譚啟龍,馮國(guó)英*,李筱薇,譚建昌,韓敬華,石中兵
(1.四川大學(xué) 電子信息學(xué)院 激光微納工程研究所,四川 成都 610065;2.核工業(yè)西南物理研究院,四川 成都 610041)
糖尿病這類代謝異常且極易導(dǎo)致一系列并發(fā)癥的疾病,病患人數(shù)眾多[1],如何精確及快速檢測(cè)葡萄糖濃度在臨床生物及醫(yī)學(xué)中有廣泛的應(yīng)用需求。使用傳統(tǒng)的葡萄糖濃度檢測(cè)方法,如電化學(xué)法[2]、熒光法[3]、比色法[4]、近紅外法[5]等制備的葡萄糖傳感器在使用壽命,抗干擾能力,設(shè)備成本等方面仍面臨著一定的挑戰(zhàn)[6]。
近年來(lái),一種新型的葡萄糖濃度檢測(cè)技術(shù)得到了較快的發(fā)展,即光纖表面等離子體共振(SPR)技術(shù)[7]。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比,光纖SPR技術(shù)具有原理簡(jiǎn)單,待測(cè)物無(wú)需純化,無(wú)標(biāo)記,能實(shí)時(shí)、高精度地檢測(cè)動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)[8],為人體血糖檢測(cè)及食品安全等領(lǐng)域提供了良好的平臺(tái)。以光纖作為載體用于檢測(cè)葡萄糖濃度的傳感器可分為酶型[9]和非酶型[10-11],酶型技術(shù)方案制備的傳感器具有對(duì)葡萄糖的高選擇性,從而引起了研究人員的極大興趣。目前,研究人員開發(fā)出多種光纖結(jié)構(gòu)應(yīng)用于葡萄糖傳感器。例如,Zheng等[12]以終端反射結(jié)構(gòu)的光纖作為載體制作了一款光纖SPR葡萄糖傳感器,在0~1.7 mM的葡萄糖濃度范圍內(nèi),最大波長(zhǎng)偏移為11.23 nm。Yang等[13]采用拉錐技術(shù)將光纖的腰部直徑控制在40 μm,并將金納米顆粒及葡萄糖氧化酶依次固定于傳感區(qū)域,從而制備了靈敏度為0.93 nm/mM的葡萄糖傳感器。Yu等[11]將光纖進(jìn)行側(cè)面拋光構(gòu)成D型光纖結(jié)構(gòu),進(jìn)而使用二硫化鉬-石墨烯復(fù)合材料修飾鍍金光纖表面,從而制備了靈敏度高達(dá)6 708.87 nm/RIU的葡萄糖傳感器。Zhao等[14]在多模光纖(MMF)之間插入一段單模光纖,并在其表面沉積了一層銀膜用于激發(fā)SPR效應(yīng),在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0~40%的葡萄糖濃度范圍內(nèi),所制備的傳感器獲得了6 536.84 nm/RIU。此外,可將光子晶體光纖(PCF)應(yīng)用于傳感器的制備[15-16],以提高傳感器靈敏度。例如,Wang等[17]在多模光纖之間插入一段PCF,并其表面涂覆了一層溫度敏感膜,所制備的傳感器靈敏度為1 551 pm/℃。盡管光纖葡萄糖傳感器得到了長(zhǎng)足的發(fā)展,但是,上述傳感器或魯棒性不足,難以應(yīng)用于復(fù)雜環(huán)境;或在工藝上復(fù)雜繁瑣,制作困難;或難以應(yīng)用于低濃度葡萄糖環(huán)境。
本文提出并實(shí)現(xiàn)了一種MPPM結(jié)構(gòu)的SPR光纖葡萄糖傳感器。使用熔接機(jī)將多模光纖與兩段相同長(zhǎng)度的PCF光纖級(jí)聯(lián)拼接,制備MPPM光纖結(jié)構(gòu),通過(guò)在傳感區(qū)域涂覆一層化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且生物相容性好的金膜完成傳感器的制備。通過(guò)設(shè)置相同結(jié)構(gòu)不同長(zhǎng)度、不同結(jié)構(gòu)相同長(zhǎng)度的傳感區(qū)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn),研究結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度變化對(duì)PCF光纖傳感器的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:PCF光纖長(zhǎng)度對(duì)靈敏度沒(méi)有明顯影響,MPPM結(jié)構(gòu)的傳感器的SPR共振峰深度得到了有效加強(qiáng)。傳感區(qū)域使用化學(xué)交聯(lián)法固定GOD后,傳感器在0~0.8 mg/mL的葡萄糖濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性及對(duì)葡萄糖的特異性識(shí)別功能。
如圖1(a)所示,傳感器結(jié)構(gòu)由兩段多模光纖(62.5/125 μm)及兩段長(zhǎng)度相等的六孔柚子型光子晶體光纖(包層直徑124.6 μm,纖芯直徑6.2 μm,微孔直徑13.3 μm)構(gòu)成,并使用小型磁控濺射鍍膜儀(VTC-16-SM,合肥科晶)沉積了48 nm厚的金層。整個(gè)傳感區(qū)域的長(zhǎng)度為L(zhǎng)。PCF端面光學(xué)顯微鏡圖如圖1(b)所示。圖1(c)、(d)顯示了MMF與PCF熔接區(qū)域及PCF之間的熔接區(qū)域分別產(chǎn)生長(zhǎng)度約為214 μm、321 μm的氣孔塌陷。當(dāng)光從MMF傳輸?shù)絇CF時(shí),由于在塌陷區(qū)域沒(méi)有核心包層結(jié)構(gòu),造成了部分光從纖芯泄漏進(jìn)入包層。當(dāng)沿著PCF纖芯的光傳輸?shù)絻蓚€(gè)PCF之間的塌陷區(qū)時(shí),PCF纖芯的光再次泄露,使得更多光的能量被表面等離子體吸收,從而導(dǎo)致共振峰的深度增加[18-19]。
圖1 傳感器原理圖、PCF結(jié)構(gòu)及塌陷區(qū)顯微圖Fig.1 Sensor schematic diagram, PCF structure and collapse area micrograph
為制造所提出的光纖結(jié)構(gòu),需要使用商用光纖熔接機(jī)(88S,藤倉(cāng))和光纖切割刀(CT50,藤倉(cāng))。將熔接機(jī)熔接參數(shù)恢復(fù)出廠設(shè)置并改為自動(dòng)熔接模式,與手動(dòng)熔接模式相比,該模式不需要耗費(fèi)對(duì)準(zhǔn)纖芯的時(shí)間成本,熔接過(guò)程簡(jiǎn)單高效。圖2顯示了傳感器制備過(guò)程。如圖2(a)所示,通過(guò)自動(dòng)熔接模式將MMF與PCF熔接,制備多模光纖-PCF結(jié)構(gòu)。圖2(b)顯示了將上述兩段相同結(jié)構(gòu)的光纖放電熔接。最后通過(guò)小型磁控濺射鍍膜儀將包含結(jié)構(gòu)的光纖區(qū)域?yàn)R射上一層薄的金層,如圖2(c)所示。
圖2 傳感器結(jié)構(gòu)的制備流程Fig.2 Fabrication process of the sensor structure
在光纖SPR傳感器中,光在光纖包層與金屬界面處會(huì)發(fā)生多次全反射,可將Krestchmann棱鏡原理應(yīng)用于對(duì)光纖SPR的分析[14]。當(dāng)滿足金膜的厚度小于倏逝波的穿透深度條件時(shí),全反射產(chǎn)生的倏逝波穿透金屬薄膜存在于金屬膜與待測(cè)介質(zhì)的界面。倏逝波波矢在傳輸方向上的分量可以表示為[17]:
式中, ω為入射光角頻率,c為真空中的光速, ε0為光纖包層的介電常數(shù), θ為入射角度。在金膜與介質(zhì)的界面上,金膜受到倏逝波的激發(fā)產(chǎn)生沿著金屬表面?zhèn)鞑サ碾姶挪?,被稱為表面等離子體波,其波矢 βspw為:
式中, εm為金屬的介電常數(shù), εs為待測(cè)介質(zhì)的介電常數(shù)。當(dāng)高階包層模式產(chǎn)生的倏逝波波矢與金屬層表面等離子體波的波矢相匹配時(shí),即:
式(3)意味著發(fā)生共振吸收,形成表面等離子體效應(yīng),從而在透射光譜上出現(xiàn)吸收峰。入射光的波長(zhǎng)被稱為共振波長(zhǎng)。當(dāng)待測(cè)介質(zhì)的折射率發(fā)生變化時(shí),波長(zhǎng)則會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的移動(dòng)。通過(guò)測(cè)量波長(zhǎng)的變化,可以得到待測(cè)介質(zhì)的折射率與波長(zhǎng)的變化。由于諧振波長(zhǎng)對(duì)周圍折射率變化非常敏感,因此SPR傳感器可以表現(xiàn)出對(duì)折射率的高靈敏度。
由于GOD能夠?qū)R恍缘拇呋咸烟?,因此通過(guò)將GOD固定在以光纖作為載體的表面以實(shí)現(xiàn)葡萄糖作為檢測(cè)物質(zhì)的光纖SPR傳感器是可行的[20]。GOD與葡萄糖反應(yīng)過(guò)程如下[21]:
由式(4)可知,該酶促反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸會(huì)導(dǎo)致較大的折射率變化同時(shí)意味著光纖傳感區(qū)域周圍環(huán)境發(fā)生了改變,從而在透射光譜上表現(xiàn)出共振波長(zhǎng)發(fā)生移動(dòng)的現(xiàn)象[9,22]。
為了驗(yàn)證上述的理論分析,本文探究不同傳感區(qū)長(zhǎng)度L(即光子晶體光纖總長(zhǎng))對(duì)傳感器的性能影響,并探究MPM(多模光纖-光子晶體光纖-多模光纖)結(jié)構(gòu)傳感器和MPPM(多模光纖-光子晶體光纖-光子晶體光纖-多模光纖)結(jié)構(gòu)的傳感器的折射率靈敏度的差異。本文將MPPM結(jié)構(gòu)傳感器置于不同濃度的葡萄糖溶液中進(jìn)行折射率實(shí)驗(yàn),并評(píng)估了傳感器對(duì)葡萄糖的特異性識(shí)別功能和穩(wěn)定性。下列實(shí)驗(yàn)均在恒溫(20 ℃)恒濕的超凈光學(xué)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。入射寬譜光源的有效波長(zhǎng)范圍為300~2 500 nm (LSHT75,卓立漢光),使用光譜分析儀(ATP5020,奧譜天成,300~2 500 nm)記錄傳輸光譜。
實(shí)驗(yàn)中使用的葡萄糖氧化酶(GOD,來(lái)自黑曲霉,50 KU/g)、巰基乙胺(MEA)、氯化鉀及氯化鈉均購(gòu)自上海阿拉丁試劑,50%戊二醛(GA)、殼聚糖和葡萄糖購(gòu)于成都科隆化工,所用試劑均為分析純。
實(shí)驗(yàn)探究不同傳感區(qū)長(zhǎng)度L(即光子晶體光纖總長(zhǎng))對(duì)傳感器的性能影響,對(duì)L為5、10、15 mm的光纖傳感結(jié)構(gòu)的傳感器性能進(jìn)行了對(duì)比測(cè)量。室溫下制備了折射率分別為1.333、1.340、1.347、1.355、1.363、1.371和1.380的折射率溶液[14]。將3種不同傳感區(qū)長(zhǎng)度(5、10、15 mm)的傳感器分別浸入到上述溶液中,得到不同傳感區(qū)長(zhǎng)度的傳感器的透射光譜及相應(yīng)共振波長(zhǎng)移動(dòng)量的擬合曲線,如圖3所示。從圖3(a)、(b)、(c)可知,1.333~1.380的折射率范圍內(nèi),傳感器的SPR譜分別向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)了98.09、94.58和95.71 nm。從圖3(d)可知,3種L的傳感器對(duì)折射率的響應(yīng)表現(xiàn)出相似的性能,即傳感區(qū)長(zhǎng)度對(duì)靈敏度沒(méi)有明顯影響[17]。為了減少微結(jié)構(gòu)制備操作時(shí)造成的誤差,因此選擇傳感區(qū)長(zhǎng)度為10 mm用于制備傳感器并進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)探究。
圖3 相同結(jié)構(gòu)、不同傳感區(qū)長(zhǎng)度的傳感器的透射光譜和波長(zhǎng)移動(dòng)的擬合曲線Fig.3 Transmission spectra of sensors with different sensing area lengths and the fitting curve of wavelength shift
為了探究MPPM結(jié)構(gòu)對(duì)傳感器的折射率靈敏度變化情況,本文特意設(shè)計(jì)了MPM光纖結(jié)構(gòu)用于對(duì)比實(shí)驗(yàn)。制備上述兩種不同結(jié)構(gòu)的傳感器并鍍金處理,將MPM及MPPM結(jié)構(gòu)的傳感器分別浸入到不同的折射率液中采集透射光譜,并將相應(yīng)的共振波長(zhǎng)移動(dòng)量進(jìn)行擬合,結(jié)果見圖4。
圖4 不同結(jié)構(gòu)傳感器在不同折射率溶液中的SPR譜及對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)的曲線關(guān)系Fig.4 SPR spectra and corresponding wavelength curves function of sensors with different structures in solutions with different refractive indices
如圖4(a)、(b)所示:隨著折射率的升高,共振波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng);在1.333~1.380的折射率范圍內(nèi),MPPM結(jié)構(gòu)傳感器的折射率靈敏度從1 187.01 nm/RIU變化到2 816.41 nm/RIU。擬合曲線如圖4(c)所示,相比于MPM結(jié)構(gòu)的最大靈敏度(2 714.57 nm/RIU),MPPM結(jié)構(gòu)的傳感器的最大靈敏度(2 816.41 nm/RIU)提高了101.84 nm/RIU。
此外,本文繼續(xù)探究了MPPM結(jié)構(gòu)的SPR共振峰深度。圖5顯示了兩種結(jié)構(gòu)的傳感器在折射率為1.333的溶液中輸出的SPR光譜。
圖5 MPM與MPPM結(jié)構(gòu)的SPR共振峰深度對(duì)比Fig.5 SPR resonance peak depth comparison between MPM and MPPM structures
從圖5中可以看出,與MPM結(jié)構(gòu)傳感器相比,MPPM結(jié)構(gòu)的傳感器的SPR共振峰深度更深,意味著更容易和精確地識(shí)別出共振波長(zhǎng)位置,得到的傳感器靈敏度參數(shù)能夠更準(zhǔn)確。
圖6顯示了用于低濃度葡萄糖檢測(cè)的傳感系統(tǒng)示意圖,該系統(tǒng)由寬帶光源發(fā)出可見光并在光纖傳感區(qū)域產(chǎn)生SPR效應(yīng),隨后通過(guò)光譜儀采集光譜數(shù)據(jù),并使用光譜軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,其中在光纖傳感區(qū)域上沉積了金膜并且固定了GOD。
圖6 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.6 Schematic diagram of the experimental setup
2.3.1 MPPM結(jié)構(gòu)葡萄糖傳感器的制備
下述實(shí)驗(yàn)均在恒溫(25 ℃)恒濕的超凈光化學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。GOD固定步驟如圖7所示:首先,在黑暗環(huán)境條件下將涂覆有金膜的光纖浸入濃度為10 mM的MEA溶液過(guò)夜,通過(guò)Au—S鍵的結(jié)合在金膜表面暴露出游離的氨基;隨后,將光纖浸入體積分?jǐn)?shù)為2%的戊二醛溶液1.5 h,通過(guò)Schiff base反應(yīng)原理將氨基與戊二醛的醛基結(jié)合使金膜表面產(chǎn)生游離的醛基;最后,在光纖表面滴入濃度為15 mg/mL的GOD溶液,恒溫4 ℃反應(yīng)2 h,通過(guò)游離的醛基與GOD分子上的氨基發(fā)生反應(yīng)使GOD被固定在光纖表面。
圖7 GOD固定過(guò)程示意圖Fig.7 Schematic diagram of GOD fixation process
2.3.2 MPPM結(jié)構(gòu)葡萄糖傳感器的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
本實(shí)驗(yàn)將低濃度的葡萄糖溶液滴加到傳感器并收集透射光譜數(shù)據(jù)。為保證采集的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,待響應(yīng)的光譜數(shù)據(jù)完全穩(wěn)定時(shí)再進(jìn)行采集,此過(guò)程約90 s,與先前報(bào)道的葡萄糖傳感器所觀察到的情況一致[20]。將GOD修飾的傳感器分別浸入濃度范圍為0~1.2 mg/mL的葡萄糖溶液。圖8為GOD修飾的傳感器對(duì)不同濃度葡萄糖的透射光譜及對(duì)應(yīng)共振波長(zhǎng)移動(dòng)量的擬合結(jié)果。從圖8(a)可以看出,隨著葡萄糖濃度的增加,傳感器的共振波長(zhǎng)產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。由圖8(b)可知,隨著葡萄糖濃度增加,共振波長(zhǎng)的移動(dòng)量先增加后趨于不變。結(jié)果表明,在0~0.8 mg/mL的葡萄糖范圍內(nèi),共振波長(zhǎng)的偏移量與葡萄糖濃度呈良好的線性變化,線性擬合度為約0.954,其關(guān)系為:
圖8 葡萄糖傳感器在不同濃度葡萄糖溶液中的SPR譜及其關(guān)系擬合Fig.8 SPR spectrum of glucose sensor in different concentrations of glucose solution and its relationship fitting
式中:y為波長(zhǎng)移動(dòng)量,nm;x為葡萄糖濃度,mg/mL;傳感器的靈敏度為29.61 nm/(mg·mL-1)。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí),酶的結(jié)合位點(diǎn)充足,酶與葡萄糖分子充分快速結(jié)合,導(dǎo)致波長(zhǎng)偏移量與葡萄糖濃度的關(guān)系呈線性變化。當(dāng)葡萄糖濃度在0.8~1.2 mg/mL的范圍內(nèi)繼續(xù)增加時(shí),酶的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和,導(dǎo)致傳感器周圍環(huán)境的折射率變化較小,共振波長(zhǎng)的偏移量趨于不變。
將近年來(lái)已報(bào)道的光纖葡萄糖傳感器進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見表1。從表1中可知,相比于傳統(tǒng)的裸光纖結(jié)構(gòu)葡萄糖傳感器,本文所提出的傳感器的靈敏度得到了較大提升,最大可達(dá)102倍;與光纖SPR傳感器相比,對(duì)葡萄糖的響應(yīng)得到改善,最大可達(dá)32倍。
表1 不同傳感結(jié)構(gòu)的葡萄糖傳感器性能對(duì)比Tab.1 Performance comparison of glucose sensors with different sensing structures
為了驗(yàn)證上述隨葡萄糖濃度變化的共振波長(zhǎng)移動(dòng)是由于GOD分子與葡萄糖的特異性結(jié)合引起的環(huán)境折射率改變,而不是葡萄糖本身濃度變化導(dǎo)致的折射率改變,研究了未固定GOD的傳感器對(duì)低葡萄糖濃度范圍的靈敏度響應(yīng)。將0~0.6 mg/mL的葡萄糖溶液分別滴加到未固定GOD的傳感器的傳感區(qū)域,各濃度對(duì)應(yīng)的透射光譜和共振波長(zhǎng)的擬合曲線如圖9所示。通過(guò)圖9(a)可知,各濃度對(duì)應(yīng)的透射譜幾乎重合。從圖9(b)觀察到,透射譜對(duì)應(yīng)的共振波長(zhǎng)的擬合曲線呈水平直線,說(shuō)明共振波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生移動(dòng)。因此低濃度葡萄糖范圍內(nèi)由葡萄糖濃度變化引起的折射率改變對(duì)波長(zhǎng)的漂移影響可以忽略。
圖9 未固定GOD的傳感器在葡萄糖溶液中的SPR譜及其關(guān)系擬合Fig.9 SPR spectrum of the sensor without immobilized GOD in glucose solution and its relationship fitting
為評(píng)估傳感器對(duì)葡萄糖的特異性識(shí)別功能,本文繼續(xù)探究了葡萄糖傳感器對(duì)濃度相同(0.8 mg/mL)的4種不同溶液(氯化鉀KCL、氯化鈉NaCL、殼聚糖Chitosan和葡萄糖Glucose)的響應(yīng),結(jié)果見圖10。如圖10所示,將傳感器分別浸入到4種溶液中,在殼聚糖和葡萄糖溶液中,共振波長(zhǎng)分別移動(dòng)約1.6 nm和21.5 nm,氯化鉀和氯化鈉溶液中沒(méi)有明顯的波長(zhǎng)移動(dòng)。該實(shí)驗(yàn)表明該傳感器對(duì)葡萄糖具有穩(wěn)定的特異性識(shí)別功能。
圖10 傳感器對(duì)不同溶液的響應(yīng)Fig.10 Response of the sensor to different solutions
此外,穩(wěn)定性是生物傳感器的一個(gè)重要性能指標(biāo),是對(duì)測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的一個(gè)重要表征。為評(píng)估傳感器的穩(wěn)定性,在濃度為0.2 mg/mL的葡萄糖溶液中對(duì)傳感器進(jìn)行了50 min的連續(xù)監(jiān)測(cè)并每隔一段時(shí)間記錄光譜數(shù)據(jù)。將間隔一定時(shí)間的共振波長(zhǎng)作了一個(gè)曲線擬合,如圖11所示。由圖11可知,波長(zhǎng)位置基本沒(méi)有發(fā)生移動(dòng),表明所提出的葡萄糖傳感器穩(wěn)定性能良好。
圖11 傳感器在不同時(shí)刻下的SPR譜及其關(guān)系擬合Fig.11 SPR spectrum of the sensor at different times and its relationship fitting
本文基于表面等離子體共振原理設(shè)計(jì)并制作了一種光纖傳感器。通過(guò)對(duì)光子晶體光纖進(jìn)行簡(jiǎn)單加工使得在光子晶體光纖之間產(chǎn)生了一個(gè)約321 μm的塌陷區(qū)域從而制備了MPPM結(jié)構(gòu)的光纖傳感器,并且通過(guò)濺射鍍膜儀濺射金膜修飾光纖從而產(chǎn)生SPR效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):不同PCF長(zhǎng)度對(duì)傳感器的靈敏度影響較小。在折射率溶液為1.380時(shí),傳感器擁有2 816.41 nm/RIU的高折射率靈敏度。與MPM結(jié)構(gòu)相比,MPPM結(jié)構(gòu)的傳感器表現(xiàn)出更大的共振深度,提高了傳感測(cè)量精度。在金膜上固定GOD的傳感器對(duì)葡萄糖獲得了29.61 nm/(mg·mL-1)的靈敏度。
綜上所述,MPPM結(jié)構(gòu)的傳感器具有制備簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)緊湊、靈敏度高等優(yōu)勢(shì);戊二醛在鍍金光纖表面固定GOD的方法簡(jiǎn)單高效,所制備的拼接光子晶體光纖的葡萄糖傳感器表現(xiàn)出靈敏度高、選擇性好及高穩(wěn)定性,為高靈敏度的光纖傳感器在人體血糖的檢測(cè)方面提供了新的方案。將該光纖葡萄糖傳感器應(yīng)用于人體血糖檢測(cè)是下一階段研究的重點(diǎn)。