茯苓酸對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63的增殖凋亡、遷移侵襲影響及PERK/CCAAT信號(hào)通路調(diào)控作用

施擎宇，黃帆，王冬明

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海 200032

骨肉瘤是骨科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，多發(fā)于股骨、脛骨、骨盆等部位，具有高度異質(zhì)性［1-2］。目前臨床治療骨肉瘤主要方法有外科手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)藥物治療、靶向分子治療等，但由于化療藥物的不良反應(yīng)較多且嚴(yán)重，手術(shù)治療后患者肢體功能表現(xiàn)差異加大，故尋找不良反應(yīng)低、安全有效的新型治療藥物和治療方法是目前的研究熱點(diǎn)［3-4］。茯苓酸（pachymic acid，PA）是中藥茯苓的主要活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗高血糖、抗病毒及鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理作用［5］。PA 可抑制胃癌、肝癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤的增殖、遷移。但PA 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響目前尚未有研究報(bào)道。在腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)過(guò)程中，缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏等進(jìn)一步導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）［6］。蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）/CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/CHOP）信號(hào)通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮重要作用，可通過(guò)上調(diào)CHOP、Bcl-2和其他細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7-8］。PA 是否通過(guò)調(diào)控PERK/CHOP 信號(hào)通路影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡，目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道。為此，我們觀察了PA 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。PA 購(gòu)自上海晶都生物技術(shù)有限公司；PERK 抑制劑GSK2606414 購(gòu)自湖南華騰制藥有限公司；胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；MTT 試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Transwell 小室購(gòu)自Corning公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自德國(guó)Merck 公司；TRIzol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；RT-qPCR 試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；PERK、p-PERK、真核生物起始因子2α（eIF2α）、p-eIF2α、活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）、CHOP、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、BCL2相關(guān)X蛋白（Bax）、GAPDH一抗和相應(yīng)二抗購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.2 PA 受試濃度篩選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞接種于96 孔板中（2×104個(gè)/孔），分為5 組，每組6個(gè)復(fù)孔，加入終濃度為0、5、10、20、40、80、160 μmol/L 的PA 處理48 h，每孔加入10 μL 的MTT溶液，孵育4 h，再加入100 μL DMSO溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)算各組570 nm 處吸光度值（OD570nm），測(cè)算各組細(xì)胞增殖活力（%）。結(jié)果顯示，與0 μmol/L 比較，40、80、160 μmol/L 的PA 可顯著降低MG-63 細(xì)胞的增殖活力（P均＜0.05），且160 μmol/L 的PA 對(duì)MG-63 細(xì)胞增殖活性的影響與80 μg/mL 的PA 接近。因此，最終選擇20、40、80 μmol/L 的PA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MG-63細(xì)胞分組及PA 給予方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63 細(xì)胞，5×103/孔接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為低濃度PA 組（PA-L 組）、中濃度PA組（PA-M 組）、高濃度PA 組（PA-H 組）、高濃度PA +PERK 抑制劑GSK2606414 組（PA-H + GSK2606414組）及對(duì)照組，每組6 個(gè)復(fù)孔。PA-L 組、PA-M 組、PA-H 組分別加入終濃度20、40、80 μmol/L 的PA［9］培養(yǎng)，PA-H + GSK2606414 組加入終濃度40 μmol/L 的PA + 5 μmol/L 的GSK2606414［10］培養(yǎng)，對(duì)照組用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT 法。分別于培養(yǎng)24、48 及72 h 時(shí)取各組細(xì)胞，每孔加入10 μL 的5 g/L MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，加入100 μL 的DMSO 溶液，振搖后培養(yǎng)10 min，待底部結(jié)晶完全溶解后，采用酶標(biāo)儀測(cè)算570 nm 處的吸光度OD570nm值，以O(shè)D570nm代表細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3 次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞遷移情況觀察 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)24 h 時(shí)取各組細(xì)胞，用無(wú)菌20 μL 移液槍槍頭垂直畫(huà)出一道劃痕，之后用PBS 洗滌細(xì)胞3次，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用倒置顯微鏡觀察0、48 h 時(shí)各組細(xì)胞的遷移情況，并使用Image J 軟件進(jìn)行分析測(cè)算各組細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h寬度-48 h 寬度）/0 h 寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3 次，取平均值。

1.6 各組細(xì)胞侵襲情況觀察 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)48 h 時(shí)取各組細(xì)胞，5×104/mL 加入150 μL細(xì)胞懸液到Transwell 小室上室（稀釋的Matrigel 基質(zhì)膠包被）中。利用倒置光學(xué)顯微鏡觀察，每個(gè)小室隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行拍照，并進(jìn)行侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.7 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。培養(yǎng)48 h時(shí)取各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液后離心收集細(xì)胞，用PBS 洗滌2 次。加入100 μL 的 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，之后分別加入5 μL 的 Annexin V-FITC 和5 μL PI 于室溫下避光反應(yīng)20 min。采用流式細(xì)胞儀測(cè)算各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3次，取平均值。

1.8 各組細(xì)胞PERK mRNA、CHOP mRNA 檢測(cè) 采用RT-qPCR 法。培養(yǎng)48 h 時(shí)取各組細(xì)胞，加入TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。引物序列設(shè)計(jì)如下：PREK 上游引物：5’-ACGATGAGACAGAGTTGCGAC-3’，下游引物：5’-ATCCAAGGCAGCAATTCTCCC-3’；CHOP上游引物：5’-CTTGACCCTGCTTCTCTGGCTT-3’，下游引物：5’-TTCCGTTTCCTGGTTCTCCCTT-3’；β-actin上游引物：5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物：5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3’。以β-actin 為內(nèi)參，以2-ΔΔCt代表PERK mRNA、CHOP mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3 次，取平均值。

1.9 各組胞PERK/CHOP 信號(hào)通路相關(guān)蛋白與凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用WESTERN Blotting 法。培養(yǎng)48 h時(shí)取各組細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定總蛋白濃度。定量蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后將膜與p-PERK（1∶500）、PERK（1∶500）、p-eIF2α（1∶500）、eIF2α（1∶500）、ATF4（1∶200）、CHOP（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育過(guò)夜。次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（1∶5 000）在室溫下孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯色。以GAPDH 作為內(nèi)參，在凝膠成像儀下進(jìn)行曝光，利用Image Lab 軟件測(cè)算目標(biāo)蛋白的灰度值，以灰度值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)算3 次，取平均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料通過(guò)Shapiro-Wilk 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD570nm值比較 培養(yǎng)24、48、72 h 時(shí)各組細(xì)胞OD570nm值比較見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各組MG-63細(xì)胞OD570nm值比較（±s）

表1 培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)各組MG-63細(xì)胞OD570nm值比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與PA-L組比較，#P＜0.05；與PA-M組比較，&P＜0.05；與PA-H組比較，△P＜0.05。

組別PA-L組PA-M組PA-H組PA-H + GSK2606414組對(duì)照組OD570nm值培養(yǎng)72 h 0.83 ± 0.08 0.66 ± 0.06*#0.43 ± 0.04*#&0.69 ± 0.07△0.87 ± 0.08培養(yǎng)24 h 0.27 ± 0.02 0.26 ± 0.03 0.25 ± 0.02 0.26 ± 0.02 0.28 ± 0.03培養(yǎng)48 h 0.59 ± 0.06 0.48 ± 0.04*#0.31 ± 0.03*#&0.52 ± 0.05△0.63 ± 0.06

2.2 各組細(xì)胞遷移率比較 PA-L 組、PA-M 組、PA-H 組、PA-H + GSK2606414 組及對(duì)照組細(xì)胞遷移率分別為51.07% ± 4.96%、40.27% ± 4.25%、26.28% ± 2.91%、45.34% ± 4.66%^、54.20% ±5.89%，與對(duì)照組比較，PA-M 組、PA-H 組細(xì)胞的細(xì)胞遷移率低（P 均＜0.05）；與PA-L 組比較，PA-M 組、PA-H 組細(xì)胞遷移率低（P均＜0.05）；與PA-M 組比較，PA-H 組細(xì)胞遷移率低（P＜0.05）；與PA-H 組比較，PA-H + GSK2606414 組細(xì)胞遷移率高（P＜0.05）。

2.3 各組細(xì)胞侵襲數(shù)比較 PA-L 組、PA-M 組、PA-H 組、PA-H + GSK2606414 組及對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為（104.35 ± 7.54）、（83.81 ± 6.38）、（59.92 ± 5.33）、（87.64 ± 6.89^）、（112.59 ± 8.20）個(gè)/視野。與對(duì)照組比較，PA-M 組、PA-H 組細(xì)胞侵襲數(shù)目少（P均＜0.05），PA-L 組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與PA-L 組比較，PA-M 組、PA-H 組細(xì)胞的細(xì)胞侵襲數(shù)少（P均＜0.05）；與PA-M組比較，PA-H組細(xì)胞的細(xì)胞侵襲數(shù)少（P＜0.05）；與PA-H組比較，PA-H+ GSK2606414組細(xì)胞的細(xì)胞侵襲數(shù)多（P＜0.05）。

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較 PA-L 組、PA-M 組及PA-H 組、PA-H + GSK2606414 組及對(duì)照組細(xì)胞遷移率分別為6.21% ± 0.69%、13.54% ± 0.95%、22.36% ± 1.47%、12.04% ± 0.85%△、4.67% ±0.63%，與對(duì)照組比較，PA-M 組、PA-H 組細(xì)胞凋亡率高（P均＜0.05）；與PA-L 組比較，PA-M 組、PA-H組細(xì)胞凋亡率高（P均＜0.05）；與PA-M組比較，PA-H組細(xì)胞凋亡率高（P＜0.05）；與PA-H 組比較，PA-H +GSK2606414組細(xì)胞凋亡率低（P＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞PERK mRNA、CHOP mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 各組細(xì)胞PERK mRNA、CHOP mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞PERK mRNA、CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 各組細(xì)胞PERK mRNA、CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與PA-L 組比較，#P＜0.05；與PA-M組比較，&P＜0.05；與PA-H組比較，△P＜0.05。

CHOP mRNA 1.05 ± 0.09 1.53 ± 0.15*#1.92 ± 0.19*#&1.50 ± 0.15△1.00 ± 0.00組別PA-L組PA-M組PA-H組PA-H + GSK2606414組對(duì)照組PERK mRNA 1.08 ± 0.08 1.42 ± 0.14*#1.87 ± 0.19*#&1.38 ± 0.14△1.00 ± 0.00

2.6 各組細(xì)胞PERK/CHOP 信號(hào)通路與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 各組細(xì)胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞PERK/CHOP信號(hào)通路與凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組細(xì)胞PERK/CHOP信號(hào)通路與凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與PA-L組比較，#P＜0.05；與PA-M組比較，&P＜0.05；與PA-H組比較，△P＜0.05。

組別PA-L組PA-M組PA-H組PA-H + GSK2606414組對(duì)照組Bcl-2 0.74 ± 0.07 0.47 ± 0.05*#0.26 ± 0.03*#&0.56 ± 0.05△0.78 ± 0.07 p-PERK/PERK 0.28 ± 0.03 0.48 ± 0.04*#0.79 ± 0.07*#&0.43 ± 0.04△0.24 ± 0.02 p-eIF2α/eIF2α 0.25 ± 0.02 0.53 ± 0.05*#0.83 ± 0.08*#&0.49 ± 0.05△0.21 ± 0.02 ATF4 0.29 ± 0.03 0.55 ± 0.05*#0.81 ± 0.08*#&0.51 ± 0.05△0.26 ± 0.03 CHOP 0.35 ± 0.03 0.59 ± 0.06*#0.92 ± 0.09*#&0.54 ± 0.05△0.32 ± 0.03 Bax 0.30 ± 0.03 0.61 ± 0.06*#0.88 ± 0.08*#&0.57 ± 0.06△0.28 ± 0.03

3 討論

骨肉瘤屬于原發(fā)性的惡性腫瘤，常發(fā)于兒童或青少年人群，且骨肉瘤的復(fù)發(fā)率與轉(zhuǎn)移率較高，手術(shù)切除治療骨肉瘤的預(yù)后不佳［11］。

PA 是茯苓中提取的主要活性成分，其抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注。樊燕青等［12］研究發(fā)現(xiàn)PA 能通過(guò)抑制CXCR4 表達(dá)降低舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。JIANG 等［13］研究發(fā)現(xiàn)PA 抑制了肝癌細(xì)胞HepG2 和Huh7 的生長(zhǎng)與遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40、80 μmol/L 的PA處理可對(duì)照組比較降低MG-63 細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞遷移率、細(xì)胞侵襲數(shù)目以及細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)，升高細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞Bax 蛋白表達(dá)；這些結(jié)果均說(shuō)明PA 對(duì)骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用，并可誘導(dǎo)其凋亡，表明PA 可能作為治療骨肉瘤的潛在藥物。

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)早期階段，為了維持細(xì)胞正常功能，細(xì)胞將阻止未折疊蛋白合成或促進(jìn)正確的蛋白折疊；當(dāng)適應(yīng)性反應(yīng)不足以克服內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞凋亡途徑將被啟動(dòng)，并激活CHOP、Bcl-2 的表達(dá)，即激活PERK/CHOP 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］。當(dāng)PERK/CHOP 信號(hào)通路啟動(dòng)時(shí)，激活的PERK 會(huì)引發(fā)UPR 相關(guān)促凋亡信號(hào)的啟動(dòng)，提高磷酸化eIF2α 水平，激活A(yù)TF4 并啟動(dòng)適應(yīng)性信號(hào)通路，抑制蛋白質(zhì)合成和翻譯；CHOP 過(guò)表達(dá)可以下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax 蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］。YANG 等［16］研究發(fā)現(xiàn)PA 能通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移，并誘導(dǎo)其凋亡，起到抗宮頸癌作用，表明PA可通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮抗癌活性。在本研究中，40、80 μmol/L 的PA 處理可上調(diào)MG-63 細(xì)胞中比較PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白表達(dá)和eIF2α磷酸化水平，降低Bcl-2蛋白表達(dá)，說(shuō)明PA 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG-63 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用可能與激活PERK/CHOP 信號(hào)通路有關(guān)。本研究在80 μmol/L的PA 處理的基礎(chǔ)上使用PERK 抑制劑GSK2606414 干預(yù)MG-63 細(xì)胞，結(jié)果顯示，GSK2606414 減弱了80 μmol/L 的PA 對(duì)MG-63 細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用；提示PA 可能通過(guò)激活PERK/CHOP 信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63 細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PA 可抑制可能通過(guò)激活PERK/CHOP 信號(hào)通路表達(dá)，抑制MG-63 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。然而，本研究只在細(xì)胞水平上初步探究了PA 的抗骨肉瘤作用及PERK/CHOP信號(hào)通路在其中的作用，后續(xù)還需進(jìn)一步深入研究。