植物益生木霉-根系互作機制及其信號物質篩選策略

陳 玉，李宇聰，劉 妍，付嚴松，繆有志，張瑞福,2*

（1 南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，江蘇南京 210095；2 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

木霉菌(Trichodermaspp.)是一類常見的土壤腐生絲狀真菌，能夠以死亡植物和其它真菌為食，廣泛分布于全世界幾乎所有環(huán)境中，包括農(nóng)田、森林、山丘、草地和沙漠等陸地生態(tài)系統(tǒng)以及淡水和海水等環(huán)境[1-2]。在分類上，已鑒定到的木霉屬物種數(shù)目從50 年前的9 種增加至目前的400 多種[3]。作為植物根際最重要的非共生益生真菌，木霉類似于菌根真菌，與宿主植物根系通過多種互作機制改善根系結構和根際環(huán)境，增強植物對生物和非生物脅迫的耐受性，幫助植物抵御病原菌的侵害，促進植物生長[2]。相關研究和專利申請數(shù)量近年呈指數(shù)級增長[2]，木霉屬菌株已被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)并表現(xiàn)出優(yōu)異的植物促生效果。目前已經(jīng)證明對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有益的木霉菌主要屬于深綠木霉(T.atroviride)、綠色木霉(T.viride)、棘孢木霉(T.asperellum)、類棘孢木霉(T.asperelloides)、哈茨木霉(T.harzianum)、貴州木霉(T.guizhounese)、綠木霉(T.virens)等，其中深綠木霉、哈茨木霉、貴州木霉和綠色木霉具有生防和植物促生功能，被用于生產(chǎn)生物農(nóng)藥和生物肥料[3-4]。木霉菌吸收養(yǎng)分、耐受活性氧，在根上生長的能力，以及與其他植物有益微生物的相容性，使它能夠在土壤、根表和根內組織中定殖，有效的根際定殖是根際益生木菌發(fā)揮促生功能的重要前提[2]。木霉基因組中豐富的次級代謝產(chǎn)物基因簇也是其能夠促進植物生長發(fā)育的另一重要因素，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有新結構骨架的木霉天然活性產(chǎn)物種類較少。本文總結了近年來國內外在木霉根際定殖、促生機制和天然活性物質分離純化研究中取得的最新進展，并對篩選和系統(tǒng)挖掘植物益生木霉?jié)撛谛滦突钚晕镔|的策略提出展望。

1 植物益生木霉的定殖方式及其調控機制

木霉通過轉變營養(yǎng)習慣和生態(tài)角色，進化出寄生(parasitism)、腐生(saprotropism) 和互惠共生(mutualism)等多樣化的營養(yǎng)方式[2]。在進化過程中重塑自身基因組以提高其適應新棲息地和競爭營養(yǎng)的能力，是由木霉和宿主基因型等因素共同作用實現(xiàn)的。在首次腐生進化過程中，木霉通過基因水平轉移獲得的多種碳水化合物水解酶編碼基因，為其吸收植物根源性營養(yǎng)物質，擴大寄生和腐生宿主范圍，與植物根系建立互惠共生關系奠定基礎[5](圖1)。

圖1 益生木霉–植物根系互作機制Fig.1 Mechanism of beneficial Trichoderma-root interaction

1.1 木霉根際定殖

植物根源性營養(yǎng)物質(如糖類、氨基酸、酶類等)創(chuàng)造了一個碳源豐富的根際土壤環(huán)境，并作為趨化信號吸引土壤微生物向植物根際遷移并在根際大量繁殖，在植物根系和土壤微生物之間建立動態(tài)的分子通信，為微生物的根際定殖提供條件[6-8]。木霉復雜的碳水化合物吸收和代謝機制，使其能順利定殖在各種富含纖維素和其它碳水化合物的環(huán)境中。在木霉與植物根系的互作中，大多數(shù)木霉能夠利用蔗糖為自身提供碳源和能源[9]，研究表明，綠色木霉能夠分泌蔗糖轉化酶(invertase，TvInv)，利用植物根際蔗糖進行根際定殖和參與植物防御激活反應[10]。蔗糖還能夠作為區(qū)分植物凋落物和植物活體根系的信號來調控木霉根際定殖，在蔗糖存在的情況下，綠色木霉能夠降低自身水解酶活性避免對宿主產(chǎn)生過度損傷[11-12]。不同木霉菌株蔗糖轉化酶的差異可能與菌株的進化策略有關，使得木霉采用不同的代謝策略進行根際定殖[5]。此外，木霉也能夠利用水楊酸調控其在植物根際的定殖。木霉到達植物根部后，植物內源水楊酸(一種調控木霉早期定殖的關鍵植物激素)水平迅速提升，將木霉限制在根表皮和皮層的植外體空間內[13]，然后木霉通過分泌一系列植外體效應蛋白和代謝物(如木聚糖酶、賴氨酸蛋白、角蛋白–白蛋白、萜烯三苯和哈茨木霉酸 A)誘導根部活性氧(ROS)爆發(fā)[2]，而木霉對ROS 的耐受性使其能與植物根部建立一種長期的共生關系[14]。此外，結構類物質(如角鯊烯和麥角甾醇)的平衡對于維持真菌細胞膜的穩(wěn)定性非常重要，能夠影響木霉在植物根際的定殖能力，并且在調節(jié)植物防御和生物防治中具有關鍵作用[15]。

1.2 木霉根內定殖

植物根系表面并非穩(wěn)定的連續(xù)屏障，常出現(xiàn)裂縫或自然開口。木霉可通過損傷、組織擴張或特殊的細胞結構進入植物組織內部并在其中定殖。哈茨木霉是報道最多的內生木霉菌種，加勒比木霉(T.caribbaeum)、擬康寧木霉(T.koningiopsis)、里克菲爾德氏木霉(T.lieckfeldtiae)、稀孢木霉(T.paucisporum)、可可木霉(T.theobromicola)也曾有報道[2]。木霉生命周期中的內生階段在生態(tài)學上具有重要意義，因為一旦植物組織死亡，根內定殖則提供了相對于純腐生微生物的選擇優(yōu)勢[16-17]。木霉在植物根際定殖后能夠穿透根表進入植物細胞，誘導植物局部和全身的免疫防御反應。研究表明，在植物免疫系統(tǒng)的防御下，木霉菌絲通常不會到達根系木質部，而是被限制在根皮層中[13,18]。組織分離實驗結果顯示，內生木霉具有木質部定殖偏好性[19]。作為腐生真菌，木霉具有復雜的蛋白酶系統(tǒng)，這些真菌蛋白酶對于木霉的內生定殖十分重要[4]，已報道的參與木霉內生定殖的蛋白酶包括纖維素酶、木聚糖酶、角蛋白、潤漲蛋白、多聚半乳糖醛酸內切酶、疏水蛋白和蔗糖轉化酶[9,20]。水分及營養(yǎng)物質的可用性、氧環(huán)境和復雜的植物根系結構也是限制木霉根內有效定殖的重要因素，植物不同部位營養(yǎng)物質組成大不相同，一些組織隨著衰老產(chǎn)生的營養(yǎng)物質有利于木霉定殖[16]。對于影響根際益生木霉定殖方式的因素，以及該益生真菌如何逃避植物免疫系統(tǒng)成功定殖等問題仍然缺乏系統(tǒng)的研究。

2 植物益生木霉的促生信號物質

定殖于根際的木霉能夠產(chǎn)生超過120 種不同類型的次級代謝產(chǎn)物(secondary metabolites，SMs)，其中以萜烯、吡喃酮、多酮和非核糖體肽最為常見[2]。目前，木霉菌中一些影響植物根系構型、調節(jié)根系養(yǎng)分吸收的信號物質已被鑒定，初步闡明了木霉SMs 調控植物生長發(fā)育的分子機制[6,21-27](圖1)。

2.1 木霉調控根系發(fā)育

植物根系結構(root system architecture, RSA)在養(yǎng)分和水分吸收、土壤錨固和根際微生物互作中扮演著不可或缺的角色[28-29]。RSA 的形成是一個復雜過程，受到多種生物和非生物因素的影響，如植物激素、光照、水分、鹽堿和營養(yǎng)脅迫[30-32]。木霉基因組中含有植物激素合成相關基因，調控生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、水楊酸和乙烯等的合成和分泌，參與激活植物內源生長素的轉運和信號轉導，促進植物根系發(fā)育[21]。然而，植物根際木霉分泌的生長素過量積累會引起根際酸化，并通過生長素依賴的途徑反向抑制植物根系生長[33]。除上述激素外，目前鑒定的具有調控根系發(fā)育功能的木霉活性物質(表1)有koninginins、6-pentyl-α-pyrone (6PP)、trichocaranes A-D、trichokonin VI、harzianopyridone、cyclonerodiol、harzianolide、harzianic acid[22]。6PP能夠調控擬南芥(Arabidopsisthaliana)生長素轉運蛋白和信號通路基因的表達，干擾植物內源生長素通路和乙烯響應調節(jié)子EIN2，誘導植物側根形成[23]。長枝木霉(T.longibrachiatum)胞外分泌的康寧霉素trichokonin VI 能夠改變根系結構，調節(jié)生長素局部生物合成和極性運輸過程[47]。貴州木霉胞外分泌物cedrene 和TgSWO 均能促進擬南芥?zhèn)雀l(fā)育[24,34-48]。目前研究結果顯示，木霉主要通過分泌信號物質調控植物內源生長素途徑來促進植物根系發(fā)育，生長素轉運或信號傳遞相關基因的突變(axu1、big、eir1、axr1)能夠降低木霉對植物生長和根系發(fā)育的促進效果[10,36,49]。

揮發(fā)性有機物(volatile organic compounds，VOCs) 在植物-微生物互作中發(fā)揮著重要的信號作用，除上述物質外，木霉還能夠釋放多種VOCs 與植物互作并參與誘導側根起始[22,50-52]。深綠木霉能夠產(chǎn)生至少25 種VOCs，包括醇、酮、烷烴、呋喃、吡喃酮、單萜和倍半萜類物質，氣態(tài)乙烯被認為能夠作為信號分子在真菌-植物互作中發(fā)揮核心作用[50,53]。非接觸情況下，綠色木霉能夠釋放VOCs 提高擬南芥生物量，其中以倍半萜烯類(sesquiterpenes，SQTs)含量最高[54]。

2.2 木霉調控養(yǎng)分吸收

在土壤–根系界面，養(yǎng)分元素經(jīng)歷了復雜的溶解、吸收、轉運的動態(tài)過程，這種過程受根際微生物活動的影響[55-57]。植物益生菌能夠通過刺激根系生長、促進營養(yǎng)元素遷移和活化根際養(yǎng)分等，幫助大多數(shù)植物改善其礦質營養(yǎng)吸收[58-61]。土壤養(yǎng)分的吸收利用需要從根際轉移到根表，對于絲狀真菌定殖的根系而言，養(yǎng)分能夠通過絲狀真菌菌絲從根際土壤轉移至根表。木霉釋放的有機酸(如檸檬酸、草酸、酒石酸等，表1)能夠溶解含鉀礦物釋放鉀離子，提高植物根際鉀元素的有效性[4]。選用能夠溶解不同磷酸鹽的木霉菌可以提高植物根際磷的有效性，增強植物根系對磷養(yǎng)分的吸收，從而促進植物生長[25]。鐵是微生物繁殖和植物生長的必需營養(yǎng)元素之一，但植物可利用性Fe3+在有氧條件下會與氧氣反應形成不溶性的鐵氫氧化物，降低土壤中鐵的有效性[6]。木霉能夠產(chǎn)生鐵載體(coprogen、coprogen B、fusarinine C、ferricrocin、harzianic acid)螯合土壤鐵氫氧化物中的鐵離子，為植物提供鐵營養(yǎng)[12-13]。在缺鐵條件下，木霉能夠分泌多種類型的鐵載體，鐵載體的多樣性是非核糖體肽合成酶(NRPS)活性修飾的結果，而非NRPS 編碼基因差異所致[27]。目前，木霉SMs 促進植物根際養(yǎng)分利用的研究主要集中在溶磷、鐵和解鉀方面，關于木霉SMs 調控植物養(yǎng)分吸收速率和植物胞內養(yǎng)分轉運功能分子機制的研究鮮有報道。

3 植物益生木霉活性物質的挖掘策略

木霉的基因組中包含不同糖基水解酶、次級代謝物、抗生素、具有殺蟲特性的凝集素、具有生物修復潛力的轉運蛋白等的合成基因簇，它們在植物生長、病原菌防控和土壤調理中起著重要作用[62-63]。盡管如此，目前分離鑒定得到的木霉新活性SMs 種類和數(shù)量依然非常少，新結構、高活性木霉次級代謝產(chǎn)物的獲得，需要行之有效的高通量篩選手段，生物活性導向型篩選和基因組挖掘篩選是目前常用的兩種方法。近年來，一些新開發(fā)的分析工具和改進的微生物培養(yǎng)方法也為木霉SMs 挖掘提供了新的技術手段[64]。

3.1 生物活性導向型篩選

傳統(tǒng)的生物活性導向分離策略主要包括發(fā)酵粗提物生產(chǎn)、生物活性檢測和化學性質表征3 個階段。發(fā)酵基質中溶質的溶解性取決于溶劑與溶質的極性，了解目標化合物的極性對選擇萃取溶劑十分重要。有機溶劑萃取法具有簡單、實用、高性能、低成本和低設備要求等優(yōu)點，但存在致毒性、溶劑消耗大和潛在環(huán)境污染等缺點。此外，還需考慮提取方法、溶劑毒性、待提取化合物的穩(wěn)定性以及成本等因素[65]。生物活性導向分離天然產(chǎn)物的通用策略如下：1) 使用反相高效液相色譜法(reverse-phase HPLC)分析有機溶劑二氯甲烷或乙酸乙酯萃取粗提物；2) 使用自動餾分收集器將各分離餾分收集到96 孔板中；3)對所有餾分進行生物活性測試確定有效餾分(可根據(jù)實際操作過程、粗提物復雜程度、目標活性物質穩(wěn)定程度等進行多次分離純化)，用半制備高效液相色譜法(semi-prep-HPLC)對有效餾分進行色譜分離，對所有餾分進行生物活性測試以確認活性部分，獲得具有生物活性的純物質；4)將活性餾分注入超高效液相色譜四極飛行時間質譜(UHPLCqTOF-MS)，利用MS/MS 數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫確認活性部分的身份；5)利用UV、IR、MS 和NMR 等技術獲得活性化合物的光譜數(shù)據(jù)進行結構解析并獲得生物學數(shù)據(jù)[66]。傳統(tǒng)的生物活性的分離過程耗時耗力，存在較大的局限性，例如當木霉離開其自然棲息地在實驗室培養(yǎng)時，其基因組中一些生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters, BGCs)會選擇性沉默不表達；一些BGCs 合成的SMs 在本源菌中產(chǎn)量較低；一些已知的SMs 在篩選過程中會重復出現(xiàn)等[67]。因此，單純使用生物活性導向型篩選方法獲得結構新穎的木霉SMs 的概率越來越低。

3.2 基因組挖掘篩選

基因組挖掘是以基因簇序列和生物合成途徑為導向的天然產(chǎn)物發(fā)掘新策略，它直接將天然產(chǎn)物結構與合成途徑關聯(lián)，進行生物合成和組合生物合成研究，有助于微生物天然產(chǎn)物化學研究逐漸克服隨機性、盲目性和偶然性[68]。合成生物學技術、生物信息學分析工具(如anti-SMASH 和SMURF)能夠為木霉代謝產(chǎn)物BGCs 是否合成具有新化學支架的物質提供線索[64]。方法如下：1) 對于基因組中明確的BGCs，在本源菌中將其敲除，通過HPLC-MS 手段比較分析突變株和野生株的次級代謝譜，確定可能是目標BGCs 合成化合物的差異峰；2)對于在本源菌中不表達或表達量較低的BGCs，需要通過遺傳操作將其激活進而發(fā)現(xiàn)其編碼的天然產(chǎn)物；3)對于基因組中未知的BGCs，其產(chǎn)物結構或理化性質無法預測，可通過沉默未知BGCs 中負責產(chǎn)物合成的必需基因，結合突變株和野生株代謝產(chǎn)物的HPLC-MS 平行檢測，發(fā)現(xiàn)未知BGCs 所編碼的代謝產(chǎn)物[69]。劉天罡等將自動化高通量操作平臺(auto-HTP 工作站)引入天然產(chǎn)物挖掘領域，發(fā)現(xiàn)了絲狀真菌萜類物質的巨大生產(chǎn)能力，實現(xiàn)了絲狀真菌萜類BGCs 的批量挖掘和相關次級代謝產(chǎn)物的高效合成[67]，該技術有效解決了絲狀真菌SMs 研究領域的“三低”(研究通量低、產(chǎn)物集中度低和物質產(chǎn)量低)技術難題，顯著提升了新產(chǎn)物的發(fā)掘效率[54]。

4 展望

全球氣候變化、農(nóng)業(yè)高度集約化、植物病害以及化學肥料過量施用對土壤、空氣和水資源的污染，對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成了極大的危害。以木霉為代表的相關農(nóng)用微生物制劑，可以減少化學品的投入，促進農(nóng)業(yè)的綠色和可持續(xù)發(fā)展[70]。木霉生物制劑除了包含活菌的生物制品，還包含來源于木霉的天然活性化合物(如6PP、鐵載體、木霉源植物激素)制品，均可用以作物增產(chǎn)增收[71]。木霉天然活性化合物的研究、選擇和使用，對于研發(fā)新一代生物肥料、降低化肥的施用以及實現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

植物根系作為吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，其發(fā)育受到復雜的生物和非生物因素調控。木霉作為植物根際含量豐富的益生真菌，闡明木霉促進植物根系發(fā)育、養(yǎng)分利用的相關信號物質和遺傳基礎，有助于合理使用益生木霉進行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。盡管近年來對木霉–植物互作促生的理論和應用研究均取得了長足進步，但木霉在農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)中的潛力仍未被充分挖掘，對木霉與植物根系互作的信號基礎、功能、機制等均缺乏深入系統(tǒng)的研究，對木霉誘導植物根系發(fā)育和養(yǎng)分高效利用機理方面的研究并不全面，木霉活性SMs 分離純化等進展緩慢，限制了木霉-植物互作增效潛力的發(fā)揮。未來在益生木霉-植物根系互作研究中應重點圍繞以下幾個方向：

1)可以結合合成生物學技術，通過多模塊基因序列分析，預測并分析其編碼的化合物結構，指導生物合成基因簇編碼天然產(chǎn)物的定向分離和純化。

2)調控基因的研究和應用，還應當充分借鑒轉錄組學、蛋白質組學、表觀遺傳學等生命科學研究的最新成果，進一步開發(fā)質譜技術、微量核磁技術等分析手段，在新型天然化合物發(fā)掘上的應用潛力。

3)系統(tǒng)闡明木霉天然活性產(chǎn)物調控根系發(fā)育的分子途徑，不僅僅局限于經(jīng)典生長素途徑。

4)根據(jù)不同作物對養(yǎng)分需求的差異性，探索綜合利用木霉不同天然活性產(chǎn)物組合調控根系養(yǎng)分高效吸收的技術體系。篩選出調控水稻、玉米和小麥等糧食作物根系發(fā)育，增強根系對不同外界環(huán)境變化適應性的新型木霉天然次級代謝產(chǎn)物。