獼猴桃根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌分離及潰瘍病拮抗菌篩選

楊 睿,汪琳羅沙,姚 迪,唐蘊(yùn)哲,張婧一,彭清忠

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南吉首 416000)

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)引起的細(xì)菌病害,具有發(fā)生范圍廣、傳播速度快、致病性強(qiáng)、防治難度大等特點(diǎn),短期內(nèi)極易造成大面積樹(shù)體死亡[1]。目前,采用抗生素(如鏈霉素、春日霉素)和銅制劑(如銅氧化物、銅氫氧化物)的化學(xué)防治是主要防控措施,但該方法極易引起Psa的耐藥性,并且使用后抗生素和重金屬殘留污染環(huán)境[2-5]。生物防治是環(huán)境友好型植物健康管理新方式,具有無(wú)污染,無(wú)殘留,不殺傷天敵,不易產(chǎn)生抗藥性,利于人畜安全及環(huán)境保護(hù),兼防兼治,增產(chǎn)增收等優(yōu)點(diǎn),符合人們對(duì)綠色食品的需求[6]。因此,利用生物防治法控制獼猴桃潰瘍病更具應(yīng)用前景。

根際土壤微生物是土壤的重要組分,對(duì)于植物健康的意義可以類比為腸道微生物對(duì)于人類健康的作用,在肥力演變、物質(zhì)循環(huán)及促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,可直接影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量[7]。在根際土壤微生物中包含許多對(duì)植物有益的微生物群落,它們通過(guò)相互作用構(gòu)建植物特殊免疫屏障,能夠抑制病原菌,一定程度防止植物發(fā)病[8-10]。從根際土壤中篩選得到的病蟲(chóng)害拮抗菌,由于直接來(lái)源于土壤,作為生物防治劑具有快速適應(yīng)環(huán)境的優(yōu)勢(shì)?；诖?筆者采用擬純培養(yǎng)法從湘西地區(qū)獼猴桃植株根際土壤樣品中分離細(xì)菌,進(jìn)行鑒定和微生物多樣性分析,然后利用牛津杯法篩選拮抗Psa的菌株,以期為獼猴桃潰瘍病生物防治劑的研制積累種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集以湘西地區(qū)3個(gè)獼猴桃主要種植區(qū)作為采樣點(diǎn),即保靖縣遷陵鎮(zhèn)(28°07′N,109°57′E),永順縣松柏鎮(zhèn)(28°54′N,110°4′E),鳳凰縣阿拉營(yíng)鎮(zhèn)(27°54′N,109°22′E)的“米糧1號(hào)”和“紅陽(yáng)”獼猴桃果園,隨機(jī)采集2種獼猴桃根際土壤樣品,放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 培養(yǎng)基配置LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,NaCl 10 g,酵母膏5 g,水1 000 mL,pH 7.0;高氏一號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20.00 g,NaCl 0.50 g,KNO31.00 g,K2HPO40.50 g,MgSO4·7H2O 0.50 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,水1 000 mL,pH 7.0。固體培養(yǎng)基均加入2.0%瓊脂。

1.3 可培養(yǎng)細(xì)菌分離將采集的獼猴桃植株根際土壤樣品各稱取5 g,加入至裝有50 mL無(wú)菌水的三角瓶中,25 ℃,150 r/min 振蕩0.5 h,使土樣充分分散。然后將土樣稀釋100倍,吸取上清液各200 μL涂布于不同培養(yǎng)基上。放入培養(yǎng)箱28 ℃恒溫培養(yǎng)2～4 d,待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落后,記錄細(xì)菌數(shù)量,挑取形態(tài)不同的單菌落,通過(guò)四分體劃線純化菌株,利用LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接3次,保存菌種。

1.4 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株總DNA,利用細(xì)菌通用引物PA/PB(PA:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;PB:5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′)對(duì)分離菌株分別進(jìn)行16S rDNA序列PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:TaqPCR Mix (2X) 25 μL;正反引物各1 μL;模板2 μL;無(wú)菌水補(bǔ)齊至50 μL。PCR程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性2.5 min;95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)得的序列送至GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù),采用Blast工具軟件搜索同源序列并進(jìn)行比較分析,運(yùn)用Mega 7.0軟件中的鄰位加入法(neighbor joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),根據(jù)同源性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,確定菌株的種類歸屬。

1.5 獼猴桃潰瘍病拮抗菌株篩選供試菌株為從獼猴桃根際土壤中分離得到的細(xì)菌,供試靶標(biāo)菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidae,Psa)為實(shí)驗(yàn)室前期分離鑒定的菌株L211。首先將供試菌株種子液按1%接種量加入液體LB培養(yǎng)基25 ℃,150 r/min培養(yǎng)48 h制成發(fā)酵液,接著分別利用離心機(jī)和冷凍真空干燥儀對(duì)上清液進(jìn)行提取和濃縮備用;取200 μL靶標(biāo)菌L211發(fā)酵液涂布于LB培養(yǎng)基上,在每個(gè)平板上放置1個(gè)牛津杯,加入200 μL供試菌株濃縮后的發(fā)酵上清液,于25 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離采用純培養(yǎng)法從2種獼猴桃根際土壤樣品中分離獲得164株細(xì)菌(含放線菌)。從2種培養(yǎng)基的分離情況看,LB培養(yǎng)基分離效果較好,菌落數(shù)量和菌落形態(tài)較為豐富;高氏一號(hào)培養(yǎng)基分離效果相關(guān)較差,菌落形成單位低,且菌落顏色單一。綜合分析菌落形態(tài)特征,去除部分冗余,最終從164株根際土壤細(xì)菌中選取142株代表菌株開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 根際土壤細(xì)菌類群多樣性提取分離菌株基因組DNA,PCR擴(kuò)增獲得序列長(zhǎng)度約1.5 kb的16S rRNA基因片段,經(jīng)測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化分析,初步鑒定142株細(xì)菌分別屬于4門(Actinobacteria,Bacteroidetes,Firmicutes,Proteobacteria),6綱(Actinomycetia,Alphaproteobacteria,Betaproteobacteria,Gammaproteobacteria,Bacilli,Flavobacteriia),11目(Bacillales,Burkholderiales,Corynebacteriales,Flavobacteriales,Hyphomicrobiales,Micrococcales,Pseudomonadales,Rhodospirillales,Sphingomonadales,Streptomycetales,Xanthomonadales),18科(Azospirillaceae,Bacillaceae,Boseaceae,Burkholderiaceae,Comamonadaceae,Flavobacteriaceae,Microbacteriaceae,Micrococcaceae,Micrococcales,Nocardiaceae,Paenibacillaceae,Pseudomonadaceae,Rhizobiaceae,Sphingomonadaceae,Sporolactobacillaceae,Staphylococcaceae,Streptomycetaceae,Xanthomonadaceae),28屬(Azospirillum,Bacillus,Falsibacillus,Lysinibacillus,Metabacillus,Priestia,Bosea,Burkholderia,Caballeronia,Cupriavidus,Paraburkholderia,Ralstonia,Variovorax,Flavobacterium,Microbacterium,Arthrobacter,Sinomonas,Rhodococcus,Paenibacillus,Pseudomonas,Ensifer,Rhizobium,Novosphingobium,Scopulibacillus,Staphylococcus,Kitasatospora,Streptomyces,Stenotrophomonas)。其中,Firmicutes門菌株為優(yōu)勢(shì)菌群(70株,49.3%),其余依次為Beta-proteobacteria亞門(42株,29.6%)、Actinobacteria門(19株,13.4%)、Alpha-proteobacteria亞門(6株,4.2%)、Gamma-proteobacteria亞門(4株,2.8%)和Bacteroidetes門(1株,0.7%)。在屬水平上優(yōu)勢(shì)屬為Bacillus(62株,43.7%)(表1)。結(jié)果表明,獼猴桃根際土壤細(xì)菌具有豐富的類群多樣性。

2.3 根際土壤細(xì)菌物種和遺傳多樣性根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,采用16S rRNA基因序列同源性≥97%可歸為同一種的原則,142株細(xì)菌可歸為76個(gè)物種。其中,有104株分離菌株與典型菌株16S rRNA基因序列相似性在97.03%～100%,可基本確定其分類地位;有38株細(xì)菌與典型菌株16S rRNA基因同源性在92.03%～96.87%,可能為潛在的新種或新屬,分類地位有待進(jìn)一步確定(表1)。這表明分離菌株與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的典型菌株之間存在較大的遺傳差異,具有遺傳多樣性。

表1 獼猴桃根際細(xì)菌與其關(guān)系最密切典型菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Table 1 Phylogenetically closest neighbors of kiwifruit rhizosphere bacteria based on 16S rRNA gene sequence analysis

接下表續(xù)表1

接下表續(xù)表1

2.4 獼猴桃潰瘍病拮抗菌篩選與鑒定以分離的142株細(xì)菌為供試菌株,通過(guò)牛津杯試驗(yàn)初篩,發(fā)現(xiàn)4株細(xì)菌(菌株編號(hào)A11、D1h、A4和B15)的發(fā)酵液在牛津杯周圍出現(xiàn)抑菌圈(圖1),說(shuō)明這4株菌能夠抑制潰瘍病菌Psa的生長(zhǎng),其發(fā)酵液中可能存在拮抗Psa生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物或降解Psa菌體成分的蛋白酶類。對(duì)4株拮抗菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)菌株A11和D1h與紅球菌屬的Rhodococcusgloberulus(MG575949、EU004416、MK356456、MT555342)聚為一支,其與關(guān)系密切典型菌株的16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上;A4與芽孢桿菌屬的Bacillusthuring(FJ601902.1) 、Bacilluscereus(HG800012.1) 、Bacillustoyonensis(MG561363.1)、Bacillusacidiproducens(MF446886.1) 、Bacilluswiedmannii(MW435481.1)聚為一支,其16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上;B15與鏈霉菌屬的Streptomycestriticiradicis(MN512450)聚為一支,其16S rRNA基因序列同源性在97.00%以上(圖2)。初步確定,菌株A11和D1h屬于紅球菌屬(Rhodococcus),菌株A4屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),B15屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)。

3 討論

該試驗(yàn)從獼猴桃根際土壤中分離獲得了142株細(xì)菌,分別歸屬于細(xì)菌域六大系統(tǒng)發(fā)育類群(Actinobacteria,bacteroidetes,Firmicutes,Alphaproteobacteria,Betaproteobacteria,Gammaproteobacteria)、11個(gè)目、18個(gè)科、28個(gè)屬、76個(gè)物種,其16S rRNA基因序列與關(guān)系密切典型菌株相似度在92.03%～100%?？梢钥闯?獼猴桃根際土壤細(xì)菌具有豐富的類群、物種和遺傳多樣性,并存在潛在的新種或者新屬類群。其中,細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群為Firmicutes門(70株,49.3%),有研究表明,Firmicutes門為土壤的重要免疫細(xì)菌,在保護(hù)植物免受病原菌侵染中具有重要作用[11]。推測(cè)Firmicutes門是獼猴桃預(yù)防潰瘍病的主要類群之一。

通過(guò)牛津杯試驗(yàn),從142株細(xì)菌中篩選出4株有拮抗效果的細(xì)菌(A11、D1h、A4、B15),經(jīng)過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析,確定菌株A11和D1h屬于紅球菌屬,菌株A4屬于芽孢桿菌屬,B15屬于鏈霉菌屬。結(jié)果表明,獼猴桃根際土壤中存在拮抗?jié)儾【奈⑸镱惾?。紅球菌是一種具有良好抗菌效果的革蘭氏陽(yáng)性菌,有研究報(bào)道,該類細(xì)菌能產(chǎn)生新抗生素[12],如Kurosawa等[13]從紅球菌中分離出紅鏈霉素A和紅鏈霉素B(Rhodostreptomycin)對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌有良好的抑制活性;Kitagawa等[14-15]從紅球菌中發(fā)現(xiàn)了一種新型喹啉類抗生素(aurachin)對(duì)表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和痤瘡丙酸桿菌有良好的拮抗效果。芽孢桿菌是一類具有生防潛力的微生物,其可以通過(guò)分泌抗生素、細(xì)胞壁水解酶以及鐵載體等胞外代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出拮抗活性[16-17],杜貞娜等[18-19]報(bào)道了拮抗Psa的芽孢桿菌類群。鏈霉菌能夠分泌多種抗生素,是目前抗生素生產(chǎn)應(yīng)用較廣的一類細(xì)菌[20-21],其分泌的鏈霉素是防治Psa的主要?dú)⒕鷦22],朱云海等[23]在獼猴桃組織中發(fā)現(xiàn)能拮抗Psa的肉桂地鏈霉菌。由此可見(jiàn),筆者篩選的紅球菌(2株)、芽孢桿菌及鏈霉菌可能是生物防治獼猴桃潰瘍病的優(yōu)良菌株,其拮抗機(jī)理有待進(jìn)一步發(fā)掘。

綜上所述,獼猴桃根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌具有豐富的類群、物種和遺傳多樣性,并存在拮抗?jié)儾【奈⑸镱惾?。該研究發(fā)現(xiàn)了拮抗Psa的紅球菌屬細(xì)菌,為獼猴桃潰瘍病生物防治劑的研制積累了種質(zhì)資源。