結(jié)核抗原檢測(cè)試劑國(guó)家參考品的研制

石大偉 陳湘霖 董文竹 文舒安 張婷婷 王玉峰 黃海榮 許四宏

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染性疾病,我國(guó)目前仍是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一,同時(shí)也是耐藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)較高的國(guó)家[1-2]。結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段主要有細(xì)菌學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查[3]。其中細(xì)菌學(xué)檢查常用的兩種檢查方法為痰涂片檢查(即抗酸桿菌染色,簡(jiǎn)稱“抗酸染色”)及分枝桿菌分離培養(yǎng)[4-6]。在抗酸染色檢查中,結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)均可被檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果,因此難以區(qū)分[7]。而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒別MTBC與NTM菌群的操作步驟繁瑣,耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)。分子生物學(xué)方法具有快速和敏感度高的特點(diǎn)。一般情況下,結(jié)核抗原檢測(cè)雖然敏感度低于分子生物學(xué)方法,但一般采用免疫層析法,較分子生物學(xué)方法具有操作簡(jiǎn)便、成本更低和對(duì)環(huán)境和設(shè)備要求低的優(yōu)勢(shì)[8]。因此,結(jié)核抗原檢測(cè)是目前臨床上仍然使用的一種輔助診斷方法。

目前,我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)上市的結(jié)核抗原檢測(cè)試劑基于的方法均為免疫層析法(膠體金法),被測(cè)物(靶抗原)均為結(jié)核MPT64抗原。MPT64蛋白是MTB培養(yǎng)早期即分泌至菌體外部占比最大的一種可溶性蛋白,而NTM 菌株中缺乏該基因,因此可以通過(guò)檢測(cè)MPT64蛋白來(lái)鑒別MTBC與NTM[9-10]。但是,由于不同包被抗體和生產(chǎn)工藝等因素會(huì)造成市場(chǎng)上的結(jié)核抗原檢測(cè)試劑性能的差異,因此,研制結(jié)核抗原檢測(cè)試劑國(guó)家參考品用于結(jié)核抗原診斷試劑的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)具有重要意義。

資料和方法

一、參考品原料

參考品原料(菌株)樣本均來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)參比實(shí)驗(yàn)室(北京胸科醫(yī)院菌種資源庫(kù)),為經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)、菌種鑒定并保存于―80 ℃甘油的菌株,共計(jì)11份。

二、試劑

中性羅氏固體培養(yǎng)基(斜面)為珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。對(duì)硝基苯甲酸試劑為北京胸科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)參比實(shí)驗(yàn)室自行配制。參考品的復(fù)核試劑為成都博奧晶芯生物科技有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)及廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌鑒定試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)。協(xié)作標(biāo)定的試劑包括杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司的結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒,以及美艾利爾(中國(guó))醫(yī)療器械有限公司的結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒。

三、研究方法

1.菌株復(fù)蘇和復(fù)核:將參考品原料菌株從―80 ℃進(jìn)行復(fù)蘇和固體培養(yǎng),并使用對(duì)硝基苯甲酸生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定。復(fù)核選擇兩種檢測(cè)試劑對(duì)復(fù)蘇培養(yǎng)后的原料(菌株)樣本進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)操作和結(jié)果判定均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,確定出可用于制備國(guó)家參考品的候選樣本。

2.參考品的分裝和組裝:分裝和組裝前先將所有候選樣本使用中性羅氏固體培養(yǎng)基(斜面)進(jìn)行增菌培養(yǎng),陰性和陽(yáng)性參考品候選樣本接種8支,最低檢出限/精密度參考品候選樣本接種10支。將菌體磨菌超聲分散后進(jìn)行稀釋,分裝至1.5～2 ml非螺口錐形底離心管中,并置于恒溫金屬浴加熱塊上,80 ℃ 加熱滅活1 h。再將每11支參考品候選樣本組裝成1套參考品(盤),共組裝80套。用于之后的協(xié)作標(biāo)定和穩(wěn)定性評(píng)估。

3.參考品的協(xié)作標(biāo)定研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定:參考品候選樣本送至杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司和美艾利爾(中國(guó))醫(yī)療器械有限公司的實(shí)驗(yàn)室,使用各自生產(chǎn)的結(jié)核抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。試劑盒的檢測(cè)操作和結(jié)果判定均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

4.標(biāo)定菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù)和核酸拷貝數(shù):所有參考品候選樣本菌液在超聲分散后分裝前均進(jìn)行了麥?zhǔn)蠞岫葯z測(cè),同時(shí)進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)。在CFU實(shí)驗(yàn)中,菌液按3個(gè)稀釋度稀釋,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)5 cm固體平板,對(duì)菌落為10～50個(gè)的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。參考品候選樣本菌液分裝并滅活后,委托廣州達(dá)安基因股份有限公司使用熒光定量PCR和數(shù)字PCR法對(duì)參考品的核酸拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)定。由于目前對(duì)NTM的CFU計(jì)數(shù)及核酸標(biāo)定缺乏公認(rèn)的和穩(wěn)定的方法,因此僅對(duì)陽(yáng)性參考品、最低檢出限/精密度參考品進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)和核酸標(biāo)定。

5.均勻性研究:隨機(jī)抽取分裝后于―20 ℃保存的5套參考品,對(duì)每套參考品(盤)中的陽(yáng)性參考品、最低檢出限參考品用同一批杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核抗原檢測(cè)試劑分別進(jìn)行檢測(cè)。

6.穩(wěn)定性研究:結(jié)核抗原國(guó)家參考品分裝和組裝完成后存于―20 ℃冰箱中,分別取出1套于4 ℃放置7 d、于室溫(23～27 ℃)放置3 d、反復(fù)凍融5次后,與-20 ℃保存的參考品同時(shí)用同一批杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核抗原檢測(cè)試劑分別進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié) 果

一、菌株復(fù)蘇

參考品原料(菌株)包括5份陽(yáng)性參考品原料(菌株)樣本,5份陰性參考品原料(菌株)樣本,1份最低檢出限/精密度參考品原料(菌株)樣本,共計(jì)11份。其中最低檢出限/精密度參考品候選樣本為國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv。陽(yáng)性參考品候選樣本均為北京胸科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)參比實(shí)驗(yàn)室分離自臨床痰液樣本的MTB菌株,并使用對(duì)硝基苯甲酸生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定。其余樣本引進(jìn)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC),由北京胸科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)參比實(shí)驗(yàn)室復(fù)蘇培養(yǎng)和傳代保存。參考品原料(菌株)的具體信息見(jiàn)表1。

表1 候選樣本來(lái)源概況

二、菌株的復(fù)核

對(duì)菌株樣本采用基于核酸方法學(xué)的分枝桿菌鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法和熒光PCR熔解曲線法)進(jìn)行復(fù)核,挑選出擬進(jìn)入?yún)f(xié)作標(biāo)定的候選樣本。復(fù)核結(jié)果顯示,博奧芯片對(duì)陰性參考品2號(hào)原料(菌株)樣本的檢測(cè)結(jié)果為堪薩斯分枝桿菌和MTB雙陽(yáng)性(MTB信號(hào)非常弱,因此軟件自動(dòng)判讀為單一堪薩斯分枝桿菌),而廈門致善試劑為單一堪薩斯分枝桿菌陽(yáng)性,沒(méi)有檢出MTB污染?？紤]到芯片法的檢測(cè)限一般劣于熒光PCR法,陰性參考品2號(hào)原料(菌株)樣本復(fù)核為單一堪薩斯分枝桿菌陽(yáng)性。此外,對(duì)于陽(yáng)性參考品35號(hào)原料(菌株)樣本,廈門致善試劑的檢測(cè)結(jié)果為MTB和“其他分枝桿菌”雙陽(yáng)性,博奧芯片的檢測(cè)結(jié)果為MTB和胞內(nèi)分枝桿菌雙陽(yáng)性。該樣本為臨床分離株,因此可以認(rèn)定該樣本很大可能性為MTB和NTM混合感染?？紤]到陽(yáng)性參考品的設(shè)置目的為考核結(jié)核抗原試劑的陽(yáng)性檢出能力,因此保留其為陽(yáng)性參考品候選樣本。綜上,復(fù)核結(jié)果表明原料菌株樣本經(jīng)復(fù)核均可用于制備參考品候選樣本。

三、參考品的分裝和組裝

所有候選樣本使用中性羅氏固體培養(yǎng)基(斜面)進(jìn)行增菌培養(yǎng),經(jīng)稀釋后分裝陽(yáng)性參考候選樣本5支,編號(hào)為P1～P5;陰性參考樣本5支,編號(hào)為N1～N5,以及最低檢出限/精密度參考品,編號(hào)為P0,各樣本含量均為1 ml/支,存于―20 ℃冰箱中。

四、協(xié)作標(biāo)定(適用性驗(yàn)證)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定

標(biāo)定結(jié)果顯示,參與協(xié)作標(biāo)定(適用性驗(yàn)證)的兩家公司的試劑對(duì)陽(yáng)性參考品候選樣本和陰性參考品候選樣本均能正確檢出(表2)。在最低檢出限方面,對(duì)參考品Rv倍比稀釋后,杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司可檢出32倍陽(yáng)性、64倍陰性;美艾利爾(中國(guó))醫(yī)療器械有限公司可檢出16倍陽(yáng)性、32倍弱陽(yáng)性、64倍陰性。在精密度方面,對(duì)候選樣本Rv進(jìn)行8倍稀釋后,各試劑的10次平行檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,且顯色均一。

表2 膠體金法試劑協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

根據(jù)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果,從協(xié)作標(biāo)定樣本中選擇全部候選樣本作為國(guó)家參考品的最終組成,并重新編號(hào)。同時(shí)根據(jù)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果,國(guó)家參考品的組成和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定為:(1)陰性參考品N1～N5:檢測(cè)結(jié)果應(yīng)均為陰性,陰性參考品符合率應(yīng)為5/5;(2)陽(yáng)性參考品P1～P5:檢測(cè)結(jié)果應(yīng)均為陽(yáng)性,陽(yáng)性參考品符合率應(yīng)為5/5;(3)最低檢出限參考品P0:對(duì)參考品P0進(jìn)行倍比稀釋至64倍,16倍稀釋的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性;(4)精密度參考品P0:對(duì)參考品P0進(jìn)行8倍稀釋后平行檢測(cè)10次,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)均為陽(yáng)性,且顯色條帶均一。

五、標(biāo)定CFU計(jì)數(shù)和核酸拷貝數(shù)

對(duì)于CFU計(jì)數(shù)和核酸拷貝數(shù)的標(biāo)定結(jié)果見(jiàn)表3,其中核酸標(biāo)定為單獨(dú)2次上機(jī)結(jié)果的平均值,標(biāo)定結(jié)果可供未來(lái)?yè)Q批時(shí)參考。CFU計(jì)數(shù)結(jié)果為1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為2個(gè)5 cm固體平板上菌落數(shù)的平均值。

表3 參考品CFU計(jì)數(shù)和核酸拷貝數(shù)標(biāo)定結(jié)果

六、穩(wěn)定性和均勻性研究

檢測(cè)以膠體金法試劑的檢測(cè)條帶為指標(biāo),本參考品在4 ℃放置7 d、室溫(23～27 ℃)放置3 d、反復(fù)凍融5次后,與對(duì)照參考品(―20 ℃保存)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性且顯色條帶均一,無(wú)肉眼可見(jiàn)差別;隨機(jī)抽取的5份參考品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性且顯色條帶均一,無(wú)肉眼可見(jiàn)差別。根據(jù)上述結(jié)果,本參考品的穩(wěn)定性和均勻性均符合規(guī)定要求。

討 論

目前,用于結(jié)核病檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是微生物培養(yǎng)和菌種鑒定,但該方法操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),并且對(duì)操作者的專業(yè)技術(shù)要求較高[11-13]。與上述方法相比,抗原檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn),并且可用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)[14-15]。為滿足疾病控制及臨床診斷的需要,很多研究機(jī)構(gòu)及企業(yè)相繼開(kāi)發(fā)出多種結(jié)核抗原檢測(cè)試劑盒。為了對(duì)結(jié)核抗原檢測(cè)試劑的質(zhì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究,本研究首次建立了一套針對(duì)膠體金免疫層析法結(jié)核抗原檢測(cè)試劑盒的國(guó)家參考品(盤)。本參考品(盤)的特點(diǎn)在于:(1)本參考品的最低檢出限參考品為國(guó)際公認(rèn)的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv,遺傳和生物學(xué)背景清楚,易于參考品批次更換時(shí)的質(zhì)量控制。(2)膠體金法試劑的樣本上樣體積較大,這就要求本參考品原料的初始培養(yǎng)和收獲菌量大。各參考品原料樣本均經(jīng)過(guò)兩種方法的分散,力圖保證在較高濃度(3～4個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?下制備的參考品盡量均勻,后期均勻性研究也顯示參考品達(dá)到較好的均勻性。(3)本參考品的最低檢出限參考品經(jīng)過(guò)CFU計(jì)數(shù)和核酸拷貝數(shù)的雙重標(biāo)定,所提供的信息更充分。

本結(jié)核抗原國(guó)家參考品經(jīng)原料復(fù)核,并經(jīng)分散稀釋、分裝和組裝后,使用兩家不同企業(yè)的膠體金法結(jié)核抗原檢測(cè)試劑進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定(適用性驗(yàn)證),并使用結(jié)核核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行拷貝數(shù)標(biāo)定。通過(guò)檢測(cè)相同的參考品樣本,兩種試劑在陽(yáng)性和陰性參考品符合率、最低檢出限和精密度等性能指標(biāo)方面沒(méi)有顯示出明顯差異。這與2021年完成的一項(xiàng)薈萃了46篇研究文獻(xiàn)的系統(tǒng)綜述的結(jié)論一致[8]。本研究也發(fā)現(xiàn),試劑間的最低檢出限也存在一定的差異。對(duì)最低檢出限參考品的檢測(cè)結(jié)果顯示,試劑間存在2倍稀釋度的差異(5×105～1×106CFU/ml),而張?jiān)毫嫉萚10]針對(duì)兩種商品化MPT64結(jié)核抗原檢測(cè)試劑的比較研究發(fā)現(xiàn),檢出限存在約3倍稀釋度的差異(3×103～1×104CFU/ml)。近年來(lái),商品化MPT64結(jié)核抗原檢測(cè)試劑的實(shí)驗(yàn)室分析性能評(píng)估的研究較少,2項(xiàng)國(guó)外研究結(jié)果顯示,膠體金法的MPT64結(jié)核抗原檢測(cè)試劑的最低檢出限在105CFU/ml 濃度水平[16-17],而本研究參考品適用性驗(yàn)證所用試劑也表現(xiàn)出該濃度水平的最低檢出限,據(jù)此我們?cè)O(shè)定了參考品的最低檢出限標(biāo)準(zhǔn)。此外,有研究顯示,部分結(jié)核抗原檢測(cè)試劑在檢測(cè)NTM(如膿腫分枝桿菌)時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[10, 18],但在本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)適用性驗(yàn)證所用試劑的交叉反應(yīng),提示所用試劑特異度高。因此,上述適用性驗(yàn)證的結(jié)果顯示,本參考品(盤)能夠滿足膠體金法結(jié)核抗原檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制要求。參考品(盤)的組成和檢測(cè)結(jié)果要求(質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))也考慮到結(jié)核抗原檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用需求,兼顧了試劑對(duì)陰性和陽(yáng)性樣本的檢出能力。穩(wěn)定性和均勻性研究顯示,本參考品的穩(wěn)定性和均勻性符合規(guī)定要求,可以持續(xù)供應(yīng),可為結(jié)核抗原檢測(cè)試劑的質(zhì)量穩(wěn)定提供基礎(chǔ)。

本參考品(盤)具有以下局限性:(1)樣本來(lái)源均為菌株培養(yǎng)稀釋、分裝制得,缺少臨床樣本。這主要是考慮到結(jié)核病的常見(jiàn)臨床樣本為痰液樣本,其成分比較復(fù)雜,不宜采用痰液等臨床樣本建立參考品。(2)受限于原料來(lái)源的限制,對(duì)陰性參考品并沒(méi)有選擇其他具有挑戰(zhàn)性的樣本進(jìn)行干擾,例如其他呼吸道疾病患者的樣本。(3)本參考品使用兩種商品化結(jié)核抗原檢測(cè)試劑進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定,其靶抗原均為MPT64蛋白且均基于膠體金法,這限制了本參考品的適用性。后續(xù)將持續(xù)關(guān)注結(jié)核抗原檢測(cè)方法的發(fā)展和新產(chǎn)品的推出,并研制適用的國(guó)家參考品。

志謝感謝林元奎博士在文字修改方面對(duì)本文做出的貢獻(xiàn)

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)石大偉:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計(jì)分析、獲取研究經(jīng)費(fèi);陳湘霖:修改文章;董文竹、文舒安、張婷婷和王玉峰:實(shí)施研究、統(tǒng)計(jì)分析;黃海榮:醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、技術(shù)指導(dǎo)、行政/技術(shù)/材料支持;許四宏:對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、獲取研究經(jīng)費(fèi)、行政/技術(shù)/材料支持