谷胱甘肽過氧化酶4 激動劑Fer-1 對睡眠碎片化的老年小鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙防治作用觀察

周銀，侍崇龍，金文杰

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，南京 210029

近年來，術(shù)后認(rèn)知功能障礙（Postoperative cognitive dysfunction，POCD）的發(fā)病率逐年上升，已成為老年人及危重癥患者術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見并發(fā)癥之一［1］。POCD是圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙（Perioperative neurocognitive disorders， PND）的一種［2］，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶障礙和認(rèn)知能力下降，可伴有定向障礙、情緒失調(diào)或睡眠障礙［3］。睡眠碎片化（Sleep fragment， SF）與學(xué)習(xí)記憶、言語表達(dá)、注意力、處理速度和執(zhí)行功能的損害有關(guān)。SF 可以促進(jìn)神經(jīng)退行性病變的發(fā)展［4］，但其是否導(dǎo)致圍術(shù)期POCD 的發(fā)生目前尚無研究。線粒體穩(wěn)態(tài)失衡可激活機體的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致中樞的炎癥反應(yīng)［5］。一方面，線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的能量可滿足細(xì)胞生理功能所需；另一方面，線粒體氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)階段可產(chǎn)生活性氧簇（Reactive oxygen species， ROS）。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是一種膜錨定糖蛋白，主要存在于海馬區(qū)、小腦區(qū)和下丘腦等區(qū)域，可清除應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2、OH-及各種巰基，減輕過度應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)［6-7］。研究［11］發(fā)現(xiàn)，阿爾茲海默病（AD）、帕金森?。≒D）患者的大腦認(rèn)知區(qū)域GPX4 活性降低，導(dǎo)致ROS 不能被有效清除，且可影響線粒體ATP 生成。SF 是否通過影響海馬組織GPX4 及線粒體呼吸鏈功能相關(guān)指標(biāo)，導(dǎo)致POCD 的發(fā)生發(fā)展，目前相關(guān)研究較少。2022年2月—2023年3月，我們觀察了GPX4激動劑Ferrostatin-1（Fer-1）對睡眠碎片化老年雄性小鼠POCD 的防治作用，并探討其可能作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器老年雄性SPF級C57BL/6小鼠（18 月齡，30 g 左右）36 只，購于維通利華公司，放置在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件中飼養(yǎng)［（25 ± 2）℃，12 h 晝夜循環(huán)光照，相對濕度50%～60%］，自由飲水?dāng)z食，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行后續(xù)實驗。所有動物實驗均經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會許可（批準(zhǔn)號：IACUC-2008037）。線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ（Complex Ⅰ）活性試劑盒（南京建成生物工程研究所）；魚藤酮（Rotenone）、抗霉素A（Antimycin A）均購自美國Sigma-Aldrich 公司； GPX4 兔多克隆抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司）、β-actin 抗體、BCA 試劑盒、RIPA 緩沖液（上海碧云天公司）；Fer-1蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（Roche 公司，瑞士）；線粒體Mito SOX? 熒光探針（賽默飛世爾科技有限公司）； DAPI 染液（美國Abcam 公司）；超速離心機（美國貝克曼公司）； Seahorse XF24海馬細(xì)胞能量代謝分析儀（美國安捷倫公司）。

1.2 睡眠碎片化的小鼠POCD發(fā)生情況觀察

1.2.1 小鼠分組、睡眠碎片化干預(yù)及脛骨骨折加髓內(nèi)固定術(shù)（Tibial fracture surgery，TFS）方法 取24只小鼠隨機分為實驗組、對照組，每組12只，實驗組小鼠予連續(xù)3 天多平臺水環(huán)境睡眠碎片化處理，對照組小鼠不做特殊處理，正常飼養(yǎng)。第4 天時兩組小鼠均行TFS（常用POCD 動物模型制備方法）。術(shù)后兩組小鼠均正常飼養(yǎng)。

1.2.2 兩組小鼠POCD 發(fā)生情況觀察 術(shù)后第3天取兩組小鼠，采用逃避恐懼實驗和Y-maze 迷宮實驗（Y 迷宮）評估小鼠的逃避恐懼能力和短期記憶能力（代表小鼠POCD 發(fā)生情況）。①逃避恐懼實驗用來評估小鼠海馬記憶能力：TFS 術(shù)前首先進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，將小鼠放入TFC 儀器中自由探索100 s，然后給予小鼠聽覺刺激20 s（80 db，5 kHz），后立即給予足底電擊（0.8 mA），重復(fù)2 次，中間間隔100 s。刺激結(jié)束后30 min 行TFS 手術(shù)，術(shù)后第3 天通過視頻跟蹤軟件（Xeye Fcs， 北京天鳴鴻遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司）自動記錄小鼠300 s內(nèi)除呼吸以外沒有任何運動的僵直反應(yīng)時間。②Y 迷宮用來評估小鼠學(xué)習(xí)記憶和空間認(rèn)知能力。Y 迷宮由三個輻射式迷路箱和一個控制儀器組成。Y 迷宮有三個等長，角度互為120°的臂，將小鼠從起始臂面壁放入，先自由活動10 min，取消擋板，在3 個臂中自由活動5 min， 記錄5 min 內(nèi)每只小鼠的新穎臂穿梭次數(shù)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 兩組小鼠海馬組織GPX4檢測 術(shù)后第3天處死兩組小鼠，取海馬組織。采用WESTERN Blotting 法檢測小鼠海馬組織 GPX4。取海馬組織，勻漿后置于冰上保存30 min，4 ℃、12 000 r/ min 離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量， 電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體，采用增強化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶，以β-actin 為內(nèi)參，測算GPX4 蛋白。重復(fù)測算3次，取平均值。

1.2.4 兩組小鼠腦組織線粒體呼吸鏈功能檢測采用SeahorseXF24細(xì)胞能量代謝儀檢測腦組織線粒體呼吸鏈功能。取獲取海馬、前額皮質(zhì)、小腦組織，提取完整線粒體，在EP 加入500 μL 的MHSE 溶液，機械垂直上下研磨20 次，于800 g 離心10 min，取上清液，再12 000 g 離心10 min，棄上清。加入400 μL的MAS 溶液，充分吹勻，取10 μL 液體，BCA 法測蛋白含量，加入MAS液調(diào)整至600 μg/mL，上樣至檢測板，30 μg/50 μL 孔，對照孔加入50 μL 的MAS。2 000 g 離心20 min，充分使線粒體覆蓋底層。在校正板依次加入ADP、Olyomycin、FCCP、Rotenone&antimycin A 等激發(fā)或抑制呼吸鏈功能試劑，置換含線粒體板至XF24 檢測線粒體功能，測算線粒體基礎(chǔ)呼吸率、ADP 激發(fā)呼吸率及最大呼吸率，實驗重復(fù)測算3次，取平均值。

1.2.5 兩組海馬組織線粒體能量代謝指標(biāo)Complex Ⅰ及ROS 檢測 ①采用ELISA 法檢測海馬組織Complex Ⅰ活性。取海馬組織，參照ComplexⅠ活性測試試劑盒的說明書操作，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依次測量各孔的光密度（OD 值），以O(shè)D值代表Complex Ⅰ活性。所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，實驗重復(fù)測算3次，取平均值。②利用線粒體熒光探針Mito SOX 測算海馬組織線粒體ROS。按照說明書的實驗步驟，將海馬組織神經(jīng)元以 5×105/mL 接種于 96 孔板，PBS 洗去培養(yǎng)基。培養(yǎng)1天后吸出培養(yǎng)基，加入濃度5 μmol/L 的Mito SOX 工作液2 mL，在37 ℃避光條件下孵育15 min，用熒光光度計測算熒光強度，代表海馬組織ROS 含量。重復(fù)測算3次，取平均值。

1.3 加入Fer-1 對睡眠碎片化老年小鼠POCD 的防治作用觀察 另取12 只老年雄性小鼠分為1、2 組，每組各6 只。兩組均進(jìn)行連續(xù)3 天多平臺水環(huán)境睡眠碎片化。1 組小鼠睡眠碎片化處理的同時每天腹腔注射10 mg/kg 的Fer-1，1 次/天，連續(xù)3 次；2 組腹腔注射同體積的生理鹽水，1 次/天，連續(xù)3 次。第4天兩組均行TFS手術(shù)，TFS術(shù)后第3天采用逃避恐懼實驗測試和Y-maze實驗觀察兩組小鼠POCD發(fā)生情況，處死兩組小鼠取海馬組織，利用線粒體熒光探針Mito SOX 測算海馬組織線粒體ROS。重復(fù)測算3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 25.0 統(tǒng)計軟件行數(shù)據(jù)處理。采用Kruskal-Wallis 檢驗計量資料的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計量資料以-x±s表示，組間比較采用單因素方差分析、t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后第3 天實驗組與對照組小鼠僵直反應(yīng)時間、進(jìn)入新穎臂百分比比較 術(shù)后第3 天實驗組、對照組僵直反應(yīng)時間分別為（112.00 ± 24.58）、（193.25 ± 20.02）s，進(jìn)入新穎臂百分比分別為46.08% ± 7.39%、56.41% ± 8.81%，二者比較，P均＜0.05。

2.2 實驗組與對照組小鼠海馬組織GPX4 相對表達(dá)量比較 術(shù)后第3 天實驗組、對照組小鼠海馬組織GPX4 相對表達(dá)量分別為0.44 ± 0.09、1.00 ±0.04，二者比較，P＜0.01。

2.3 實驗組與對照組小鼠腦組織線粒體基礎(chǔ)呼吸率、ADP 激發(fā)呼吸率及最大呼吸率比較 術(shù)后第3天兩組小鼠腦組織線粒體基礎(chǔ)呼吸率、ADP 激發(fā)呼吸率及最大呼吸率見表1。由表1可見，與對照組比較，術(shù)后第3 天實驗組小鼠腦組織線粒體體基礎(chǔ)呼吸率、ADP 激發(fā)呼吸率及最大呼吸率低（P均＜0.05）。

表1 術(shù)后第3天實驗組與對照組小鼠腦組織線粒體基礎(chǔ)呼吸率、ADP激發(fā)呼吸率及最大呼吸率（%，-x ± s）

2.4 實驗組與對照組小鼠海馬組織線粒體Complex Ⅰ活性和ROS 含量比較 術(shù)后第3 天實驗組、對照組Complex Ⅰ活性分別為（112.00 ± 24.58）、（193.25 ± 20.02）s，ROS 相對表達(dá)量分別為1.56 ±0.27、1.00 ± 0.17。與對照組比較，術(shù)后第3 天實驗組小鼠海馬組織Complex Ⅰ活性低、ROS 含量高（P均＜0.05）。

2.5 1 組和2 組小鼠僵直反應(yīng)時間、進(jìn)入新穎臂百分比及海馬組織ROS 含量 結(jié)果見表2。由表2 可見，與2 組比較，術(shù)后第3 天1 組小鼠僵直反應(yīng)時間長、進(jìn)入新穎臂百分比高、海馬組織ROS 含量低（P均＜0.05）。

表2 術(shù)后第3天1組和2組小鼠僵直反應(yīng)時間、進(jìn)入新穎臂百分比及海馬組織ROS含量（-x ± s）

3 討論

臨床研究［12］發(fā)現(xiàn)老年人圍術(shù)期容易出現(xiàn)睡眠障礙，表現(xiàn)為入睡困難和睡眠破碎，同時發(fā)生睡眠障礙的老年患者術(shù)后更易發(fā)生POCD。有學(xué)者［13］對C57BL/6J成年小鼠進(jìn)行睡眠剝奪，發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪可誘導(dǎo)海馬中樞炎癥，導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙。但也有研究［14］提出不同觀點，急性的睡眠碎片化可導(dǎo)致中樞炎癥，但是不導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能改變。針對上述研究的異同，我們通過建立小鼠睡眠碎片化模型和脛骨骨折加髓內(nèi)固定術(shù)手術(shù)模型，術(shù)后評估18個月齡的C57BL/6J小鼠的認(rèn)知功能，發(fā)現(xiàn)睡眠碎片化組小鼠麻醉術(shù)后72 h 學(xué)習(xí)記憶減退，認(rèn)知功能顯著降低，說明睡眠碎片化可導(dǎo)致老年小鼠POCD 的發(fā)生發(fā)展。

線粒體是能量代謝的中樞，一方面，產(chǎn)生能量滿足細(xì)胞生理功能所需，另一方面，線粒體氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)階段可產(chǎn)生活性氧。一旦線粒體代謝紊亂產(chǎn)生過多 ROS 導(dǎo)致細(xì)胞損害，輕則引起神經(jīng)功能改變，重則引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成細(xì)胞死亡和神經(jīng)退行性變。良好的睡眠可調(diào)控線粒體功能及ATP 合成的平衡，促進(jìn)海馬區(qū)結(jié)構(gòu)可塑性，加強記憶形成［15］。而SF 可導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元突觸密度降低并減少突觸的有效性，損害認(rèn)知功能［16］。有研究［17］發(fā)現(xiàn)，手術(shù)可引起老年大鼠中樞 ROS、炎癥因子大量釋放，導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能下降。我們推測睡眠碎片化可損害線粒體呼吸鏈功能，如線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶活性下降、電子傳遞異常、ROS 積累等。

慢性睡眠碎片化引發(fā)線粒體能量代謝失衡，釋放大量 ROS，呼吸鏈 Complex Ⅰ活性下降，表明睡眠碎片化引起線粒體能量代謝和呼吸鏈顯著受損，氧化應(yīng)激損傷加強。睡眠碎片化一方面通過損害線粒體呼吸鏈電子傳遞，降低復(fù)合體酶的活性，造成線粒體呼吸功能的異常，最終引起ATP 生成障礙，ROS 大量累積，影響能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)；另一方面老年患者自身神經(jīng)退行性變增加，腦內(nèi)線粒體功能缺陷，氧化應(yīng)激增強，導(dǎo)致葡萄糖、脂肪、氨基酸代謝受阻，進(jìn)一步損害神經(jīng)元的突觸可塑性，學(xué)習(xí)記憶減退。GPX4 可通過調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激維持正常發(fā)展和細(xì)胞代謝［18］。衰老大腦特別易于受到氧化應(yīng)激傷害，而GPX4 是腦部的主要的抗氧化酶，可直接清除ROS、RNS 等，其水平過低可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累，在神經(jīng)退行性變疾病進(jìn)展中起著重要作用。為了進(jìn)一步研究睡眠碎片化是直接作用線粒體呼吸鏈，還是通過抑制GPX4 活性導(dǎo)致ROS 增加，間接影響線粒體呼吸能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SF 組小鼠海馬區(qū)GPX4 蛋白含量明顯降低，表明睡眠碎片化通過抑制海馬區(qū)GPX4 的表達(dá)，導(dǎo)致腦內(nèi)ROS 無法及時有效清除，提示GPX4 可能是導(dǎo)致圍術(shù)期睡眠障礙患者認(rèn)知功能損傷的靶點。

為了進(jìn)一步驗證GPX4 在睡眠碎片化導(dǎo)致POCD 中的作用，我們對慢性睡眠碎片化模型小鼠腹腔注射Fer-1后，發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)ROS水平出現(xiàn)一定的下降，小鼠的認(rèn)知功能也得到明顯的改善。這些結(jié)果表明GPX4 表達(dá)的上升減輕了海馬區(qū)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激水平，改善小鼠的術(shù)后認(rèn)知記憶。正常情況下，在缺乏GSH 活性時，GPX4 仍可代償處理胞質(zhì)和線粒體產(chǎn)生的ROS，隨著ROS 的增加，清除ROS 的GPX4 酶活性理應(yīng)相應(yīng)增強，蛋白表達(dá)增加。但我們的結(jié)果表明，睡眠碎片化導(dǎo)致線粒體呼吸鏈損傷產(chǎn)生的ROS 增加時，海馬區(qū)GPX4 蛋白表達(dá)量反而出現(xiàn)明顯的降低，表明GPX4 蛋白是睡眠碎片化作用的直接靶點，腹腔注射Fer-1 后，海馬區(qū)ROS水平得到控制，也驗證我們這一結(jié)論。因此，睡眠碎片化可能通過直接抑制GPX4 活性，導(dǎo)致線粒體內(nèi)產(chǎn)生的大量ROS 無法有效清除，損害線粒體電子呼吸鏈的傳遞功能，導(dǎo)致線粒體呼吸代謝儲備及能量產(chǎn)生嚴(yán)重受損，進(jìn)而產(chǎn)生更多的ROS，二者形成正反饋，共同導(dǎo)致了POCD 的發(fā)生發(fā)展?？紤]到GPX4是鐵死亡的標(biāo)志性蛋白，F(xiàn)er-1 也可以通過螯合鐵，清除脂質(zhì)過氧化物，捕獲氧自由基而產(chǎn)生抗鐵死亡作用［19］。慢性睡眠碎片化是否是通過抑制GPX4 誘導(dǎo)鐵死亡導(dǎo)致POCD 的發(fā)生，尚需要進(jìn)一步實驗來證明。

綜上所述，睡眠碎片化的老年小鼠TFS 術(shù)后POCD 程度較重，海馬組織GPX4 表達(dá)降低，腦組織線粒體呼吸鏈功能降低，海馬組織Complex Ⅰ活性低、ROS 含量高。Fer-1 可改善睡眠碎片化的老年雄性小鼠POCD。睡眠碎片化可能通過抑制小鼠海馬組織GPX4 活性，促進(jìn)海馬組織ROS 積累，抑制線粒體呼吸鏈功能，促進(jìn)POCD 發(fā)生發(fā)展。但是本研究并未進(jìn)一步驗證GPX4 與線粒體呼吸鏈之間的因果關(guān)系，今后需進(jìn)一步深入探討睡眠碎片化在POCD發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制。