加工對(duì)鐵皮石斛中8種神經(jīng)毒性農(nóng)藥殘留的影響

凌淑萍,呂 燕,付 巖,張 亮,王全勝,吳銀良*

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江寧波 315040;2.寧波市特色農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315040)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是我國一種名貴中藥材,為蘭科多年生草本植物,莖可入藥[1]?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版記載,鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱等功效[2]。作為一種藥食同源的作物[3],近年來需求量逐年增加。2020年上半年鐵皮石斛出口量和出口價(jià)值分別為13 t和12.08萬美元。為保護(hù)鐵皮石斛種質(zhì)資源,對(duì)其進(jìn)行人工栽培,才可以滿足日益增長的需求[4]。現(xiàn)有登記農(nóng)藥種類與中藥材病害防治需求相差巨大,導(dǎo)致非登記農(nóng)藥亂用,甚至高毒禁限用農(nóng)藥濫用現(xiàn)象存在,造成中藥材上的農(nóng)藥殘留污染[5],可能對(duì)人體健康存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。具有神經(jīng)毒性的農(nóng)藥可損害包括皮質(zhì)、海馬、紋狀體在內(nèi)的大量中樞神經(jīng)系統(tǒng),大劑量接觸后可導(dǎo)致頭昏、頭痛、惡心、嘔吐,嚴(yán)重者發(fā)生抽搐、昏迷甚至死亡[6]。此外有機(jī)磷農(nóng)藥在長期、低劑量暴露情況下,可致認(rèn)知功能發(fā)生損傷,這種損傷常被忽視,但對(duì)患者生活和工作可造成嚴(yán)重影響,甚至進(jìn)展為阿爾茨海默病及帕金森病等不可逆性的神經(jīng)退行性病變[7]。目前鐵皮石斛中農(nóng)藥檢測的方法有氣相色譜、三重四極質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[8-10]。此外,Fu等[11]使用HPLC-MS/MS分析了戊唑醇、肟菌酯等12種農(nóng)藥并進(jìn)行暴露評(píng)估。唐靖雯等[12]對(duì)貴州鐵皮石斛葉的質(zhì)量及安全進(jìn)行評(píng)價(jià)。

鐵皮石斛鮮品內(nèi)部含水量較高,易霉變,不易保存和運(yùn)輸,根據(jù)《中國藥典》2020年版,鐵皮石斛采收后,除去雜質(zhì),剪去部分須根,邊加熱邊扭成螺旋形或彈簧狀,烘干;或切成段,干燥或低溫烘干,前者習(xí)稱“鐵皮楓斗”(耳環(huán)石斛),后者習(xí)稱“鐵皮石斛”[2]。喻明軍等[13]開發(fā)了鐵皮石斛低溫烘烤法,使得鐵皮石斛的活性成分更好保留。近年來,對(duì)鐵皮石斛加工利用方式增多,鐵皮石斛產(chǎn)品種類增加。如孫傳伯等[14-15]研制出鐵皮石斛酒;施蕊等[16]將石斛葉提取物制成浸膏;陸倩倩等[17]以鐵皮石斛、青錢柳和玫瑰茄為原料,研制出液體口香糖;周兵等[18]將鐵皮石斛制成茶包,方便飲用。魏練平等[19-20]提取鐵皮石斛中的活性物質(zhì)制備成護(hù)眼和抗癌藥物,目前鐵皮石斛市場依然以傳統(tǒng)的鐵皮楓斗為主[21]。雖然鐵皮石斛鮮條采收后,會(huì)進(jìn)行簡單的清洗和搓皮,這些過程只能去除表面部分的農(nóng)藥殘留,而克百威、吡蟲啉等有些農(nóng)藥具有內(nèi)吸性,通過清洗和搓皮不能被有效去除。但是烘烤過程會(huì)使作物中的農(nóng)藥殘留水平發(fā)生變化[22]。鐵皮楓斗加工過程最主要的是烘烤,而烘烤對(duì)鐵皮石斛農(nóng)藥殘留加工因子的研究鮮見報(bào)道。該研究主要考察吡蟲啉、阿維菌素、茚蟲威等8種具神經(jīng)毒性的農(nóng)藥及其代謝物通過模擬鮮條制作成鐵皮楓斗的加工方式,在經(jīng)12、24和48 h烘烤后,用UPLC-MS/MS測定殘留量并計(jì)算加工因子。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Acquity UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、色譜柱Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國Waters公司);KS4000ic恒溫振蕩器、T25高速勻漿機(jī)、GENIUS3旋渦混合器(德國IKA公司);3K15高速離心機(jī)(德國Sigma公司);PL1502E電子天平、XPE205十萬分之一電子天平(美國Mettler Toledo公司);BAO-150A鼓風(fēng)干燥箱(美國STIK公司)。

3-羥基克百威(純度97.16%)、啶蟲脒(純度99.7%)、阿維菌素(純度95.3%)、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(純度96.42%)、吡蟲啉(純度99.2%)、茚蟲威(純度98.5%)標(biāo)樣購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;克百威(濃度1 g/L)購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;毒死蜱(濃度1 g/L)、三唑磷(濃度1 g/L)購于上海市農(nóng)藥研究所有限公司;乙腈(色譜純,德國默克公司);甲酸(色譜純,阿拉丁生物科技股份有限公司); 硫酸鎂(分析純,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙酸鈉(分析純,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 農(nóng)藥殘留加工因子測定采收的石斛鮮條去除根部、葉片、葉梢和花序殘留部分,清洗干凈,放在通風(fēng)陰涼處晾干。整個(gè)莖部分用不銹鋼刀切成小段,并在不銹鋼盆中充分混勻,稱取一定量的混勻樣品,定量添加8種農(nóng)藥和1種代謝物(3-羥基克百威)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,克百威母體與其代謝物單獨(dú)添加測定。添加后混合均勻,于70 ℃烘烤,在1和24 h分別取樣,停機(jī)4 h,再烘烤24 h,共3次,分別裝入封口樣品容器中,貼好標(biāo)簽,冷凍保存。試驗(yàn)重復(fù)3次。

為了能夠直觀地表示殘留在加工前后降低或濃縮的情況,通常采用加工因子(processing factor,PF)來表示。加工因子計(jì)算公式為:PF=加工食品中農(nóng)藥殘留量/初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留。

1.3 實(shí)驗(yàn)室樣品制備。

(1)鐵皮石斛鮮條市場樣品。去除根部、葉片、葉梢和花序殘留部分,整個(gè)莖部分用不銹鋼刀切碎,并在不銹鋼盆中充分混勻,用四分法縮分樣品,裝入封口樣品容器中,貼好標(biāo)簽。

(2)鐵皮石斛干樣。將楓斗磨成粉末后裝入樣品盒中,貼好標(biāo)簽。

1.4 樣品前處理方法50 mL離心管中加入一顆陶瓷均質(zhì)子,再分別稱取鐵皮石斛鮮樣5.0 g、干樣2.5 g置于離心管中,鮮樣加入純凈水5.0 mL,干樣加入純凈水12.5 mL,振蕩混勻,靜置30 min,加入20.0 mL乙腈劇烈振蕩1 min,加入 6 g無水硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉,劇烈振蕩1 min,再以4 200 r/min離心5 min。定量吸取上清液至內(nèi)含除水劑和凈化劑的塑料離心管中,每1 mL提取液用150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA和50 mg C18,渦旋混勻1 min。吸取上清液0.5 mL至另一試管中,用0.1%甲酸溶液定容至1.0 mL,混合均勻,過0.22 μm濾膜后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制分別稱取9種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解并定容,分別配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液,于-20 ℃避光保存。用前處理方法制備的鐵皮石斛空白樣品基質(zhì)稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.100 0、0.050 0、0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 mg/L的鐵皮石斛基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.6 儀器條件色譜柱為Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm); 流動(dòng)相A相為0.1%甲酸溶液,B相為乙腈; 梯度洗脫條件:B相在1.0 min內(nèi)保持50%后,在0.1 min內(nèi)增至80%,保持4.9 min,然后在0.1 min內(nèi)降至50%,保持1.9 min; 流速0.20 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。電噴霧電離源正離子模式電離; 多反應(yīng)監(jiān)測(MRM); 毛細(xì)管電壓2.5 kV; 射頻電壓0.5 V; 離子源溫度150 ℃; 脫溶劑氣溫度500 ℃; 錐孔氣流速50 L/h; 脫溶劑氣流速1 000 L/h,其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 農(nóng)藥分析的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters for pesticide analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線與靈敏度用鐵皮石斛干樣空白基質(zhì)稀釋液將9種標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按“1.6”儀器條件進(jìn)樣檢測,得到峰面積(y)與進(jìn)樣濃度(x,mg/L)的線性回歸方程,并計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,在濃度范圍內(nèi),各化合物峰面積與濃度線性關(guān)系良好,線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和基質(zhì)效應(yīng)如表2所示。在上述條件下,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線最低檔濃度(0.000 1～0.000 5 mg/kg)和進(jìn)樣量(10 μL),計(jì)算得到各農(nóng)藥最小檢出量為1.0×10-12～5.0×10-12g。由于大部分農(nóng)藥存在明顯的基質(zhì)效應(yīng),為了更精確定量,選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。8種農(nóng)藥及其代謝物的典型離子色譜圖如圖1所示。

表2 8種農(nóng)藥及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equation,correlation coefficient and matrix effect of 8 pesticides and their metabolite

圖1 8種農(nóng)藥及其代謝物的典型離子色譜圖Fig.1 Typical ion chromatograms of 8 pesticides and their metabolites

2.2 添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差該研究基于QuEChERS作為前處理,優(yōu)化凈化條件、MS/MS參數(shù)和流動(dòng)相體系,建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析方法。按照“1.4”方法進(jìn)行前處理。添加濃度為0.01、0.10和1.00 mg/kg,每個(gè)添加濃度重復(fù)5次,進(jìn)行添加回收試驗(yàn),按“1.6”儀器條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果表明,當(dāng)9種化合物在鐵皮石斛中的添加濃度為0.01 mg/kg時(shí),添加回收率在60%～120%,RSD≤20%;添加濃度為0.10～1.00 mg/kg時(shí),添加回收率在70%～110%,RSD≤15%;表明該方法具有較高的回收率和精密度,可滿足農(nóng)藥殘留檢測要求。

2.3 加工因子測定該研究對(duì)鐵皮石斛加工過程中8種神經(jīng)毒性農(nóng)藥及其代謝物進(jìn)行殘留動(dòng)態(tài)研究,以加工因子表示。結(jié)果表明(表3),70 ℃條件下,烘烤12 h,加工因子普遍較高,排前3位的化合物為茚蟲威、三唑磷和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽,平均值分別為5.5、4.8和4.8;烘烤結(jié)束(48 h),所有化合物的加工因子在1.0～3.0。

表3 鐵皮石斛農(nóng)藥殘留加工因子Table 3 Processing factor of the pesticides residues in D.officinale

3 結(jié)論與討論

該研究主要通過模擬鐵皮石斛加工工藝,將鮮樣于70 ℃條件下烘烤12～48 h,研究8種神經(jīng)毒性農(nóng)藥及其代謝物殘留變化規(guī)律。結(jié)果表明,在70 ℃條件下,烘烤12～48 h,上述8種農(nóng)藥及其代謝物均表現(xiàn)為濃縮效應(yīng)。烘烤12 h,農(nóng)藥的殘留量最高,說明前12 h以脫水濃縮效應(yīng)為主。且隨著烘烤時(shí)間的延長,水分流失減小,殘留量呈降低趨勢(shì)。烘烤48 h,上述所有農(nóng)藥的加工因子在1.0～3.0。適當(dāng)?shù)匮娱L烘干時(shí)間可降低上述農(nóng)藥的殘留。然而石斛莖切片干的制作烘烤時(shí)間要遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)鐵皮楓斗的烘烤時(shí)間,另外還有低溫烘烤模式的發(fā)明和使用,使其農(nóng)藥的殘留量只會(huì)呈現(xiàn)出更明顯的濃縮效應(yīng)。因此,鐵皮石斛干樣的烘烤制作過程并不能使大部分農(nóng)藥殘留量減少。雖然清洗和搓皮可以去除表面殘留的農(nóng)藥,但對(duì)于內(nèi)吸性的農(nóng)藥,要結(jié)合作物的發(fā)育階段和病蟲害的嚴(yán)重程度,合理確定農(nóng)藥的使用時(shí)間,才能最大程度地減少農(nóng)藥殘留。將此次試驗(yàn)加工因子應(yīng)用于石斛鮮條初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥監(jiān)測,可估算制成石斛干樣農(nóng)藥最終殘留,避免沒有達(dá)到安全采收期就采收的現(xiàn)象。此外將加工因子數(shù)據(jù)納入膳食暴露評(píng)估模型,可優(yōu)化膳食評(píng)估方法,從而提高評(píng)估準(zhǔn)確性。該研究為石斛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供有益借鑒。