0、10.0 、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（50×2.1 mm，1.7 μm）；色譜柱溫度：30 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL；流動(dòng)相：A為2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，B為2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.25 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～1.0 min，95% A；1.0～4.0 min，95%～10% A；4.0～6.0 min，10% A；6.0～6.1 min，10%～95% A；6.1～8.0 min，95% A。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（Electron Spray Ionization， ESI)，正離子模式掃描；離子化電壓（IonSpray Voltage， IS）：+5 500 V；動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring， MRM）模式，5種苦參類生物堿的質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 5種苦參類生物堿的質(zhì)譜參數(shù)表

1.4 數(shù)據(jù)處理

將實(shí)驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)在MultiQuant軟件進(jìn)行處理分析，以5種苦參類生物堿的保留時(shí)間、定性離子、定量離子及兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比進(jìn)行定性判斷；繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析蜂蜜樣品中的不同目標(biāo)物；采用Origin 2022軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件

在正離子模式下，找出加合離子峰，在一定的去簇電壓和碰撞能量下，選擇子離子中相對(duì)豐度較強(qiáng)的2對(duì)子離子作為定性和定量離子對(duì)。在去簇電壓不斷增大的變化過(guò)程中，簇離子會(huì)隨之減少，目標(biāo)加合離子的響應(yīng)強(qiáng)度增高，當(dāng)電壓增大到一定數(shù)值時(shí)，由于源內(nèi)裂解的發(fā)生，導(dǎo)致目標(biāo)加合離子的響應(yīng)隨之降低，從而優(yōu)化出最佳去簇電壓。當(dāng)碰撞能量不斷增大過(guò)程中，目標(biāo)加合離子響應(yīng)會(huì)降低，特征子離子響應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，特征子離子會(huì)進(jìn)一步碎裂，從而響應(yīng)減弱，此過(guò)程可優(yōu)化出最佳碰撞能量（見(jiàn)表1）。

2.1.2 色譜條件

本研究比較了乙腈-0.1%甲酸水；0.1%甲酸乙腈-5 mmol乙酸銨；（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液）作為流動(dòng)相時(shí)5種苦參類生物堿的保留時(shí)間及峰形。結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸水體系下目標(biāo)物分離效果不佳且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重；0.1%甲酸乙腈-5 mmol乙酸銨體系下，因?yàn)橐宜徜@的加入使5種苦參類生物堿的分離效果得到改善，但是出峰時(shí)間較早，可能存在目標(biāo)物未完全洗脫的情況。（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液）作為流動(dòng)相時(shí)，5種苦參類生物堿出峰時(shí)間適宜，目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度增加，峰形尖銳，分離效果較好，可能是由于加入緩沖鹽后，可以降低堿基與色譜柱中極性的硅醇基相互作用，從而改善因其導(dǎo)致的拖尾效應(yīng)[24]。因此，采用（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在8 min內(nèi)完成目標(biāo)物的測(cè)定（如圖1、2）。

圖1 5種苦參類生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

在萃取過(guò)程中，本研究比較了甲醇、乙腈、正己烷和三氯甲烷作為提取劑的提取效果。其中，正己烷對(duì)極性化合物的提取效果較差；甲醇作為提取劑，會(huì)出現(xiàn)微量沉淀物，提取效率低；乙腈和三氯甲烷都能使目標(biāo)物富集，提取效果較好，但在最后的濃縮過(guò)程中三氯甲烷更易揮發(fā)，能更快氮吹干，進(jìn)而縮短前處理時(shí)間，提高前處理的效率（如表2）。此外，本研究進(jìn)行了多次重復(fù)提取，可以使目標(biāo)物提取充分，降低損失，提高回收率。

2.2.2 料液比的優(yōu)化

蜂蜜中含糖量較高，一般在60%～80%，若直接提取可能由于蜂蜜本身黏度較大，目標(biāo)物附著于糖分上，影響提取效果[25]。因此，先用適量水溶解狼牙蜜，使其成為均勻相，再進(jìn)行后續(xù)提取步驟。直接用三氯甲烷萃取，提取效果較好。為了更進(jìn)一步提高回收率，使用適量氨水溶解狼牙蜜，同時(shí)，因苦參類生物堿為堿性化合物，遂在萃取溶劑中加入適量堿，以增加其在三氯甲烷中的溶解度。

此外，本研究考察了狼牙蜜質(zhì)量同氨水添加量的不同配比，隨著氨水添加量的增加，回收率也相應(yīng)提高，由圖3可知，當(dāng)狼牙蜜質(zhì)量與氨水比例為1∶1.5時(shí)，提取效果最佳，回收率最高；當(dāng)狼牙蜜質(zhì)量與氨水比例為1∶2時(shí)，回收率略微下降，繼續(xù)增大氨水比例，回收率繼續(xù)降低。故選擇稱取2.00 g狼牙蜜，加入3 mL氨水進(jìn)行溶解。

圖3 料液比對(duì)回收率的影響圖（n=3）

2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)是指對(duì)復(fù)雜目標(biāo)物進(jìn)行分析時(shí)，除了被分析物外，其他存在的物質(zhì)對(duì)整個(gè)分析過(guò)程造成的影響?；|(zhì)效應(yīng)可以在很大程度上導(dǎo)致目標(biāo)物信號(hào)的增強(qiáng)或抑制，從而影響定性和定量分析。干擾物質(zhì)可以是樣品的組分、預(yù)處理萃取過(guò)程中釋放的化合物，或添加到流動(dòng)相中以提高色譜分辨率的試劑等。總之，目標(biāo)分析物的化學(xué)性質(zhì)、基質(zhì)的種類、基質(zhì)與分析物的濃度比、提取工藝、色譜條件以及質(zhì)譜儀器的種類和電離條件，都可以引起基質(zhì)效應(yīng)[26]。在高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜分析中，基質(zhì)效應(yīng)的考察顯得非常重要?；|(zhì)效應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，即基質(zhì)效應(yīng)是基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列濃度曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)系列濃度曲線的斜率進(jìn)行評(píng)估[27]。基質(zhì)效應(yīng)小于100%，表明存在基質(zhì)抑制；基質(zhì)效應(yīng)大于100%，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)選用空白蜂蜜樣品，按照1.3.1的前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時(shí)，用初始流動(dòng)相配制溶液工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到兩者斜率比，考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，5種苦參類生物堿均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了分析定量，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 5種苦參類生物堿基質(zhì)效應(yīng)表

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法線性范圍及檢出限

參照2.1優(yōu)化后的儀器條件，對(duì)5種苦參類生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，繪制以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。5種苦參類生物堿在0.1～50 ng·mL-1濃度范圍線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 1。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)組分最低水平的3倍信噪比為檢出限（LOD），10倍信噪比為定量限（LOQ），計(jì)算得到本方法的檢出限和定量限（見(jiàn)表4）。當(dāng)稱樣量為2.00 g時(shí)，檢出限為0.10～0.20 μg·kg-1；定量限為0.30～0.45 μg·kg-1。

表4 5種苦參類生物堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限表

2.4.2 回收率和精密度

為了確證該方法的可行性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)狼牙蜜樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，同一批次狼牙蜜中添加3個(gè)含量水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為0.5、5 μg·kg-1和20 μg·kg-1，按照1.3.1所述方法進(jìn)行前處理后上機(jī)分析。由表5可知，5種苦參類生物堿的平均回收率在87.82%～93.18%之間，RSD≤3.8%。該結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法在不同濃度加標(biāo)水平下，能夠體現(xiàn)較高的回收率和較好的精密度，能夠滿足狼牙蜜樣品中5種苦參類生物堿的檢測(cè)要求。

表5 5種苦參類生物堿在不同加標(biāo)水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表(%,n=6)

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用前處理方法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件，對(duì)甘肅省兩當(dāng)縣及蘭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和大型超市的65份蜂蜜進(jìn)行了5種苦參類生物堿的分離提取及測(cè)定（圖4），各目標(biāo)物含量如表6所示。實(shí)際樣品分析結(jié)果表明，5種苦參類生物堿普遍存在于不同蜜源的蜂蜜中，只有10批次油菜花蜜中未檢出苦參堿和槐定堿；10批次棗花蜜和5批次野菊花蜜中未檢出槐定堿。狼牙蜜中5種苦參類生物堿的含量均高于其他蜜源品種的蜂蜜，在10批次狼牙蜜中苦參堿最高含量達(dá)0.769 μg·kg-1，氧化苦參堿達(dá)到2.102 μg·kg-1，槐果堿達(dá)到2.332 μg·kg-1，氧化槐果堿為5.987 μg·kg-1，槐定堿為0.882 μg·kg-1。由于狼牙刺的不同器官中均含有苦參類生物堿，其作為一種特色蜜源植物，因而狼牙蜜中也普遍含有苦參類生物堿。

圖4 樣品中5種苦參類生物堿的MRM色譜圖

3 結(jié)論與討論

本研究建立了液液萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定狼牙蜜中5種苦參類生物堿的檢測(cè)方法，在堿性條件下液液萃取對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行提取富集，同時(shí)，優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件，采用基質(zhì)外標(biāo)法加以定量。實(shí)驗(yàn)表明，5種苦參類生物堿在0.1～50 ng·mL-1濃度范圍線性關(guān)系良好（R2＞0.999 1），方法檢出限的范圍在0.1～0.2 μg·kg-1之間；定量限范圍在0.30 ～0.45 μg·kg-1之間。在不同的加標(biāo)水平下，5種苦參類生物堿的平均回收率在87.82%～93.18%之間，RSD≤3.8%。由此可見(jiàn)，該方法提取率高，定量準(zhǔn)確，適用于狼牙蜜中5種苦參類生物堿的檢測(cè)。同時(shí)，測(cè)定的不同蜜源品種蜂蜜中5種苦參類生物堿的含量差異較大，狼牙蜜中5種苦參類生物堿的含量均高于其他品種。

綜上所述，本研究重點(diǎn)關(guān)注兩當(dāng)狼牙蜜中苦參類生物堿的含量測(cè)定，建立了一種高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，旨在為狼牙蜜中苦參類生物堿的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考，為學(xué)界全面了解狼牙蜜的食用和藥用價(jià)值提供研究途徑和技術(shù)支撐。