兩株秦嶺野生黑木耳菌株分離鑒定及馴化試驗

曹建剛 李存玲 劉 陽 毛儀楠 陳再民 陳鵬博

（陜西省商洛市農(nóng)業(yè)科學研究所，陜西 商洛 726000）

黑木耳又稱木耳、光木耳、云耳、樹耳、木娥等，為擔子菌門、木耳目、木耳科、木耳屬真菌[1]。陜西省商洛市一直將食用菌產(chǎn)業(yè)列為脫貧攻堅、鄉(xiāng)村振興的重點特色產(chǎn)業(yè)，2022 年以來更是將食用菌產(chǎn)業(yè)列為“菌果藥畜茶酒”六大特色產(chǎn)業(yè)之首，食用菌作為助推商洛市鄉(xiāng)村振興的“大產(chǎn)業(yè)”，發(fā)展黑木耳產(chǎn)業(yè)是重中之重。商洛市2020年袋栽木耳1.05億袋，干品產(chǎn)量5 270 t，產(chǎn)值5.2 億元；2021 年栽培木耳1.41億袋，干品產(chǎn)量5 600 t，產(chǎn)值5.4億元；2022年栽培木耳1.55 億袋，干品產(chǎn)量7 600 t，產(chǎn)值7.3 億元。商洛市現(xiàn)有規(guī)?；径a(chǎn)基地87處，木耳生產(chǎn)大棚3600 個，年產(chǎn)1 000 萬袋以上的菌包生產(chǎn)線7 條，木耳生產(chǎn)企業(yè)20 多家，合作社35 個，木耳產(chǎn)業(yè)從業(yè)人員5 000 多人。以柞水縣、山陽縣、商州縣、鎮(zhèn)安縣為主，輻射全市的木耳產(chǎn)業(yè)布局已基本形成，商洛木耳產(chǎn)業(yè)得到高質(zhì)量快速發(fā)展，“小木耳”切實做成“大產(chǎn)業(yè)”，為商洛市鞏固脫貧攻堅成果與推動鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略全面實施發(fā)揮重要作用。

商洛市要做大做強黑木耳產(chǎn)業(yè)，推動商洛市木耳產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展，加快黑木耳種質(zhì)創(chuàng)新，做強農(nóng)業(yè)“芯片”（黑木耳優(yōu)良新品種選育）為首要任務。商洛市地處秦嶺腹地，野生黑木耳種質(zhì)資源豐富，采集馴化黑木耳野生菌株，既可以快速解決商洛市主栽黑木耳品種短缺、依賴外省品種的問題，也可以為黑木耳雜交育種提供有效的種質(zhì)資源[2]。為此筆者對采自陜西省商洛市丹鳳縣、山陽縣的兩株秦嶺野生黑木耳進行組織分離、分子生物學鑒定及栽培試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）供試菌株：丹鳳野生黑木耳菌株，采自商洛市丹鳳縣巒莊鎮(zhèn)老林溝林場（圖1）；山陽野生黑木耳菌株，采自山陽縣小河口鎮(zhèn)小河口街村山坡；對照菌株為黑威15，商洛市主栽品種，商洛市農(nóng)科所食用菌研究室保存。

圖1 野生黑木耳（拍攝地丹鳳縣）生態(tài)照

（2）供試培養(yǎng)基：①綜合馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，自來水定容至1 000 mL。②原種（栽培種）培養(yǎng)料配方為木屑85%，麩皮12%，白糖1%，石膏1%，石灰1%。料含水量58%～60%。③栽培袋培養(yǎng)料配方為木屑80%，麩皮15%，豆粕3%，石膏1%，石灰1%。料含水量58%～60%。

1.2 試驗方法

1.2.1 子實體形態(tài)觀察

取完整子實體部分，觀察并描述其表面性狀、結構、顏色，并進行形態(tài)學特征初步鑒定[3]。

1.2.2 野生菌株的組織分離及菌種的制備

取干耳泡24 h，用75%酒精浸泡2～3 min，用無菌水反復清洗干凈后，再用濾紙吸干表面水分，用剪刀將耳片剪成小耳片，用接種針挑取小耳片至PDA 平板，26 ℃培養(yǎng)，待分離組織長出菌絲后純化1～2 次轉(zhuǎn)入PDA 斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，即可獲得母種。母種接種到原種培養(yǎng)基上發(fā)菌后至長滿袋即可獲得原種（栽培種）。

1.2.3 野生黑木耳菌株ITS全序列分析

將丹鳳野生黑木耳菌株、山陽野生黑木耳菌株分別轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，挑選純化、生長健壯的兩株野生黑木耳菌株送往上海生工生物工程股份有限公司進行ITS全序列分析與分子生物學鑒定。

1.2.4 拮抗試驗

將兩株野生黑木耳菌株與對照菌株黑威15 兩兩拮抗培養(yǎng)試驗（26 ℃下黑暗培養(yǎng)），觀察拮抗反應。3次重復。

1.2.5 野生黑木耳菌株菌絲培養(yǎng)特性觀察

1.2.5.1 PDA平板培養(yǎng)菌絲觀察

將供試菌株分別接至PDA 平板（直徑9 cm），26 ℃下黑暗培養(yǎng)，測定菌絲生長速度及記錄長勢。母種菌絲生長速度（cm/d）=菌絲培養(yǎng)皿內(nèi)直線生長量（cm）/菌絲生長天數(shù)（d）。母種（栽培袋）菌絲生長速度采用Microsoft Excel 2021 進行數(shù)據(jù)處理，采用SAS 8.0進行方差分析和Duncan檢測。

1.2.5.2 原種料袋菌絲生長觀察

將供試菌株母種接種至原種料袋，26 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個菌株各15袋。觀察并記錄菌絲長勢及抗雜能力。

1.2.5.3 栽培料袋菌絲生長觀察

將供試菌株原種接種至栽培料袋（塑料袋規(guī)格為16 cm×37 cm×0.0036 cm），26 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個菌株各100袋。測定菌絲生長速度，記錄長勢、抗雜能力。栽培袋內(nèi)菌絲生長速度（cm/d）=菌絲生長量（cm）/菌絲滿袋用時（d）。

1.2.6 出耳試驗

栽培袋菌絲滿袋經(jīng)過后熟，刺孔后移至大棚內(nèi)地栽出耳。觀察記錄比較各菌株現(xiàn)芽情況、出耳表現(xiàn)，觀察子實體外觀、顏色，統(tǒng)計產(chǎn)量。

2 結果與分析

2.1 兩株秦嶺野生黑木耳菌株ITS全序列分析

采用試劑盒提取基因組DNA，擴增兩株秦嶺野生黑木耳菌株ITS 序列，可發(fā)現(xiàn)均有大小約600 bp的單一條帶，測序結果兩株秦嶺野生黑木耳菌株的ITS 序列大小均為576 bp（圖2）。通過BLAST 分析，丹鳳野生黑木耳菌株（Genbank 登錄號SUB13797248）與陜西理工大學Qian X T（2015）發(fā)現(xiàn)的黑木耳（KT964887.1）相似性達99.65%，為木耳屬，黑木耳；山陽野生黑木耳菌株（Genbank 登錄號SUB13797271）與西北農(nóng)林科技大學Yu Z（2008）發(fā)現(xiàn)的黑木耳（EU520194.1）相似性達99.83%，為木耳屬，黑木耳。

圖2 兩株野生菌株ITS-PCR瓊脂糖電泳圖

2.2 拮抗試驗結果

由表1可知，丹鳳野生黑木耳菌株、山陽野生黑木耳菌株與對照菌株黑威15均有明顯的拮抗線，丹鳳野生黑木耳菌株與山陽野生黑木耳菌株也有明顯的拮抗線，三者之間互有拮抗反應（圖3），說明他們親緣較遠。

表1 拮抗試驗結果

圖3 供試黑木耳菌株拮抗反應（左為平板正面，右為平板反面）

2.3 不同基質(zhì)菌絲培養(yǎng)特性觀察結果

由表2 可知，丹鳳野生黑木耳菌株平板培養(yǎng)菌絲潔白、濃密、整齊，山陽野生黑木耳菌株菌絲潔白、絨毛狀、整齊；菌絲生長速度，山陽野生黑木耳菌株與黑威15差異顯著；丹鳳野生黑木耳菌株與山陽野生黑木耳菌株、丹鳳野生黑木耳菌株與黑威15母種菌絲生長速度之間的差異均不顯著。

表2 供試黑木耳菌株平板培養(yǎng)菌絲生長特性

由表3 可知，原種料袋內(nèi)供試黑木耳菌株菌絲顏色、長勢差異不大，但丹鳳野生黑木耳菌株抗雜能力強，山陽野生黑木耳菌株抗雜能力弱。

表3 供試黑木耳菌株原種培養(yǎng)結果

由表4可知，丹鳳野生黑木耳菌株、黑威15抗雜能力強，山陽野生黑木耳菌株抗雜能力一般（同原種培養(yǎng)結果一致）；山陽野生黑木耳菌株菌絲生長速度顯著快于丹鳳野生黑木耳菌株及黑威15菌株。

表4 供試黑木耳菌株栽培料袋菌絲培養(yǎng)結果

2.4 出耳試驗結果

2.4.1 供試黑木耳菌株催芽結果

供試黑木耳菌株栽培袋菌絲長滿袋經(jīng)過后熟，刺孔進棚開始集中催芽，催芽時保持溫度15～25 ℃，空氣相對濕度70%～90%，視天氣情況通風，做到“保溫保濕小通風”[4]。

由表5可知，山陽野生黑木耳菌株耳基、耳芽形成快、早，整齊；丹鳳野生黑木耳菌株耳基、耳芽形成快、居中（較山陽野生黑木耳菌株晚3～5 d），較整齊；對照黑威15菌株耳基、耳芽形成慢、晚，較整齊。

表5 供試黑木耳菌株催芽情況

2.4.2 供試黑木耳菌株產(chǎn)量及子實體性狀

由表6可知，丹鳳野生黑木耳菌株單片、耳大耳薄，顏色黃、產(chǎn)量高，抗高溫，少筋或無筋，早熟；山陽野生黑木耳菌株單片、耳中等薄，產(chǎn)量低，不耐大水、高溫，無筋，早熟；黑威15菌株（對照）單片、個大肉厚，產(chǎn)量一般，大筋，中熟（圖4、圖5）。

表6 供試黑木耳菌株產(chǎn)量及子實體性狀

圖4 試驗黑木耳菌株出耳狀態(tài)[自左至右為山陽野生菌株、丹鳳野生菌株、黑威15（CK）]

圖5 人工栽培的丹鳳野生黑木耳菌株子實體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

山陽野生黑木耳菌株耳片腹面黑褐色，背面瓦灰色（圖6），耳狀，邊緣不規(guī)則，無筋，單耳質(zhì)量（干）0.61 g。

圖6 人工栽培的山陽野生黑木耳菌株子實體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

黑威15 菌株耳片腹面黑色，背面深瓦灰色（圖7），耳狀，邊緣規(guī)則，大筋，單耳質(zhì)量（干）1.01 g。

圖7 黑威15菌株子實體（左為耳片腹面，右為耳片背面）

丹鳳野生黑木耳菌株耐高溫，抗逆性強；黑威15 抗逆性較強；山陽野生黑木耳菌株不耐高溫，抗逆性弱。

3 小結與討論

試驗結果表明，采自秦嶺的兩株野生黑木耳菌株經(jīng)分子生物學鑒定均為木耳屬，黑木耳。袋料栽培結果，丹鳳野生黑木耳菌株比對照黑威15 早熟、產(chǎn)量高、抗雜抗逆性強、耐高溫，有望成為一株性狀優(yōu)良、適于生產(chǎn)應用的黑木耳菌株，缺點是顏色偏黃；山陽野生黑木耳菌株與對照黑威15 相比，雖產(chǎn)量低、抗雜抗逆性弱、不耐大水和高溫，但其耳芽形成快、早、整齊，早熟，顏色黑，可以用作雜交選育優(yōu)良菌株親本。