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    冬凌草甲素聯(lián)合免疫因子TRAF4 對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響及機(jī)制研究

    2023-11-28 10:50:46羅帥陳勇
    天津中醫(yī)藥 2023年11期
    關(guān)鍵詞:冬凌草甲素肺癌

    羅帥,陳勇

    (上海健康醫(yī)學(xué)院附屬崇明中心醫(yī)院,上海 202150)

    根據(jù)病理表現(xiàn)可以將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌,其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌全部的80%~85%[1]。雖然醫(yī)學(xué)上已經(jīng)取得了進(jìn)步,但是非小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是當(dāng)前其治療的難點(diǎn)[2-3]。冬凌草又稱為冰凌草,性微寒,甘微苦,常用于治療咽喉腫痛、蛇蟲咬傷和扁桃體炎等疾病[4],具有多種化學(xué)活性,如冬凌草甲素具有明顯的抗腫瘤效果[5]。有研究結(jié)果顯示,冬凌草甲素抑制肺癌細(xì)胞A549 的增殖[6],促進(jìn)肺癌細(xì)胞的自噬小體的產(chǎn)生,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子4(TRAF4)位于染色體17q11-12 上,與腫瘤壞死受體家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)[8]。有研究發(fā)現(xiàn),miR-370 通過靶向負(fù)調(diào)控TRAF4 抑制肺癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[9]。但是關(guān)于冬凌草甲素是否能夠聯(lián)合TRAF4 影響非小細(xì)胞肺癌的研究尚不明確,因此,本研究通過體外培養(yǎng)A549 細(xì)胞,探討冬凌草甲素聯(lián)合TRAF4 對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡的影響。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞和主要試劑 A549 細(xì)胞購自美國(guó)ATCC公司;冬凌草甲素購于成都普菲德公司;DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購于Hyclone 公司;噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購于北京索萊寶公司;Lipofectamine 2000 試劑盒購于賽默飛世爾公司;si-NC、si-TRAF4、pcDNA、TRAF4 購于廣州銳博生物公司;凋亡試劑盒購于江蘇凱基生物公司;B 細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)相關(guān)X 蛋白(Bax)抗體、Bcl-2 抗體、微管相關(guān)蛋白1 的輕鏈3(LC3)Ⅱ抗體、LC3Ⅰ抗體、Beclin 1 抗體、ATG7 抗體、TRAF4 抗體、GAPDH 抗體購于美國(guó)Abcam 公司;熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑購于Promega 公司;引物購于上海吉瑪公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,A549細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。細(xì)胞匯合率為80%時(shí),采用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

    1.3 噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549 細(xì)胞并接種在96 孔板中。過夜培養(yǎng)后,細(xì)胞與0、1、5、10、20、50 μmol/L 的冬凌草甲素孵育48 h。隨后,細(xì)胞與MTT 試劑孵育4 h,然后用二甲基亞砜(DMSO)試劑溶解結(jié)晶。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值,評(píng)估細(xì)胞活力。

    1.4 細(xì)胞分組 A549 細(xì)胞接種6孔板內(nèi)(1×105個(gè)/mL),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入0、20 μmol/L 的冬凌草甲素,記為對(duì)照組、冬凌草甲素組。按照Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-TRAF4和si-NC,記為si-TRAF4 組、si-NC 組;將pcDNA和TRAF4 轉(zhuǎn)染至A549 細(xì)胞后,采用20 μmol/L 的冬凌草甲素處理,記為冬凌草甲素+pcDNA 組、冬凌草甲素+TRAF4 組。

    1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取1.4 各組A549細(xì)胞,取1 mL 細(xì)胞液添加至500 μL 結(jié)合緩沖液內(nèi),用于制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞與Annexin V-FITC 和PI試劑孵育,利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

    1.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá) 取1.4 中各組A549 細(xì)胞4 ℃裂解30 min,然后經(jīng)過12 000 r/min(離心半徑為15 cm)離心10 min,收集細(xì)胞上清液,根據(jù)BCA 法定量蛋白濃度,在95 ℃變性7 min。取蛋白樣品經(jīng)過凝膠電泳處理,轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉培養(yǎng)1.5 h,洗膜3 次,加入Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7 和TRAF4 抗體于4 ℃過夜培養(yǎng),洗膜3 次,加入二抗,室溫培養(yǎng)1.5 h,滴加提前配置的顯影液,顯色、曝光。用Image J 軟件分析蛋白條帶。

    1.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)mRNA 表達(dá) 利用Trizol 試劑提取總RNA,分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 樣品的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA,然后根據(jù)熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH 為內(nèi)參,分析采用2-ΔΔCt公式計(jì)算TRAF4 mRNA 表達(dá)量。TRAF4 上游引物為:5’-CATCCACAGTGAGGAGGGCT-3’,下游引物為:5’-TTCATGGGGCAGCGATTAG-3’;GAPDH 上游引物為:5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’,下游引物為:5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響 評(píng)估濃度為0、1、5、10、20、50 μmol/L 的冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示,A549 細(xì)胞活力隨著冬凌草甲素濃度的上升而逐漸下降(P<0.05)。A549 細(xì)胞半數(shù)抑制率(IC50)為22.4 μmol/L,因此本研究選擇20 μmol/L 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

    表1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響(±s)Tab.1 Effects of different concentrations of oridonin on A549 cell viability(±s)

    表1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞活力的影響(±s)Tab.1 Effects of different concentrations of oridonin on A549 cell viability(±s)

    注:與0 μmol/L 組比較,*P<0.05

    冬凌草甲素濃度細(xì)胞活力0 μmol/L99.2±8.7 1 μmol/L91.2±8.2*5 μmol/L83.2±7.9*10 μmol/L68.4±7.2*20 μmol/L46.5±5.3*50 μmol/L32.4±3.8*F 124.516 P 0.000

    2.2 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比,冬凌草甲素組的細(xì)胞凋亡率、Bax 水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2 水平顯著下降(P<0.05)。見圖1、表2。

    圖1 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of oridonin on apoptosis of A549 cells

    表2 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響(±s)Tab.2 Effect of oridonin on the apoptosis of A549 cells(±s)

    表2 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞凋亡的影響(±s)Tab.2 Effect of oridonin on the apoptosis of A549 cells(±s)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05。

    組別細(xì)胞凋亡率(%)BaxBcl-2對(duì)照組7.5±0.90.23±0.020.85±0.06冬凌草甲素組23.4±1.9*0.77±0.07*0.35±0.04*t 22.68922.25220.801 P 0.0000.0000.000

    2.3 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響 與對(duì)照組相比,冬凌草甲素組的Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖2、表3。

    圖2 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響Fig.2 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells

    表3 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響(±s)Tab.3 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells(±s)

    表3 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響(±s)Tab.3 Effect of oridonin on autophagy in A549 cells(±s)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05。

    組別Beclin 1LC3Ⅱ/LC3ⅠATG7對(duì)照組0.27±0.030.32±0.040.22±0.02冬凌草甲素組0.68±0.06*1.25±0.11*0.64±0.05*t 18.33623.83723.398 P 0.0000.0000.000

    2.4 冬凌草甲素對(duì)A549 細(xì)胞中TRAF4 表達(dá)的影響 qRT-PCR 和Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,冬凌草甲素組的TRAF4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖3、表4。

    圖3 冬凌草甲素對(duì)TRAF4 蛋白水平的影響Fig.3 Effect of oridonin on TRAF4 protein level

    表4 冬凌草甲素對(duì)TRAF4 水平的影響(±s)Tab.4 Effect of oridonin on TRAF4 levels(±s)

    表4 冬凌草甲素對(duì)TRAF4 水平的影響(±s)Tab.4 Effect of oridonin on TRAF4 levels(±s)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05。

    組別TRAF4 mRNATRAF4 蛋白對(duì)照組0.95±0.070.71±0.07冬凌草甲素組0.41±0.04*0.33±0.03*t 20.09414.969 P 0.0000.000

    2.5 干擾TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響 與si-NC 組相比,si-TRAF4 組的TRAF4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 水平顯著上升(P<0.05),Bcl-2 水平顯示下降(P<0.05)。見圖4、表5。

    圖4 干擾TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響Fig.4 Effect of interference TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells

    表5 干擾TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響(±s)Tab.5 Effects of interfering with TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells(±s)

    表5 干擾TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響(±s)Tab.5 Effects of interfering with TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells(±s)

    注:與si-NC 組比較,*P<0.05。

    組別TRAF4 mRNA TRAF4 蛋白 細(xì)胞凋亡率(%)BaxBcl-2Beclin 1LC3Ⅱ/LC3IATG7 si-NC0.92±0.070.77±0.057.3±0.70.32±0.040.63±0.060.30±0.020.44±0.050.36±0.03 si-TRAF40.37±0.04*0.35±0.03*22.4±2.1*0.59±0.06*0.34±0.03*0.61±0.05*1.32±0.13*0.65±0.06*t 20.46621.60920.46411.23312.96917.27018.95412.969 P 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

    2.6 冬凌草甲素聯(lián)合免疫因子TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響 與冬凌草甲素+pcDNA 組相比,冬凌草甲素+TRAF4 組的TRAF4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05),細(xì)胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG7 水平顯著下降(P<0.05),Bcl-2 水平顯示上升(P<0.05)。見圖5、表6。

    圖5 冬凌草甲素聯(lián)合免疫因子TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響Fig.5 Effect of oridonin combined with immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells

    表6 冬凌草甲素聯(lián)合免疫因子TRAF4 對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和自噬的影響(±s)Tab.6 Effects of oridonin combined with immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells(±s)

    注:與冬凌草甲素+pcDNA 組比較,*P<0.05。

    組別TRAF4 mRNA TRAF4 蛋白細(xì)胞凋亡率(%)BaxBcl-2Beclin 1LC3Ⅱ/LC3ⅠATG7冬凌草甲素+pcDNA0.36±0.030.29±0.0222.7±2.10.82±0.070.33±0.030.72±0.061.29±0.130.68±0.06冬凌草甲素+TRAF40.68±0.07*0.52±0.04*14.3±1.2*0.47±0.05* 0.66±0.05* 0.47±0.04*0.85±0.07*0.40±0.04*t 12.60515.42910.41912.20616.97810.4018.94011.649 P 0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

    3 討論

    冬凌草甲素是從冬凌草二萜類化合物內(nèi)提取分離而來的,具有明顯的抗腫瘤作用,如抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等[10]。吳楠等[11]研究結(jié)果顯示,冬凌草甲素通過抑制TPX2 促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡,阻滯細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素在宮頸癌研究中可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)線粒體凋亡[12]。黃陳翼等[13]在研究骨髓瘤中發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素通過抑制磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞增殖。本研究采用不同濃度(0、1、5、10、20、50 μmol/L)冬凌草甲素作用A549 細(xì)胞,MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力,結(jié)果顯示,冬凌草甲素呈劑量效應(yīng)降低,因此本研究采用20 μmol/L(接近IC50濃度)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)冬凌草甲素作用A549細(xì)胞后的機(jī)制研究。

    凋亡在癌癥的發(fā)展中具有重要的作用,Bax 和Bcl-2 是Bcl-2 家族的成員,Bax 在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)起到促進(jìn)作用,其過度表達(dá)可與Bcl-2 拮抗促使細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。自噬在細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)發(fā)育中至關(guān)重要,是一個(gè)進(jìn)化保守的饑餓應(yīng)答過程,Beclin 1 是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可將LC3 自噬蛋白轉(zhuǎn)移至自噬體膜內(nèi)間接促進(jìn)細(xì)胞的自噬[15-16]。LC3 是自噬標(biāo)志的相關(guān)蛋白,主要兩種亞型LC3Ⅱ、LC3Ⅰ,LC3Ⅰ沒有活性,LC3Ⅱ可與線粒體受體蛋白結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞的自噬;LC3Ⅱ與LC3Ⅰ比值可以反映自噬體情況[17-18]。此外,LC3-I 被Atg7 活化,然后在膜內(nèi)與磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián)生成被加工的LC3-Ⅱ。本研究結(jié)果顯示,冬凌草甲素能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡率,上調(diào)Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7 蛋白表達(dá),下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),提示冬凌草甲素可以誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的凋亡和自噬。

    TRAF4 在多種細(xì)胞高表達(dá),是一種致癌基因,最早在乳腺癌內(nèi)發(fā)現(xiàn),可以廣泛參與癌細(xì)胞的發(fā)展,通過抑制TRAF4 抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡等[19-20]。陳剛等[21]研究結(jié)果顯示,TRAF4 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào),生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示TRAF4 是miR-615-5p 的靶標(biāo),miR-615-5p 通過靶向負(fù)調(diào)控TRAF4 發(fā)揮在非小細(xì)胞肺癌中的作用。有研究發(fā)現(xiàn),利用干擾沉默技術(shù),干擾TRAF4通過抑制Notch1 通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞增殖[22]。本研究結(jié)果顯示,冬凌草甲素作用A549 細(xì)胞后,TRAF4 mRNA 和蛋白表達(dá)下調(diào),抑制TRAF4 明顯增加細(xì)胞凋亡率,下調(diào)TRAF4 mRNA 和蛋白表達(dá),上調(diào)Bax、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1、ATG7蛋白表達(dá),下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá),說明抑制TRAF4可以促進(jìn)A549 細(xì)胞的凋亡和自噬。深一步研究結(jié)果顯示,過表達(dá)TRAF4 可以逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)A549細(xì)胞的凋亡和自噬的影響,提示冬凌草甲素通過聯(lián)合TRAF4 發(fā)揮在非小細(xì)胞肺癌中的作用。

    綜上所述,冬凌草甲素能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡和自噬,其作用機(jī)制可能與下調(diào)TRAF4有關(guān)。本研究探究了冬凌草甲素靶向治療非小細(xì)胞肺癌的分子理論基礎(chǔ),然而,其是否還有其他途徑參與冬凌草甲素的抗癌作用仍需要深入探索。

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