液相色譜法在測(cè)定糧食作物中真菌類毒素的應(yīng)用分析

◎ 梁 輝

（海南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，海南 ?？?570203）

糧食安全是關(guān)系到國計(jì)民生的重大問題，糧食作物的品質(zhì)和安全是保障糧食安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。作為真菌類微生物的有害代謝產(chǎn)物，真菌類毒素是糧食作物中常見的一類有害物質(zhì)，對(duì)人類和動(dòng)物健康有著嚴(yán)重威脅[2]。因此，對(duì)糧食作物中真菌類毒素的準(zhǔn)確測(cè)定顯得尤為重要。

液相色譜法是一種基于液體為流動(dòng)相的色譜技術(shù)，具有高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。在毒素測(cè)定領(lǐng)域，液相色譜法已廣泛應(yīng)用于多種毒素的分析，如真菌類毒素、有機(jī)磷農(nóng)藥、重金屬等[3]。真菌類毒素是一類由真菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）是糧食作物中最常見的3種真菌毒素[4-5]?；诖?，本研究利用液相色譜串聯(lián)紫外和熒光檢測(cè)器，對(duì)3種真菌類毒素進(jìn)行檢測(cè)，旨在為糧食產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢測(cè)提供可靠依據(jù)[6-7]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290型高效液相色譜儀（配制熒光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器）；JOANLAB軌道式振蕩器；SHZ-D (Ⅲ) 型循環(huán)水真空泵；MS204S型電子天平；Milli Q超純水器；TG18G-Ⅱ型高速離心機(jī)；黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標(biāo)準(zhǔn)溶液購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)平臺(tái)。

水為超純水；乙腈購自默克股份兩合公司。

1.2 樣品來源

在市場(chǎng)上購買所需糧食樣品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

稱取50.0 g粉碎后糧食樣品于250 mL磨口具塞三角瓶中，加入80%乙腈100 mL，振蕩提取30 min（300 r·min-1）。濾過，取濾液50 mL置離心管中（5 000 r·min-1），離心5 min。取濾液10 mL，加水40 mL，混勻，用玻璃纖維濾紙過濾，備用。

取20.0 mL上述提取濾液，以1.5～2 mL·min-1流速緩慢通過免疫親和柱。以10 mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使部分空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0 mL乙腈洗脫，流速控制為1～2 mL·min-1，收集全部洗脫液于樣品瓶中，氮?dú)獯蹈?。?0%乙腈溶解混勻后，過0.22 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

精密量取黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用色譜純乙腈稀釋制成含各標(biāo)準(zhǔn)品100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.3 主要儀器參數(shù)

色譜條件：色譜柱選擇Diamonsil C18，250×4.6 mm，5 μm。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；VWD檢測(cè)器波長為220 nm；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長305 nm，發(fā)射波長460 nm。流動(dòng)相：乙腈和0.1%乙酸溶液。洗脫程序見表1。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別用刻度管移取0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL和10.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液于20 mL的容量瓶中，分別用乙腈溶液定容，得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。分別精密量取各標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液各20 μL，在擬定的液相色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

1.3.5 檢測(cè)限與定量限

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液擬定的色譜條件下進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果逐級(jí)稀釋樣品濃度，分別測(cè)定黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。

1.3.6 加標(biāo)回收率測(cè)定

稱取50.0 g粉碎后糧食樣品于250 mL磨口具塞三角瓶中，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。照“1.3.1”進(jìn)行樣品處理，并將制備好的樣品進(jìn)行液相色譜測(cè)定。

1.3.7 樣品的重復(fù)性測(cè)定

照“1.3.1”方法，處理樣品并測(cè)定糧食樣品中的黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限的測(cè)定結(jié)果

黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定結(jié)果見表2。在擬定的色譜條件下，黃曲霉毒素B1在1.01～50.30 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y=12 139x-2 703.2，R2=0.999 8；玉米赤霉烯酮在1.02～50.75 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y= 495.28x-85.947，R2=0.999 8；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在1.02～51.15 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y=26.292x+ 10.985，R2=0.999 8。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

2.2 樣品的加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的加標(biāo)回收率結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，本方法測(cè)定各添加劑的加標(biāo)回收率在97.02%～101.95%范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果的RSD值均小于5%。由此可見，本方法測(cè)定糧食樣品中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇準(zhǔn)確度良好。

2.3 樣品的重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

采用本方法，對(duì)“1.3.6”中加標(biāo)回收率樣品連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 樣品的重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表

從表4的測(cè)定結(jié)果看出，對(duì)同一樣品連續(xù)測(cè)定6次，黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定結(jié)果的RSD分別為2.93%、2.41%和2.64%，均小于5%。因此，本方法測(cè)定樣品的重復(fù)性良好。

3 結(jié)論及展望

本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定糧食作物中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的液相色譜方法。通過對(duì)定量分析方法的驗(yàn)證，得到以下結(jié)論：① 所測(cè)定的3種真菌毒素類化合物的線性關(guān)系良好，R2均大于0.990。②3種真菌毒素中，檢測(cè)限濃度最高為0.31 μg·mL-1，定量限濃度最高為0.93 μg·mL-1，方法靈敏度較高。③本方法測(cè)定黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的加標(biāo)回收率在97.02%～101.95%范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果的RSD值均小于5%。④對(duì)同一樣品連續(xù)測(cè)定6次，黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定結(jié)果的RSD分別為2.93%、2.41%和2.64%，均小于5%。由此可見，本方法測(cè)定樣品的重復(fù)性良好。因此，本研究結(jié)果對(duì)糧食作物中真菌類毒素的檢測(cè)和控制具有重要意義，能夠?yàn)榧Z食產(chǎn)品提供更好的安全保障。