恩格列凈灌胃對(duì)高血壓大鼠心室舒張功能障礙的改善作用及其機(jī)制

姚衛(wèi)杰，于翔

1 天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院心內(nèi)科，天津 300134；2 天津市內(nèi)分泌研究所；3 國(guó)家衛(wèi)健委激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4 天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

流行病學(xué)研究［1］顯示，射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭（HFpEF）是65 歲以上人群中最常見(jiàn)的心衰形式，老年婦女中大于80%的新發(fā)心衰類型為HFpEF。高血壓是HFpEF 的常見(jiàn)致病因素。60%～89%的高血壓患者可發(fā)生HFpEF［2］，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)后的血壓過(guò)度升高和高血壓性肺水腫［3］。降壓治療可有效改善HFpEF 患者的預(yù)后。臨床應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，ACEI/ARB、β 受體阻滯劑的應(yīng)用并沒(méi)改善HFpEF 患者的預(yù)后或降低病死率［4］。最新研究［5］發(fā)現(xiàn)，高血壓合并HFpEF 患者可同時(shí)存在肌聯(lián)蛋白磷酸化依賴性和膠原依賴性的心肌僵硬度增加，提示心室舒張功能障礙是其重要的病理生理改變，因此，恢復(fù)高血壓患者心室舒張功能可能有助于改善其心臟臨床結(jié)局。恩格列凈是一種鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體2 抑制劑（SGLT2i）。一項(xiàng)恩格列凈的心血管結(jié)局試驗(yàn)［6］發(fā)現(xiàn)，恩格列凈可降低糖尿病患者的心血管死亡率、全因死亡率和心力衰竭住院率。新近發(fā)表的EMPEROR-Preserved 研究［9］已證實(shí)，恩格列凈可降低HFpEF 患者心血管死亡和因心衰住院風(fēng)險(xiǎn)。恩格列凈可以改善糖尿病患者的心肌氧化應(yīng)激和間質(zhì)纖維化水平，改善心室舒張功能［8］。另有研究［9］提示，恩格列凈可以通過(guò)改善心肌細(xì)胞肌絲磷酸化水平，降低心肌細(xì)胞僵硬度，改善心肌舒張功能。恩格列凈是否可以改善高血壓大鼠的心室舒張功能障礙，目前尚無(wú)相關(guān)研究。為此，我們觀察了恩格列凈灌胃對(duì)高血壓大鼠心室舒張功能障礙的改善作用，并進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下

1 資料與方法

1.1 大鼠分組、高血壓心室舒張功能障礙模型制備及恩格列凈給予方法 8周齡雄性SD 大鼠25只（購(gòu)自北京華阜康公司），體質(zhì)量200～220 g。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.1 高血壓心室舒張功能障礙模型制備 25 只大鼠中20 只（模型組）參照文獻(xiàn)［10］行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)（abdominal aortic coarctation，AAC）構(gòu)建高血壓致壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)模型：以2.5%戊巴比妥鈉2 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠，在無(wú)菌環(huán)境下于劍突下2～3 cm，腹正中切口切開(kāi)皮膚，暴露腹腔，將腹部臟器一并推向右側(cè)，在右腎動(dòng)脈上方1.5 cm 處用兩只彎鑷剝離并充分暴露腹主動(dòng)脈，取出置于生理鹽水的7 號(hào)針頭，將針頭與大鼠腹主動(dòng)脈平行放置，再用4-0手術(shù)線一并結(jié)扎，隨后抽出7號(hào)針頭，剪去過(guò)長(zhǎng)的手術(shù)縫線，手術(shù)后所有大鼠腹腔注射5 000 U 青霉素防止感染，關(guān)閉腹腔。另外5 只大鼠在手術(shù)時(shí)僅將腹主動(dòng)脈分離后關(guān)閉腹腔（假手術(shù)組）。模型組大鼠術(shù)后死亡4只、超聲檢測(cè)時(shí)因麻醉過(guò)深死亡1 只。術(shù)后第8 周，檢測(cè)大鼠血壓，對(duì)大鼠行超聲心動(dòng)圖檢查，評(píng)估大鼠心室收縮及舒張功能。相較于假手術(shù)組，模型組大鼠血壓明顯升高，E峰減速時(shí)間（EDT）明顯延長(zhǎng)，E/A 值明顯下降，左心室質(zhì)量明顯增加，舒張期左室前壁厚度（LVAWd）明顯增厚，LVIDs 明顯增大，舒張期左室后壁厚度（LVPWd）明顯增厚（P均＜0.05），最終15 只大鼠建模成功。

1.1.2 大鼠分組及恩格列凈給予方法 15 只模型大鼠隨機(jī)分為A、B、C 三組（每組各5 只），即刻實(shí)施超聲心動(dòng)圖檢查（給藥前），觀察并記錄大鼠心室結(jié)構(gòu)參數(shù)、心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)。A組大鼠檢查后予恩格列凈10 mg/（kg·d）灌胃，1 次/天，連續(xù)灌胃4 周（給藥后）；B 組大鼠第同時(shí)間予生理鹽水灌胃，1 次/天，連續(xù)灌胃4 周；C 組大鼠于給藥前脫頸處死留取心肌組織備用。

1.2 各組大鼠心室結(jié)構(gòu)、心室舒張功能及心室收縮功能檢查 采用超聲心動(dòng)圖檢查。超聲圖像采集及測(cè)量均有專業(yè)醫(yī)師操作，各項(xiàng)心臟結(jié)構(gòu)及心功能指標(biāo)測(cè)量5 個(gè)心動(dòng)周期，計(jì)算平均值。大鼠吸入異氟烷麻醉后，使用小動(dòng)物超聲系統(tǒng)（Visual Sonics Vevo 2100） 進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。檢測(cè)內(nèi)容包括心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)：室前壁厚度（LVAW）、左室后壁厚度（LVPW）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）和LVIDs；舒張功能參數(shù)：左室等容舒張時(shí)間（IVRT）、EEDT、舒張?jiān)缙谧畲蠓逯邓俣龋‥）及舒張晚期最大峰值速度（A），測(cè)算E/A；收縮功能參數(shù)：根據(jù)LVDd 及LVDs計(jì)算LVEF和左室短軸縮短率（LVFS）評(píng)價(jià)大鼠的收縮功能。各指標(biāo)均重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.3 各組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥指標(biāo)及間質(zhì)纖維化指標(biāo)檢測(cè) A、B組大鼠給藥后再次行超聲心動(dòng)圖檢查，檢查后脫頸處死取心肌組織。取三組大鼠心肌組織，分離沖洗心室組織，離心制成心肌勻漿，采用商業(yè)ELISA 試劑盒分別檢測(cè)丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β。另取部分心肌組織，采用WESTERN Blotting 法檢測(cè)心肌細(xì)胞NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3），分別用非標(biāo)記大鼠NLRP3單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。β 微管蛋白作為內(nèi)參，用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以蛋白條帶灰度值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)、心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)比較 給藥前各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)見(jiàn)表1，給藥前各組大鼠心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)見(jiàn)表2。由表1、2可見(jiàn)，給藥前各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)、心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 給藥前各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)（mm，±s）

表1 給藥前各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)（mm，±s）

組別A組B組C組LVAWd 2.80 ± 0.73 2.21 ± 0.29 2.51 ± 0.54 LVPWs 4.07 ± 0.27 3.77 ± 0.51 3.91 ± 0.54 LVAWs 4.32 ± 0.90 3.37 ± 0.26 3.91 ± 0.64 LVIDd 7.27 ± 0.94 7.66 ± 0.25 7.31 ± 1.08 LVIDs 3.78 ± 1.20 4.52 ± 0.54 4.27 ± 0.97 LVPWd 2.87 ± 0.39 2.73 ± 0.38 2.76 ± 0.40

表2 給藥前各組大鼠心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)（±s）

表2 給藥前各組大鼠心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)（±s）

組別A組B組C組IVRT（ms）23.88 ± 3.59 22.82 ± 4.17 19.19 ± 2.32 EDT 39.05 ± 4.12 38.10 ± 5.17 40.75 ± 4.64 E/A 1.00 ± 0.09 1.04 ± 0.11 1.04 ± 0.19 LVEF（%）76.14 ± 9.62 70.05 ± 6.23 71.9 ± 7.84 LVFS（%）47.47 ± 10.43 41.37 ± 5.42 42.79 ± 6.65 LVM（%）1 506.82 ± 165.72 1 368.30 ± 84.46 1 375.63 ± 286.44

給藥后A、B 組大鼠心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)見(jiàn)表3，給藥后A、B 組大鼠心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)見(jiàn)表4。 與B 組比較，給藥后A 組大鼠IVRT短、LVM 及LVIDs 下降（P均＜0.05）。與給藥前比較，給藥后A 組大鼠IVRT 短、LVM 及LVIDs 下降（P均＜0.05）。

表3 給藥后各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)（mm，±s）

表3 給藥后各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)參數(shù)（mm，±s）

組別A組B組LVAWd 2.43 ± 0.36 2.47 ± 0.19 LVPWs 3.72 ± 0.35 3.97 ± 0.38 LVAWs 4.04 ± 0.24 3.64 ± 0.14 LVIDd 7.38 ± 0.0.71 7.97 ± 0.46 LVIDs 3.76 ± 0.69 4.74 ± 0.41 LVPWd 2.67 ± 0.38 2.90 ± 0.57

表4 給藥后兩組大鼠心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)（±s）

表4 給藥后兩組大鼠心室舒張功能參數(shù)、心室收縮功能參數(shù)（±s）

組別A組B組IVRT（ms）16.76 ± 2.83 25.91 ± 1.90 EDT 33.98 ± 4.12 43.28 ± 4.00 E/A 1.16 ± 0.20 1.03 ± 0.15 LVEF（%）76.93 ± 5.02 70.01 ± 6.25 LVFS（%）47.73 ± 4.84 41.59 ± 5.38 LVM（%）1 287.48 ± 111.02 1 455.39 ± 54.79

2.2 兩組大鼠心肌組織MDA、SOD、GSH-PX、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β 含量及NLRP3 相對(duì)表達(dá)量比較 給藥后兩組大鼠心肌組織MDA、SOD、GSH-PX、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β 含量及NLRP3 相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表5。與B 組比較，給藥后A 組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MDA、TGF-β 含量低，SOD、GSH-PX 含量高，NLRP3 相對(duì)表達(dá)量低（P均＜0.05）。

表5 給藥后兩組大鼠心肌組織MDA、SOD、GSH-PX、I型膠原、Ⅲ型膠原、TGF-β含量及NLRP3相對(duì)表達(dá)量（±s）

組別A組B組MDA 2.14 ± 0.05 2.40 ± 0.18 SOD 132.89 ± 10.15 103.23 ± 3.58 GSH-PX 25.24 ± 0.80 19.68 ± 1.73Ⅰ型膠原20 973.38 ± 6 529.96 54 135.42 ± 7 024.49Ⅲ型膠原32.05 ± 4.52 88.56 ± 13.17 TGF-β 355.85 ± 25.13 629.31 ± 153.37

3 討論

長(zhǎng)期高血壓引起以心肌纖維化及心肌細(xì)胞肥大為特征的心臟重塑，促使心肌僵硬度增加，進(jìn)而增加心力衰竭或猝死的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［11］。因此，高血壓患者心臟保護(hù)應(yīng)以改善高血壓心肌重塑為重點(diǎn)。既往高血壓性心肌病的治療主要依賴于良好的血壓控制及神經(jīng)激素抑制劑的應(yīng)用。ACEI/ARB 類降壓藥物已被證實(shí)可通過(guò)阻斷RAAS 系統(tǒng)介導(dǎo)的心室重塑更好的改善患者預(yù)后［12］。但既往臨床研究［4］中發(fā)現(xiàn)，ACEI/ARB、β 受體阻滯劑的應(yīng)用并沒(méi)改善HFpEF患者的預(yù)后或降低病死率。

炎癥反應(yīng)在高血壓的發(fā)生和進(jìn)展中不可或缺，表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)、積累和激活，以及激活的先天免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和自由基，并與高血壓并發(fā)癥如心肌梗死、出血性中風(fēng)和腎損傷有關(guān)［13］。有學(xué)者［14］發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體及其下游的炎癥因子在心力衰竭的動(dòng)物模型中表達(dá)升高，并參與心室重塑的病理過(guò)程。因此，除經(jīng)典的神經(jīng)體液機(jī)制和交感神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)制外，炎癥反應(yīng)在心室重塑中也起著重要的作用［15］。同時(shí)，高血壓導(dǎo)致線粒體功能障礙、增強(qiáng)活性氧/RNS 的產(chǎn)生，促進(jìn)了心肌組織損傷和亞臨床炎癥狀態(tài)的維持［16］。研究［17］表明，高血壓導(dǎo)致的心臟重塑可引起活性氧形成增加，通過(guò)影響硫氧還蛋白相互作用蛋白與硫氧還蛋白之間的失衡，誘導(dǎo)NLRP3 表達(dá)上調(diào)。NLRP3 炎性小體參與炎性細(xì)胞釋放下游炎癥因子如IL-1β、IL-18，從而促進(jìn)更多炎癥因子如TGF-α、IL-6、TGF-β等的釋放［18］。而TGF-β通過(guò)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，在組織纖維化的發(fā)展中起著核心作用［19］。心臟成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原纖維在細(xì)胞間過(guò)度積累，導(dǎo)致心臟順應(yīng)性降低，舒張功能障礙。因此，這種慢性的炎癥狀態(tài)和氧化應(yīng)激有參與了高血壓性心肌重塑過(guò)程，并導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展［20］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在模型組心肌氧化應(yīng)激標(biāo)志物、炎癥因子、NLRP3、TGF-β 水平明顯升高，Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維沉積增多，與既往研究相符。這些病理變化與高血壓心肌肥厚、舒張功能障礙變化相一致。因此阻斷心肌氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)通路，有可能逆轉(zhuǎn)高血壓性心室重塑，改善高血壓患者遠(yuǎn)期心臟預(yù)后。

恩格列凈是一種SGLT2 抑制劑，主要用于改善糖尿病患者的血糖管理，但其用于非糖尿病患者并不增加低血糖風(fēng)險(xiǎn)［7］。研究［21］顯示，SGLT-2 抑制劑可以通過(guò)抑制活性氧/NLRP3/半胱氨酸蛋白酶 1（Caspase-1）信號(hào)通路來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)。SGLT-2抑制劑還可以抑制 NLRP3/凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）通路激活，減輕2 型糖尿病小鼠糖尿病性心肌病的發(fā)展［22］。2023ESC 對(duì)于2021 版《急性和慢性心力衰竭診斷和治療指南》更新建議中，將恩格列凈推薦用于全射血分?jǐn)?shù)保留型心衰的治療，特別是指南首次將恩格列凈推薦用于射血分?jǐn)?shù)輕度減低型心衰（HFmrEF）和HFpEF 心衰的治療［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組左心室質(zhì)量明顯增加、EDT明顯延長(zhǎng)、E/A 明顯下降。在藥物干預(yù)后，與對(duì)照組相比，恩格列凈組大鼠心臟IVRT明顯縮短、左心室質(zhì)量明顯下降，提示恩格列凈可以改善心肌重塑及左室舒張功能。同時(shí)，與對(duì)照組相比，恩格列凈組氧化應(yīng)激、TGF-β、NLRP3炎癥小體及心肌纖維化水平明顯下降。提示恩格列凈可以通過(guò)改善氧化應(yīng)激，阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，改善高血壓大鼠心肌重塑及心室舒張功能。這可能是恩格列凈改善非射血分?jǐn)?shù)減低型心衰患者心衰再入院及心血管死亡結(jié)局的潛在病理機(jī)制。關(guān)于恩格列凈改善炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的機(jī)制，可能來(lái)源于以下途徑：①阻斷NHE：一些炎癥因子可以激活細(xì)胞NHE（Na/H exchanger）交換體，增加細(xì)胞內(nèi)鈉離子水平，而細(xì)胞內(nèi)鈉離子水平的增加會(huì)增加活性氧的產(chǎn)生。恩格列凈通過(guò)阻斷NHE，從而減低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激［24］。②激活A(yù)MPK 通路： AMPK 細(xì)胞通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、能量代謝、自噬的關(guān)鍵通路，激活A(yù)MPK通路可以有效抑制細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激。恩格列凈可提高細(xì)胞內(nèi)AMPK 蛋白表達(dá)水平，改善細(xì)胞能量代謝、降低炎癥因子水平［25］。

綜上所述，恩格列凈灌胃可減輕高血壓大鼠心室舒張功能障礙，降低心肌組織中氧化應(yīng)激、炎癥因子、纖維蛋白含量，其機(jī)制可能與恩格列凈抑制心肌組織氧化應(yīng)激、炎癥因子、組織間纖維蛋白含量有關(guān)。