板栗糯米酒的糖化發(fā)酵工藝研究

◎ 李堂駿，王 斌,3，時雨晴，劉振興，姜啟興,3，楊 遠

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；4. 中農(nóng)一號新沂食品有限公司，江蘇 徐州 221400）

板栗（Castanea mollissima）果實富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及礦物質(zhì)[1-2]。當(dāng)前，諸多研究對多菌種發(fā)酵的板栗醋、板栗酸乳發(fā)酵工藝及品質(zhì)進行了分析和優(yōu)化[3-4]。例如，胡美怡等對板栗黃酒發(fā)酵工藝進行研究[5]，發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒較小且較為均勻，有利于糖化的進行[6-9]。糯米酒是通過在底料中添加酒曲，將糯米中的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖并發(fā)酵為酒精，同時，將其中的多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低聚糖、小分子有機酸、氨基酸及肽類物質(zhì)等對人體有益物質(zhì)的發(fā)酵酒[10-11]?；诖?，本文以板栗糯米為主要原料，研究了米曲霉（Aspergillus oryzae）對板栗糯米糖化的影響，以還原糖含量、總酸含量、可溶性固形物含量為依據(jù)，對糖化發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，確定板栗糯米酒的最佳糖化發(fā)酵工藝條件，旨在為板栗糯米酒開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

（1）材料：新鮮板栗（遷西縣金地食品甘栗有限公司）；長糯米（燕之坊五谷雜糧）；生麥芽（上元堂大藥房）；米曲霉（山東和眾康源生物科技有限公司）。

（2）試劑：氫氧化鈉、硫酸銅、亞甲基藍、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙醇等化學(xué)試劑均為分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 試驗儀器

GHP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；FEP實驗室pH計（梅特勒-托利多公司）；LE204E電子天平（梅特勒-托利多公司）；DK-8AXX電熱恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；VD-650桌上式潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；WAY-2W阿貝折射儀（儀電物光儀器有限公司）；MY-CD5026P電壓力鍋（廣東美的生活電器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

工藝流程如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.3.2 糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗

以米曲霉添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、糖化溫度（28、30、32、34 ℃和36 ℃）、糖化時間（12 、24、36、48、60、72 h和84 h）進行單因素試驗。在此基礎(chǔ)上，以米曲霉添加量、糖化溫度、糖化時間的最佳條件相鄰兩水平為試驗水平，進行糖化發(fā)酵的三因素三水平正交試驗。

1.4 分析方法

還原糖含量測定參照GB 5009.7—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》中的第一法直接滴定法?？扇苄怨绦挝锖繀⒄誈B/T 12143—2008 《飲料通用分析方法》中的折光計法進行測定。酸度測定參照GB 5009.239—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測定》中的第二法pH計法，以乳酸計。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0 的單因素方差分析和LSD 后特設(shè)測試（最小顯著差異）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Excel、Origin進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉糖化發(fā)酵試驗結(jié)果分析

2.1.1 米曲霉添加量對板栗糯米糖化發(fā)酵的影響

分析表明，米曲霉添加量對糖化酶的產(chǎn)量以及糖化效果，都有一定的影響[12]。其中，發(fā)酵液中還原糖和可溶性固形物含量隨米曲霉添加量的增加而增加。當(dāng)米曲霉添加量低于0.4%時，還原糖含量增加較為緩慢；當(dāng)米曲霉添加量達到0.5%時，還原糖含量最高達到8.3 g/100 g，可溶性固形物含量最高（如圖2A和2B）；總酸含量隨米曲霉添加量的增加而增加。當(dāng)米曲霉添加量在0.1%～0.4%時，總酸含量變化較為平緩；米曲霉添加量達到0.5%時，發(fā)酵液中總酸達到2.4 g/100 g（如圖2C），然而，發(fā)酵液總酸過高，可溶性固形物含量也會較高，導(dǎo)致發(fā)酵體系失衡[13-14]。結(jié)合發(fā)酵液的總酸及可溶性固形物含量，取米曲霉的最適添加量為0.4%。

圖2 米曲霉添加量對糖化發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖、可溶性固形物和總酸含量的影響圖

2.1.2 米曲霉發(fā)酵溫度對板栗糯米糖化發(fā)酵的影響

分析表明，發(fā)酵的溫度會影響米曲霉的生長繁殖及糖化酶的活性。溫度過低，米曲霉繁殖緩慢，產(chǎn)生的糖化酶量較少，延長糖化發(fā)酵時間；溫度過高容易導(dǎo)致米曲霉死亡，糖化酶鈍化、失活[15]。發(fā)酵溫度為32 ℃時，發(fā)酵液的還原糖含量最高；當(dāng)溫度高于34 ℃時其含量下降較顯著（如圖3A）。隨著發(fā)酵溫度的提高，可溶性固形物含量呈先增加后降低的趨勢，發(fā)酵溫度為32 ℃時，含量達到最高值12%；發(fā)酵溫度為36 ℃時，含量最低為10%（如圖3B）。米曲霉的最適生長溫度為30 ℃，繁殖量最多，無氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸含量較多。32 ℃條件下，糖化酶較多，原料中的淀粉轉(zhuǎn)換為還原糖。隨著溫度的升高，環(huán)境條件不適宜米曲霉的生長，發(fā)酵產(chǎn)生的酸含量隨之降低（如圖3C）。綜合還原糖、可溶性固形物及總酸含量考慮，選取最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖3 米曲霉發(fā)酵溫度對糖化發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖、可溶性固形物和總酸含量的影響圖

2.1.3 米曲霉發(fā)酵時間對板栗糯米糖化的影響

發(fā)酵初期，米曲霉繁殖，產(chǎn)生液化酶、糖化酶等酶系，使原料中的淀粉分解為還原糖，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)生的還原糖會因米曲霉的無氧呼吸作用生成酒精、有機酸等，還原糖含量增加緩慢甚至下降。當(dāng)米曲霉含量為0.4%時，48 h內(nèi)還原糖含量顯著增加，48 h后變化平緩（如圖4A）。隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中總酸含量逐漸增加；48 h后，發(fā)酵液中總酸含量增加速度較快，60 h后增加速率變緩，達到1.4 g/100 g（如圖4B）。隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液中可溶性固形物含量逐漸增加。48 h時，含量達到16%，發(fā)酵60 h后含量增加速率變緩（如圖4C）。由此可見，糖化時間過短，產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶的量較少，不足以使板栗和糯米中的淀粉分解生成還原糖，產(chǎn)生的有機酸等含量較少，口感欠佳[16]；糖化時間過長，則原材料中的淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡，同時，霉菌在發(fā)酵過程中可能產(chǎn)生較多有機酸，影響產(chǎn)品風(fēng)味，且容易造成雜菌的污染，不利于后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酒[17]。綜合還原糖、總酸和可溶性固形物含量，以及米曲霉成本和發(fā)酵時間成本考慮，選取60 h為最佳糖化發(fā)酵時間。

圖4 米曲霉發(fā)酵時間對糖化發(fā)酵后發(fā)酵液中還原糖、可溶性固形物和總酸含量的影響圖

2.2 米曲霉糖化發(fā)酵條件正交優(yōu)化

為進一步優(yōu)化米曲霉發(fā)酵糖化工藝條件，根據(jù)單因素試驗的研究結(jié)果，以發(fā)酵時間（48 、60 h和72 h）、米曲霉添加量（0.35%、0.4%、0.45%）和發(fā)酵溫度（30、32 ℃和34 ℃）為試驗水平，進行三因素三水平正交試驗（表1）。

表1 板栗糯米糖化正交試驗因素水平表

還原糖含量為標(biāo)準(zhǔn)，由表2可知，RA＞RC＞RB，極差分析的結(jié)果顯示為發(fā)酵時間的影響因素最大，其次是發(fā)酵溫度，米曲霉添加量對板栗糯米原料中的淀粉糖化得到的還原糖含量影響最小。根據(jù)各因素的K值大小，可以看出板栗糯米糖化工藝的最佳條件為A3B3C2。即發(fā)酵時間72 h、米曲霉添加量0.45%、反應(yīng)溫度32 ℃。

表2 糖化工藝還原糖含量正交試驗結(jié)果表

以可溶性固形物含量為標(biāo)準(zhǔn)，由表3可知，RA＞RB＞RC，極差分析的結(jié)果顯示為發(fā)酵時間對發(fā)酵液中可溶性固形物含量的影響因素最大，其次是米曲霉添加量，發(fā)酵溫度對發(fā)酵過程中可溶性固形物含量的影響最小。

表3 糖化工藝可溶性固形物含量正交試驗結(jié)果表

以總酸含量為標(biāo)準(zhǔn)，由表4可知，RC＞RB＞RA，極差分析的結(jié)果顯示為發(fā)酵溫度對發(fā)酵液酸度的影響因素最大，其次是米曲霉添加量，發(fā)酵時間對發(fā)酵過程中酸的產(chǎn)生影響最小。

表4 糖化工藝總酸含量正交試驗結(jié)果表

以還原糖含量為標(biāo)準(zhǔn)的最佳條件A3B3C2下，發(fā)酵液中總酸含量卻遠超過最優(yōu)的1.2～1.7 g/100 g[18]。因此，在發(fā)酵液總酸含量處于1.2～1.7 g/100 g條件下，選擇還原糖含量最高的條件A2B2C2、米曲霉添加量0.4%、發(fā)酵溫度32 ℃，所得發(fā)酵液還原糖含量為8.22 g/100 g，總酸含量為1.58 g/100 g，可溶性固形物含量為17.69%。

3 結(jié)論

本研究以板栗、糯米為主要原料，經(jīng)過米曲霉糖化發(fā)酵，以發(fā)酵液的還原糖、可溶性固形物、總酸為指標(biāo)，確定最佳糖化工藝為米曲霉添加量為0.4%，發(fā)酵溫度為32 ℃，發(fā)酵時間為60 h。因此，本研究結(jié)果不僅可以為板栗的深加工提供新思路，而且可以為板栗糯米酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。